本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种估算菜用大豆叶片叶绿素a/b比值的方法。
背景技术：
叶绿体中的色素包括两大类：叶绿素和类胡萝卜素，叶绿素又包括叶绿素a和叶绿素b，大部分的叶绿素a和全部叶绿素b具有吸收和传递光能的作用。叶绿素a和b的含量的比值叶绿素a/b的大小说明了植物利用光能力的大小。现有技术中，缺少便捷，高效的手段进行测量。
技术实现要素：
本发明提供一种能够高效，简便估算菜用大豆叶片叶绿素a/b比值的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种估算菜用大豆叶片叶绿素a/b比值的方法，包括：
获取待检测叶片的14个参数值：实际光合效率y(ii)值x1、非光化学淬灭系数npq值x2、非调节性能量耗散的量子产量y(no)值x3、调节性能量耗散的量子产量y(npq)值x4、暗适应样品的最大荧光fm值x5、psⅱ的最大光合效率fv/fm值x6、花青素反射指数ari1值x7、花青素反射指数ari2值x8、类胡萝卜素反射指数cri1值x9、类胡萝卜素反射指数cri2值x10、结构不敏感性色素指数sipi值x11、植被衰老反射率指数psri值x12、光化学植被指数pri值x13以及水分指数wbi值x14；
将所述14个参数值带入到叶绿素a/b的估算模型中，得到菜用大豆叶片的叶绿素a和叶绿素b含量的比值d；
其中，所述叶绿素a/b的估算模型为：
d＝0.8011+39.5511x1-44.7684x3-63.72914x4+183.1535x5+0.0050x7+1.3644x8-1166.7630x9-4.4457x10-1565.6413x11+1327.3959x12-8.6266x13+10.0173x16-62.2625x17+6.4642x18；
叶绿素a/b比值指的是叶绿素a和叶绿素b的含量的比值。
进一步地，采用叶绿素荧光分析仪测定所述y(ii)值、所述npq值、所述y(no)值、所述y(npq)值、所述fm值以及所述fv/fm值；
采用光谱仪测定所述ari1值、所述ari2值、所述cri1值、所述cri2值、所述sipi值、所述psri值、所述pri值以及所述wbi值。
进一步地，在测量所述14个参数值时，采集5片或者5片以上数量的活体叶片作为待检测叶片就行测量，而后取对应参数的平均值作为其测量值。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本申请实施例中提供的估算菜用大豆叶片叶绿素a/b比值的方法，通过测定活体叶片的叶绿素荧光参数以及光谱指数对菜用大豆菜用大豆叶片的叶绿素a/b进行估算，其中叶绿素荧光参数能够显示植物光合作用机理和光合生理状况的变量或常数值，反映了植物内部情况，同时，本发明测定叶绿素荧光参数以及光谱指数不会伤害到生物体，即对活体植株就能够测定上述14个参数，方法简便快捷；值得说明的是，通过植被光谱特征，可以得到植被指数，这些植被指数分别对植被的色素含量等非常敏感，类胡萝卜素含量较低，且生理变化比叶绿素复杂，导致类胡萝卜素估测模型的精度相对较低，而叶绿素a、叶绿素b与叶绿素(a+b)关系密切，且变化趋势一致，可以使用统一参数表达与三者的关系，这也为估算模型的建立提供了便利。
具体实施方式
本申请实施例通过提供一种能够高效，简便估算菜用大豆叶片叶绿素a/b比值的方法。
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细说明，应当理解本发明实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案的详细的说明，而不是对本申请技术方案的限定，在不冲突的情况下，本申请实施例以及实施例中的技术特征可以相互组合。
一种估算菜用大豆叶片叶绿素a/b比值的方法，包括：
获取待检测叶片的14个参数值：实际光合效率y(ii)值x1、非光化学淬灭系数npq值x2、非调节性能量耗散的量子产量y(no)值x3、调节性能量耗散的量子产量y(npq)值x4、暗适应样品的最大荧光fm值x5、psⅱ的最大光合效率fv/fm值x6、花青素反射指数ari1值x7、花青素反射指数ari2值x8、类胡萝卜素反射指数cri1值x9、类胡萝卜素反射指数cri2值x10、结构不敏感性色素指数sipi值x11、植被衰老反射率指数psri值x12、光化学植被指数pri值x13以及水分指数wbi值x14；
将所述14个参数值带入到叶绿素a/b的估算模型中，得到菜用大豆叶片的叶绿素a和叶绿素b含量的比值d；
叶绿素a/b比值指的是叶绿素a和叶绿素b的含量的比值其中，所述叶绿素a/b的估算模型为：
d＝0.8011+39.5511x1-44.7684x3-63.72914x4+183.1535x5+0.0050x7+1.3644x8-1166.7630x9-4.4457x10-1565.6413x11+1327.3959x12-8.6266x13+10.0173x16-62.2625x17+6.4642x18。
一般来说，采用叶绿素荧光分析仪测定所述y(ii)值、所述npq值、所述y(no)值、所述y(npq)值、所述fm值以及所述fv/fm值；
采用光谱仪测定所述ari1值、所述ari2值、所述cri1值、所述cri2值、所述sipi值、所述psri值、所述pri值以及所述wbi值。
为了降低偶然误差，在测量所述14个参数值时，采集5片或者5片以上数量的活体叶片作为待检测叶片就行测量，而后取对应参数的平均值作为其测量值。
值得说明的是，针对不同的检测对象，估算模型可进行参数优化，以便于提升叶绿素a/b的估算模型的可靠性。
具体来说，通过采样检测试验对估算模型进行优化。
采样检测，采用紫外可见分光光度计测定色素含量，并具体包括：
将待检测的定量叶片放入混合提取液中，在黑暗环境下浸泡，直至叶片完全变为白色为止，得到色素浸提液；
以混合提取液作为对照，取色素浸提液分别在440nm、645nm和663nm波长下于紫外可见分光光度计上测定吸光度a值，采用紫外可见分光光度计测定叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量。
随机选取菜用大豆5个植株的叶片测量的平均值作为叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量。
而后，将采样测量结果作为目标参数，以对活体叶片通过叶绿素荧光分析仪测定的实际光合效率y(ii)值x1、非光化学淬灭系数npq值x2、非调节性能量耗散的量子产量y(no)值x3、调节性能量耗散的量子产量y(npq)值x4、暗适应样品的最大荧光fm值x5、psⅱ的最大光合效率fv/fm值x6、花青素反射指数ari1值x7、花青素反射指数ari2值x8、类胡萝卜素反射指数cri1值x9、类胡萝卜素反射指数cri2值x10、结构不敏感性色素指数sipi值x11、植被衰老反射率指数psri值x12、光化学植被指数pri值x13以及水分指数wbi值x14共14个参数作为自变量，分别以chla、chlb、car、chl(a+b)、car+chl(a+b)、car/chl(a+b)、chla/b为因变量，分别构建回归方程，对各参数的系数进行优化，是其面对不同植株的情况下，均具备可靠性。
当然，上述14个参数的种类和数量也可通过回归方程进行优化更新，主要原则为：回归筛选出与因变量有显著效应的自变量为估算模型参数。
下面将以菜用大豆植株为例进行回归方程的参数种类和系数优化更新的说明。
本发明实施例提供的待检测的菜用大豆品种为m-3，该菜用大豆植株播种于穴盘中，其中，按照体积比，蛭石：珍珠岩＝2:1，待种子发芽至两叶一心状态时，将幼苗转移至hoagland营养液中，每周更换两次营养液，培养温度为16h/8h，day/night，28/22℃，相对湿度为70％-80％。
而后，采用叶绿素荧光分析仪测定每个处理随机选取5个菜用大豆植株的活体叶片。用多通道连续监测荧光仪monitoring-pam(德国walz公司)通道一端的夹子固定叶片的正中部，取5个菜用大豆植株的叶片测量的平均值作为y(ii)、qp、npq、y(no)、y(npq)、fo、fm、fv/fm的测定值。
对叶片进行植物反射光谱参数的测定与叶绿素荧光参数测定同步进行，采用光谱仪ci-710测定所述叶片的ari1、ari2、cri1、cri2、sipi、fri、ndvi、psri、pri、wbi、cari、ci、npci、ccri，分别测定5个叶片(与叶绿素荧光分析仪选取的叶片均相同)，取5个测量平均值作为该叶片的反射光谱参数值。
具体地，采用紫外可见分光光度计测定色素含量的方法包括：
将待检测的菜用大豆植株的叶片0.1g左右，放入10ml混合提取液中(无水乙醇：丙酮＝5:5)，在黑暗环境下浸泡，直至叶片完全变为白色为止，得到色素浸提液；
以混合提取液作为对照，取色素浸提液分别在440nm、645nm和663nm波长下于紫外可见分光光度计上测定吸光度a值，采用紫外可见分光光度计测定叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量。
随机选取菜用大豆5个植株的叶片测量的平均值作为叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量。
一般来说，待检测的菜用大豆植株处于重金属胁迫后的7day、14day、21day。
本发明实施例可以采用叶绿素荧光仪测定的植物荧光参数、光谱指数与其他参数一同确定最优回归方程，具体方法包括：
对活体叶片通过叶绿素荧光分析仪测定x1：y(ii)、x2：qp、x3：npq、x4：y(no)、x5：y(npq)、x6：fo、x7：fm、x8：fv/fm、x9：ari1、x10：ari2、x11：cri1、x12：cri2、x13：sipi、x14：fri、x15：ndvi、x16：psri、x17：pri、x18：wbi、x19：cari、x20：ci、x21：npci、x22：ccri共22个参数，将这22个参数作为自变量，分别以chla、chlb、car、chl(a+b)、car+chl(a+b)、car/chl(a+b)、chla/b为因变量，分别构建回归方程，如下表所示。
其中，chla代表叶绿素a含量，chla代表叶绿素b含量，chl(a+b)代表叶绿素a和叶绿素b含量的总和，car代表类胡萝卜素含量，chla/b代表叶绿素a与叶绿素b含量的比值。z1：y(ii)、z2：qp、z3：npq、z4：y(no)、z5：y(npq)、z6：fo、z7：fm、z8：fv/fm、z9：ari1、z10：ari2、z11：cri1、z12：cri2、z13：sipi、z14：fri、z15：ndvi、z16：psri、z17：pri、z18：wbi、z19：cari、z20：ci、z21：npci、z22：ccri
构建回归方程的具体步骤：
以22个参数为自变量，因变量叶绿素a/b，进行逐步回归分析，根据未引入变量f值的大小，选择剔除变量还是引入变量，引入显著变量结束后，即得到回归方程。当然可将回归操作过程在辅助软件平台进行，如dps7.05。
由下表可以看出以chla/b为因变量得到的回归方程决定系数最高，剩余通径系数最低，故可以用以chla/b为因变量时得到的回归方程最佳，经逐步回归筛选出与因变量有显著效应的14个自变量，这14个自变量分别为：y(ii)、npq、y(no)、y(npq)、fm、fv/fm、ari1、ari2、cri1、cri2、sipi、psri、pri、wbi，建立叶绿素a/b的估算值的最优回归方程，构成估算模型：
d＝0.8011+39.5511x1-44.7684x2-63.72914x3+183.1535x4+0.0050x5+1.3644x6-1166.7630x7-4.4457x8-1565.6413x9+1327.3959x10-8.6266x11+10.0173x12-62.2625x13+6.4642x14，计算出叶绿素a/b的估算值d。
方程的相关系数r＝1，f值＝12540.1568，p值＝0.007，剩余标准差s＝0.0027，调整后的相关系数ra＝1，差异极显著，决定系数r2＝0.99999，剩余通径系数＝0.00239，同时，为了检验这14个参数在这22个参数中的代表性及其相对重要性，进行了通径分析，分析结果表明14个性状对叶绿素a/b比值综合评价值的相对重要性依次为：cri1＞ari1＞pri＞npq＞ari2＞y(no)＞sipi＞fv/fm＞psri＞y(ii)＞fm＞y(npq)＞wbi＞cri2。
其中，x1：实际光合效率y(ii)，即某一光照强度下的实际光合效率，表示psⅱ反应中心在有部分关闭的情况下实际的原初光化学效率，能反应菜用大豆叶片在光照中用于电子传递的能量占吸收光能的份额；
x2：非光化学淬灭系数npq，npq是过量光能的有效探针，是高等植物在捕获激发能过剩的情况下，可以以npq的方式将过剩的激发能耗散掉，从而保护光合结构遭到破坏；
x3：非调节性能量耗散的量子产量y(no)，y(no)高，则表明光化学能量转换和保护性的调节机制(如热耗散)不足以将植物吸收的光能完全消耗掉。即入射光强超过了植物能接受的程度，这时植物可能已经受到损伤，或者(尽管还未受到损伤)继续照光的话植物将要受到损伤，是光损伤的重要指标；
x4：调节性能量耗散的量子产量y(npq)，y(npq)一方面表明植物接受的光强过剩，另一方面说明植物仍可以通过调节(如将过剩光能耗散为热)来保护自身，是光保护的重要指标；
x5：暗适应样品的最大荧光fm，当光系统ii的所有反应中心均处于关闭状态时得到的；x6:psⅱ的最大光合效率fv/fm，表示光合机构把吸收的光能用于化学反应的最大效率，非胁迫条件下该参数的变化极小，不受物种和生长条件的影响，在胁迫条件下该参数明显下降；
x7：花青素反射指数ari1，ari1对叶片中的花青素非常敏感；
x8：花青素反射指数ari2，ari2对叶片中的花青素非常敏感，ari2是ari1的改进，当花青素浓度高时更加有效；
x9：类胡萝卜素反射指数cri1，cri1对叶片中的类胡萝卜素非常敏感，高的cri1值意味类胡萝卜素含量相比叶绿素含量多；
x10：类胡萝卜素反射指数cri2，cri2是cri1的改进型，在类胡萝卜素浓度高时更加有效，高的cri2值意味类胡萝卜素含量相比叶绿素含量多；
x11：结构不敏感性色素指数sipi，表示类胡萝卜素与叶绿素a的比率；
x12：植被衰老反射率指数psri，psri用来最大限度地提高类胡萝卜素与叶绿素比率的灵敏度，psri的增加预示植被衰老的开始和植物果实的成熟，可用于植被健康监测、植物生理胁迫性检测和作物生产和产量分析；
x13：光化学植被指数pri，pri对活体植物的类胡萝卜素变化非常敏感，类胡萝卜素可标识光合作用光的利用率，可用于研究植被生产力和胁迫性，以及农作物的衰老；
x14：水分指数wbi，水分含量是一个重要的植物指标，可以了解植物体内的水分状况，当叶片的水势降低到临界值时，这表明植物的水分不足，需要灌水。凡是能影响到植株光合作用或者光合机构的因素都能直接或者间接影响到植物的光合产物，并最终影响到植株叶片的色素含量。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本申请实施例中提供的估算菜用大豆叶片叶绿素a/b比值的方法，通过测定活体叶片的叶绿素荧光参数以及光谱指数对菜用大豆菜用大豆叶片的叶绿素a/b进行估算，其中叶绿素荧光参数能够显示植物光合作用机理和光合生理状况的变量或常数值，反映了植物内部情况，同时，本发明测定叶绿素荧光参数以及光谱指数不会伤害到生物体，即对活体植株就能够测定上述14个参数，方法简便快捷；值得说明的是，通过植被光谱特征，可以得到植被指数，这些植被指数分别对植被的色素含量等非常敏感，类胡萝卜素含量较低，且生理变化比叶绿素复杂，导致类胡萝卜素估测模型的精度相对较低，而叶绿素a、叶绿素b与叶绿素(a+b)关系密切，且变化趋势一致，可以使用统一参数表达与三者的关系，这也为估算模型的建立提供了便利。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。