专利名称：一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码编制方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及ー种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码編制方法及其应用。
背景技术：
猪肉是我国居民消费的最主要肉类产品，我国也是生产和消费猪肉量最大的国家。食品安全近年频发，已成为舆论焦点。建立可靠的猪肉产品溯源系统，实现猪场到餐桌全程双向可追溯，对兽药残留、瘦肉精、重金属滥用等问题猪肉生产的遏制，传染性疾病，特别是人畜共患病传染性疾病的切断及处理，市场消费信心的培育，养猪业的健康发展等，起至关重要的作用。、猪肉产品溯源的技术方法很多，由于技术简单、低成本及实际操作简易，目前大都采用耳标等标签溯源技术，但缺点是标签易丢失、受损、易混淆，易在猪活体、胴体和猪肉产品间分离，且缺乏可信度。DNA溯源技术基于基因组DNA的遗传与变异，目前用于肉产品溯源技术主要是 AFLP、SSR 及 SNP 三种。其中，SNP (single-nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)标记是第三代溯源技木。SNP是指同一物种不同成员间或同一个体的成对染色体在同一基因组DNA位点上出现的单个核苷酸之间的变异。例如，如果来自不同个体的同一基因组位点DNA片段序列分别为AAGCCTA和AAGCTTA，则此段DNA片段序列就存在ー个SNP位点，等位基因为C和T。几乎所有常见的SNP均只有两个等位基因，但就个体而言，其成对染色体可能为不同的等位基因。因此，群体中一个常见的SNP位点通常存在三种基因型。以上述SNP为例，其群体中存在的基因型一般为C/C(个体的两条染色体上的等位基因均为C)、T/T (个体的两条染色体上的等位基因均为T)和T/C (个体的两条染色体上的等位基因分别为C和T)。相对而言，基因编码区比非编码区在进化上存在更大的压力，因此SNP通常出现在非编码区。由于种群的地理隔绝，可导致SNP在不同种群中的频率不同，ー个在某个地理种群或种族中常见的SNP等位基因可能极少出现在另一个种群或种族内。再者，SNP是可遗传的变异中最常见的ー种，具有分布广、密度高的特点，基因组DNA中平均约每lOOObp，甚至高突变区段每200-300bp就存在I个SNP位点，因此，SNP常被开发为DNA指紋，用于动物的个体身份认证，因此研发猪个体身份识别或猪肉产品溯源的SNP条形码及相应的数字条形码意义重大。
发明内容
本发明的目的提供一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码編制方法。本发明的另ー目的在于提供利用该方法編制的条形码。本发明的又一目的是提供该条形码编制方法的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现
一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码編制方法，选择待识别动物或待溯源肉产品的基因组DNA上的高杂合度的SNP位点并组合成SNP条形码，然后用十种阿拉伯数字O 9随机唯一的替代SNP条形码中的10种SNP基因型A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C，形成相应的数字条形码，实现动物个体身份与SNP条形码以
及数字条形码的一一对应。所述的高杂合度SNP位点优选杂合度大于等于O. I的SNP位点。所述的高杂合度SNP位点是根据GenBank登录的待识别动物或待溯源肉产品的基因组DNA序列设计引物，以待识别动物或待溯源肉产品基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物测序，并筛选杂合度大于等于O. I的SNP位点。 所述的动物优选猪，所述的肉产品优选猪肉。所述的猪或猪肉产品的基因组DNA上的高杂合度的SNP位点优选根据GenBank登 录的猪基因组DNA序列设计引物对I 7，以猪基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物测序，并筛选杂合度大于等于O. I的SNP位点；其中所述的引物对I的正向引物为SEQ IDNo. 1，反向引物为SEQ ID No. 2 ;所述的引物对2的正向引物为SEQ ID No. 3，反向引物为SEQ ID No. 4 ;所述的引物对3的正向引物为SEQ ID No. 5，反向引物为SEQ ID No. 6 ;所述的引物对4的正向引物为SEQ ID No. 7，反向引物为SEQ ID No. 8 ;所述的引物对5的正向引物为SEQID No. 9，反向引物为SEQID No. 10 ;所述的引物对6的正向引物为SEQ ID No. 11，反向引物为SEQ ID No. 12 ;所述的引物对7的正向引物为SEQ ID No. 13，反向引物为SEQID No. 14。数字条形码与SNP条形码的对应关系可以是用0、1、2、3、4、5、6、7、8、9依次分别替代 SNP 条形码中的 10 种 SNP 基因型A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C，也可以是其它的随机且唯一的对应编码方式。按照本发明所述的条形码编制方法获得的用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的SNP条形码和/或相应的数字条形码。本发明所述的SNP条形码和/或相应的数字条形码，可应用于但不仅限应用于在家养和/或野生生物个体身份识别和/或家养动物肉产品溯源；优选应用于猪个体身份识别或猪肉产品的溯源。一种猪个体身份识别或猪肉产品溯源方法，包括备份猪样本，待识别猪个体或待溯源的猪肉产品与对应的备份猪样本同时按照本发明所述的方法制作SNP条形码和/或相应的数字条形码并进行比对，从而确认猪个体身份或猪肉产品来源。所述的猪样本优选猪毛发毛囊或组织样或血样。有益效果DNA溯源技术主要包括AFLP、SSR及SNP等多种形式，其中SNP是由基因组DNA单个核苷酸的变异所引起的基因组DNA序列的多态性，动物基因组中平均每IOOObp就存在一个SNP，高变区每200-300bp就存在ー个SNP，因此编制SNP条形码，是ー种有效识别动物个体身份或溯源肉产品的遗传学方法。以猪(共19对染色体)为例，假如ー对引物仅只扩增I个SNP位点，那么针对19条染色体的19对引物扩增的19个SNP位点组成的SNP条形码就可以用于识别11亿头猪(319=1162261467)的个体身份或对其肉产品溯源。实际上，针对高突变区的ー对弓I物可扩增出多个SNP位点，虽然这些SNP位点存在连锁，但由于祖代突变的逐步积累，可扩增多个SNP位点的引物可区分多种基因型组合。以我们已获得的7对引物为例(实施例1)，7对引物扩增的41个SNP位点形成的SNP条形码可用于近500万头猪的个体身份识别或猪肉产品溯源，即9X11X7X20X3X10X 12=4989600头猪(7对引物扩增的且可用于个体身份识别或猪肉产品溯源的SNP位点分别是4、4、3、10、1、6、13个，可以区分的基因型组合分别是9、11、7、20、3、10、12种)。特别提出的是，7对引物中最佳的I对引物的扩增产物可以区分20种基因型组合，如果以此引物计算，生产中只需要4对不同的引物就可以实现8万头猪的个体身份识别或猪肉产品的溯源(204=80000头猪)，完全可以满足规模猪场的猪个体身份识别或猪肉产品的溯源。本发明针对猪不同染色体，特别是染色体上的高突变区段，设计并筛选可有效且特异进行PCR扩增的引物对，优化的引物对I 7所扩增的产物直接测序结果易读(測序色谱图背景干净，序列阅读无歧义)，筛选并获得高杂合度的SNP位点，构建猪个体身份及猪肉产品溯源的条形码，实现猪个体身份识别及猪肉产品溯源。规模猪场或屠宰场可以采集毛发毛囊或组织样或血样，制作猪肉产品条形码，也可以备份所有出售或待屠宰猪样本(毛发毛囊或组织样或血样)，通过对待识别猪个体或待溯源的猪肉产品与备份猪样本分别制作条形码进行比对，可确认猪个体身份或猪肉产品来源。同时，条形码编制方法可以用于种猪的个体身份识别，以用于行政管理部门的种猪(良种)登记档案库建设；也同样可以用于其它家养和野生生物个体身份识别及家养动物肉产品的溯源。
图I引物对I扩增产物直接测序结果中的+171SNP位点(T/C)图2引物对2扩增产物直接测序结果中的+211SNP位点(A/G)
具体实施例方式实施例I江苏省农业科学院六合基地猪场96头猪个体条形码的制作I. I基因组DNA模板制备拨取5月龄左右的猪(共96头猪，为7头种公猪、12头种母猪所生。其中，1_9、10-17、18-24、25-32、33-37、38-46、47-50、51-54、55-66、67-77、78-87、88-96 分别为全同胞)猪毛数根5(含毛囊)，并剪短至I. 5cm,插入装有8. 8 μ I DNA MiniExtract(南京润邦生物技术有限公司)的PCR管中(毛囊端朝下并浸入MiniExtract)，PCR管置PCR仪中95°C 5min，16°C 5min,加入 I. 2 μ I 蛋白酶 K (10mg/ml)，55°C 2hr 或以上，95°C IOmin, 16°C Imin,离心上清作PCR模板。1.2PCR 扩增引物设计分别根据GenBank 中登录号为 AF327369、AF034974、AF473820、X68247、AJ251197,AF038553,M29939的基因设计引物对I 7，详见表I。反应体系(20μI):双蒸水 13. I μ l、25mM Mg2+2. Ομ IUOXBuffer 2. O μ l,5mMdNTP O. 8 μ 1、5 μ M正反向游引物各I. O μ I、Taq酶O. I μ I、基因组DNA模板I. O μ I。反应条件95°C先变性2min ;95°C变性30s，退火(不同引物退火温度不同，见表I)30s，72°C延伸(不同引物延伸时间不同，见表1)，共35个循环；72°C最后延伸IOmin0各引物对退火温度及72°C延伸时间见表I。
各引物退火温度、时间及72°C延伸时间如下表I用于PCR扩增的各引物序列及相应的退火温度和延伸时间
权利要求
1.一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码編制方法，其特征在于选择待识别动物或待溯源肉产品的基因组DNA上的高杂合度SNP位点并组合成SNP条形码，然后用十种阿拉伯数字O 9随机唯一的替代SNP条形码中的10种SNP基因型A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C，形成相应的数字条形码，实现动物个体身份与条形码的——对应。
2.根据权利要求I所述的条形码编制方法，其特征在于所述的高杂合度SNP位点为杂合度大于等于O. I的SNP位点。
3.根据权利要求2所述的条形码编制方法，其特征在于所述的高杂合度SNP位点是根据GenBank登录的待识别动物或待溯源肉产品的基因组DNA序列设计引物，以待识别动物或待溯源肉产品的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物测序，并筛选杂合度大于等于O. I的SNP位点。
4.根据权利要求I 3中任意一项所述的条形码編制方法，其特征在于所述的动物为猪，所述的肉产品为猪肉。
5.根据权利要求4所述的条形码编制方法，其特征在于所述的高杂合度的SNP位点是根据GenBank登录的猪基因组DNA序列设计引物对I 7，以猪基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物测序，并筛选杂合度大于等于O. I的SNP位点；其中所述的引物对I的正向引物为SEQ ID No. 1，反向引物为SEQ ID No. 2 ;所述的引物对2的正向引物为SEQ ID No. 3，反向引物为SEQ ID No. 4;所述的引物对3的正向引物为SEQ ID No. 5，反向引物为SEQ IDNo. 6 ;所述的引物对4的正向引物为SEQ ID No. 7，反向引物为SEQ ID No. 8 ;所述的引物对5的正向引物为SEQ ID No. 9，反向引物为SEQ ID No. 10 ;所述的引物对6的正向引物为SEQ ID No. 11，反向引物为SEQ ID No. 12 ;所述的引物对7的正向引物为SEQ ID No. 13，反向引物为SEQ ID No. 14。
6.根据权利要求I所述的条形码编制方法，其特征在于分别用0、1、2、3、4、5、6、7、8、9依次替代 SNP 条形码中的 10 种 SNP 基因型A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C0
7.按照权利要求I或5所述的条形码编制方法获得的SNP条形码和/或相应的数字条形码。
8.权利要求7所述的SNP条形码和/或相应的数字条形码在家养和/或野生生物个体身份识别和/或家养动物肉产品溯源中的应用；优选在猪个体身份识别和/或猪肉产品溯源中的应用。
9.一种猪个体身份识别或猪肉产品溯源方法，其特征在于包括备份猪样本，待识别猪个体或待溯源的猪肉产品与对应的备份猪样本同时按照权利要求5所述的方法制作SNP条形码和/或相应的数字条形码并进行比对，从而确认猪个体身份或猪肉产品来源。
10.根据权利要求9所述的猪个体身份识别或猪肉产品溯源方法，其特征在于所述的猪样本为猪毛发毛囊或组织样本或血样。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码编制方法及其应用。一种用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的条形码编制方法，选择待识别动物或待溯源肉产品基因组DNA上的高杂合度的SNP位点并组合成SNP条形码，然后用十种阿拉伯数字0～9随机唯一的替代SNP条形码中的10种SNP基因型A/A、T/T、G/G、C/C、A/T、A/G、A/C、T/G、T/C、G/C，形成相应的数字条形码，实现动物个体身份与条形码的一一对应。本发明通过设计PCR引物，获得高杂合度的SNP位点，编制用于动物个体身份识别和/或肉产品溯源的SNP条形码及/或相应的数字条形码，实现动物个体身份识别或肉产品溯源。
文档编号G06K19/06GK102682322SQ20121013723
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者施振旦, 朱振坤, 王晓晓, 胡肄农, 赵庆顺, 邢光东, 顾洪如 申请人:江苏省农业科学院