续变量之间的化arson相关系数。我们基于在IVF治疗前（pre-IVF)、卵母细胞采集前 (pre-OR)、和胚胎移植后（post-IV巧的S个不同时间点可获得的数据生成S个模型。我们 通过利用MART?i的R-软件实现梯度提升器（GBM)根据其相对影响来分级变量，然后W 化art软件利用最高级的变量构建回归树模型，来生成每个模型。MAKT?;是用于识别预 测结果的变量的交互结构的可靠方法。MART?中交叉验证、参数选择提升和模型评价的 使用还保留了简洁性并避免过度拟合。在构建mart?树时，将全数据集分为10个亚组来 实现对模型评价的10倍交叉验证。同样的10倍交叉验证重复1000次W进行可靠预测率 估计和识别具有最高预测率的树模型。尽管MART?从高度交互变量大组选择非冗余预后 变量是强有力的。
[0180]用于辅助生殖技术（ART)的治疗方案
[0181] 我们分析的IVF周期大多数是对具有差的卵巢储备、严重的男性因素不育、输卵 管性不育、排卵障碍或原因不明的病因学的患者进行。一般，每个治疗周期中使用=种刺激 方案之一：下调黄体（长）方案用于大多数患者，微小剂量lupron(短）方案和括抗剂方 案主要用于推测具有卵巢储备下降或此前具有失败IVF周期历史的患者。长方案由W下构 成：利用0. 5mg醋酸亮丙瑞林下调黄体，醋酸亮丙瑞林随着刺激减少到0. 25mg。在短方案 中，口服避孕药2-4周后开始微小剂量lupron(0.04mgS.C.bid)。在括抗剂方案中，当前 滤泡（leadfollicle)大小达到14mm时开始GnRH括抗剂。在所有S种方案中，进行基线 超声检测W证明卵巢中不存在> 1.5cm的囊肿。当满足基线标准时，开始利用重组F甜与 人类更年期促性腺素的促性腺素治疗。通常利用每天给药每天共150-600lU实现刺激W使卵泡募集最大化。在周期第7天开始，然后如所示地每1-3天进行卵泡生长的超声监测。 如所需地监测血清雌二醇水平。
[0182] 当至少两个卵泡达到> 17mm的平均直径时施用10, 000IU人类绒毛膜促性腺素的 剂量。经阴道W超声引导的卵母细胞采集在hCG施用后34-36小时W标准方式进行，并伴 有监测的麻醉护理。
[0183]卵母细胞受精和胚胎培养
[0184] 卵母细胞在受精前成组培养在矿物油下大约125y1SageCleavage Medium(CooperSurgical,Inc,Trumbull,CT)液滴（含有 10 %血清蛋白替代物（SPS， IrvineScientific，SantaAna，CA))中。预定常规IVF的卵母细胞5个1组培养，预定胞 质内精子注射（ICSI)的卵母细胞在剥离卵丘细胞后达20个1组培养。如果精液分析正常 且预计受精是正常的，W精子对卵母细胞授精。卵母细胞通常在采集后4-6小时授精。如果 精液分析异常或预计受精差，则使用ICSI对卵母细胞注射精子。受精的卵母细胞达20个1 组地在矿物油下大约 125ylSageCleavageMedium(CooperSurgical,Inc,Trumbull,CT) 液滴（含有10%SP巧中在37°C、5%02、5%C02和90%N2的潮湿环境中培养。授精或ICSI 后16~18小时进行受精检查。具有透明的两个前核的合子在SageCleavageMedium(含 有10%SP巧中培养另外48小时。具有单个前核（IPN)或=个或更多前核的卵母细胞认 为是异常受精的。如果指示第5天胚泡移植，在移植前在如inn'SAdvantage胚泡培养基 (CooperSurgical)(含有10%SP巧中进行延长的胚胎培养48小时。注意，在研究时间阶 段期间使用相同培养基。
[0185] 胚胎的分裂和分级
[0186] 在采集后第3天、收集卵母细胞后68至72小时，单独一组有经验的胚胎学家评 价胚胎。检查胚胎的分裂（细胞数目）和等级，包括胞浆碎裂。胚胎在第3天如下分级： 1级，分裂球具有同样大小，没有胞浆碎裂；2级，分裂球具有同样大小，有较少胞浆碎裂， 牵设< 10 %的胚胎；3级，分裂球具有不同大小，碎裂牵设10-20 %的胚胎；4级，分裂球 具有相同或不同大小，中度到严重的胞浆碎裂，牵设20-50 %的胚胎；和5级，分裂球少， 严重的碎裂，牵设>50%的胚胎（Veeck等人，（1999)AnAtlasofHumanGametesand Concep1:uses.化w化rk:Pa;rthenon化Wishing. 47-50)。注意，基于碎片大小、其在胚胎中 的位置、不存在细胞核，胚胎中胞浆碎裂容易与分裂区分。相反，卵母细胞的胞浆碎裂不被 包括作为变量，因为其是尤其罕见的。我们的胚胎学家在第3天例行地注意到紧密性的存 在或不存在。因为在< 10%的胚胎观察到紧密性，我们在分析中未包括运一变量。
[0187] 辅助解化
[018引我们的中屯、中，辅助解化（AH)的适应症是高龄母亲、F甜水平升高、和/或辅助生 殖周期多次失败的历史。在胚胎移植日，将用于解化的胚胎放置在含有10%SPS的憐酸缓 冲盐水（PBS)中。AH通过利用ZILOS-tk激光（HamiltonHiorneBiosciences，Beverly, MA)在分裂球之间的透明带区域中产生桐而实现。然后洗涂胚胎并放回培养基直到移植。
[0189] 胚胎移植和低溫胆藏
[0190] 超声引导的胚胎移植利用Tefcat或EchotipSoftpass导管（CookOb/Gyn， Spencer,IN)进行。对所有患者进行W阴道栓剂的黄体酬补充。对于在第3天具有胚胎移 植的患者，将具有多于五个分裂球的任何剩余胚胎放置在延长培养中另外2或3天。在第 5天或第6天将具有良好内细胞质和滋养外胚层的任何扩大中的、已扩大和解化的胚泡冷 冻。此外，对多余胚胎、严重的卵巢过度刺激综合征和因为医学或社会原因的生育力保存 进行低溫胆藏。如果其质量不足W低溫胆藏或如果患者出于非医学原因未选择胚胎低溫胆 藏，通常丢弃未移植的多余胚胎。在植入前遗传诊断的情况，还丢弃检验为遗传疾病阳性或 非整倍性的胚胎。
[0191] 临床结果
[0192] 在胚胎移植后8-10天获得血清定量P-hCG水平，并连续进行直到通过经阴道超 声，妊娠囊的存在而进行临床妊娠的诊断。临床妊娠W外的结果包括：1)无妊娠，如果血 清定量P-hCG是阴性；2)生化妊娠，定义为在经阴道超声观察到妊娠囊之前减少的血清定 量P-hCG水平；3)自发性流产，定义为在经阴道超声观察到妊娠囊之后的流产；和4)宫外 孕；W及5)其它异常妊娠诸如妊娠性滋养层疾病。活产结果通过作为常规临床护理的一部 分的随访患者而获得，但不在本研究中使用。
[0193] 回归树
[0194] 临床IVF数据，尤其当考虑卵母细胞和胚胎参数时，通常不适合于由多变量逻辑 回归进行有意义的分析。许多相关变量的高程度相互作用和多重共线性干扰常规的多变量 回归。在运些情况中，回归和分类树模型（CART)已广泛用于临床研究（FonarowGC，Jama 293:572-580(2005);FriedmanJ(1999)Greedyfunctionapproximation：Astochastic boostingmachine(贪婪函数近似：随机提升机）.TechnicalR巧ort，D巧artment ofStatistics，StanfordUniversity；FriedmanJ(1999)Stochasticgradient boosting(随机梯度提升）.TechnicalReport,DepartmentofStatistics,Stanford UniversityiRrie血anJ(2002)I'utorial:GettingstartedwithMARTinR(指南：开始 R的MART).DepartmentofStatistics，StanfordUniversity;Friedman等人，StatMed 22:1365-1381 (2003);Guzick等人，N化glJMed：M5:1388-1393 (2001);Pilote等人，N 化glJMed335:1198-1205(1996))。在本文，我们使用多重累计回归树（ )，运 是一种更强有力的统计方法，组合了 "提升"与CART来"提升"或增加CART方法准确度W识别非冗余预后变量。
[019引一般，回归树具有多种关键益处：1)能够考虑所有类型的临床IVF和胚胎学数据， 包括数字变量、顺序变量、二元变量和分类变量；2)能够充分基于"替代品"分裂技术操纵 缺失值而不需要归咎；3)能够产生对单调数据转化不变的结果，因此消除检验数据转化或 度量的不同方法的需要；4)能够生成不受极端值影响的树；5)能够生成本身探测和识别变 量相互作用的树，否则变量相互作用将需要在多重逻辑回归中明确指出。最重要地，回归树 能够考虑大量的变量，包括可能证实是不相关的变量，即使只有小数目的变量对结果有显 著的统计影响。考虑许多变量的运一能力对于IVF结果分析是关键的，因为许多变量，诸如 8-细胞胚胎百分比、8细胞胚胎数、移植的8细胞胚胎百分比、和移植的8细胞胚胎数，可能 是高度交互的；因此，随意选择其中之一可能损害数据的完整性而引入偏倚，而包括其所有 可能导致常规的多变量回归崩溃。
[0196] 了獲的结果可能帮助识别能够W多变量逻辑回归再分析的变量。通常，它们 可识别阔值或"截止（cut-offs)"，所述阔值或"截止"将用于产生分类变量W将情形分类 为亚组，用于由常规方法诸如t-检验、卡方分析或Wilcoxon秩和检验进行进一步组内特征 比较。例如，CART分析由Guzick等人使用来基于精子浓度、活动性和形态学的阔值将男性 分类为低生育力的、不确定生育力状态或有生育力的，例示了运一策略在不育研究中的效 力（Guzick等人，N化glJMed345:1388-1393(2001))。
[0197] 胚胎培养
[0198] 对3-5周大的野生型Fl(C57BL6xDBA/2)雌性（Charles化ver)通过腹膜内注 射5IU怀孕母驴的血清促性腺素（Sigma)、然后48小时后注射5IU人类绒毛膜促性腺 素（Sigma)来使排卵过度，并与野生型雄性交配过夜。在hCG注射后17小时通过颈脱位 法处死小鼠，从输卵管释出1-细胞胚胎。通过透明质酸酶（Sigma)治疗和吸取去除卵丘 细胞。从3-6个雌性回收处于两个前核阶段的植入前胚胎，汇集在M2培养基（化emicon International)中，然后立即细胞质微注射，并在37°C在混合气体（90%氮气、5%氧气、 5%二氧化碳；Praxair)下培养在矿物油（Sigma)下的补充10%血清的人类输卵管液 (In-Vitro!^edilization，Inc.)微滴中，并W每20yL滴十个胚胎培养。
[0199] 微注射反义吗嘟代寡核巧酸
[0200] 特异性地祀向5'UTR或翻译起始位点的25-nt反义吗嘟代寡核巧酸（M0)或在5nt 错配的对照购自GeneTools,化C.(参见表1的序列详情）。我们确定0. 6-0. 75mM是允许 胚泡发育正常速率的最大浓度（数据未显示）。因此，除非另外指明，否则在装备有液压显 微操作系统（IM300Mic;roinjecto;r，Na;rishige，Japan)的倒置显微镜（Olympus1X70)上向 每个胚胎的细胞质注射5-lOpL0. 75mMCcna2-M0(对于0ct4-M0,0. 60mM)。每个实验中使 用10个未注射的对照胚胎，每个实验进行至少=次。计算进展到每个发育阶段或在每个发 育阶段停滞的胚胎的平均百分比和平均值的标准误差（平均值+S.e.m.)，统计显著性通 过利用2-尾Studentt-检验计算p-值来确定。
[0201] 表1 :祀向5'UTR和/或起始位点中基因-特异性序列的反义吗嘟代寡核巧酸
[0202]
[0203]
[0204] 免疫印迹和免疫细胞化学
[0205] 在2-细胞期（施用人类绒毛膜促性腺素化CG)后43小时）收集注射的胚胎和对 照胚胎并在包含3mg/mL聚乙締化咯烧酬（PV巧的PBS中洗涂。对于免疫印迹，将注射的 胚胎和对照胚胎在包含憐酸酶抑制剂混合物（Roche)的RIPA缓冲液巧OmMTris-HCl、pH 7. 5、150mMNaClUmMEDTA、l%NonidentP-40、2mg/mlap;rotonin、2mg/ml亮抑酶肤、Img/ mlpepstain和20mg/ml苯甲基横酷）中裂解，在Laemli缓冲液中煮沸，储存在-80°C直 到从每种情况收集来自75个胚胎的裂解液。将样品上样并由在10%化is-HCl聚丙締酷 胺凝胶上电泳而分析，半干转移到硝酸纤维素膜度io-Rad)上，在0. 1%吐溫-20-1%酪蛋 白TBS封闭溶液度io-Rad)中封闭，在4°C在1 : 250稀释的第一兔多克隆抗细胞周期蛋 白A2抗体（SantaCruzBiotechnologies,SC-751)中培养过夜，在室溫在1 : 2000稀释 的第二驴抗兔辣根过氧化物酶-连接的抗体（Amersham，NA934V)中培养一小时，利用E化 印迹检测试剂（Amersham)显现。免疫细胞化学按照标准方案进行。简单地说，将胚胎在 4%低聚甲醒-PBS溶液中固定，在0. 1%TritonX-PBS中使之通透化，在RT用Image口FX Si即alEnhancersolution(Invitrogen)处理，在4°C在1 : 100稀释的第一抗体中培养 过夜，在1 : 10, 000稀释的第二抗体中培养一小时，然后在3yMDAPI中培养lOmin.，在 Vecta化ield封固剂（VectorL油oratories,H-1000)中封固。对照W正常兔或小鼠血清对 照平行进行。所有抗体在1 %BSA中稀释。由共聚焦显微镜术利用LSM510共聚焦激光扫描 显微镜或表面巧光显微镜术或装备有Axiocam数码相机狂eiss)的Axiov&rt200显微镜 利用固定的参数和曝光时间对胚胎成像。第一抗体购自Santa化UZBiotechnologies(抗 细胞周期蛋白A2兔多克隆（SC-751)、正常兔IgG(sc-2027)、小鼠单克隆抗0ct4(sc-5279) 和正常小鼠IgG(SC-2025)。第二抗体购自MolecularProbes(AlexaFluor594 山羊抗兔 IgG(A-11012)和山羊抗小鼠IgG(A-llOOl)。
[0206] 由体外转录合成mRNA.
[0207]对全长小鼠cDNA克隆 0ct4-pSP0RT(克隆ID30019896)(OpenBiosystems)和编 码巧光有丝分裂生物传感器：修饰的增强的黄色巧光蛋白（mEYFP)的质粒进行序列验证， 通过限制性酶消化来线性化，并用作模板。体外转录5'加帽和多聚腺巧酸的mRNA转录物 (mMessageandPolyA-Tail试剂盒，Ambion)，然后由UV分光光谱定量，由电泳分析来证实 大小。
[020引用于基因忍片实验的RNA样品制备
[0209]经3滴PBS/PVP洗涂包含20种汇集的注射的或对照小鼠胚胎的样品，为了总RNA提取和分离（Picopure总RNA分离试剂盒，MolecularDevicesCo;rp.)而收集，产 生10yL总RNA。根据制造商的说明书对5yL总RNA或10个小鼠胚胎的等价物进行两 轮扩增（WT-〇vationPicosystem,Nugen)。在Bioanalyzer2100 (Agilent)上检验第二 轮扩增获得的ssDNA的质量，由ND-1000 UV分光光度计（Nano化opTechnologies)定量 每个样品5-8lig的典型产量。进行直接的生物素标记和碎裂（Fレ0vationcDNABiotin Module(Nugen)。将碎裂的、标记的ssDNA样品提交到StanfordUniversityPANCore FacilityW与GeneCllip"^小鼠基因组430 2.0阵列（Affymetrix)杂交，并激光扫描。
[0210] 用于基因忍片实验的统计分析
[0211] 来自共12个基因忍片（3个Ccna2-M0和其未注射的对照、W及3个0ct4-M0 和其未注射的对照）的原始数据由dChip化iC&WongWH(2003)在llieanalysisof geneexpressiondata:methodsandsoftware(基因表达数据的分析：方法和软 件）.（Springer,NewYork)，PP. 120-141中）标准化。对具有W下的基因进行无监督聚 类分析：1)在至少10%样品中表达水平大于500的信号强度（SI) ;2)样品之间标准偏差 与平均值的比值>0.4且< 1000。随后的分析不限于运些标准。差异表达的基因的列 表和其分级由化hnson和Wong提供的方法产生，该方法基于倍变、对数倍变和未配对的 t-统计量（NicholasJohnson和W.比W(2007)Combiningscientificandstatistical significanceingeneranking(在基因分级时组合科学显著性与统计显著性）.未出 版.）。差异表达由从样品之间300个随机排列估计的5%中值假发现率（抑时的阔值 来限定。为了发现显著地富集的基因本体论（GO)条件（AshburnerM，等人（2000)Gene ontology:toolfortheunificationofbiology(基因本体论：统一生物学的工具）.化6 GeneOntologyConsortium.化tGenet25,25-29)，将每个基因列表对Elntrez基因识 别号（NCBI)绘图，并由G0STATPACKAGE度eissbarthI'&SpeedTP(2004)G0stat:find statisticallyoverrepresentedGeneOntologieswithinagroupofgenes(GOstat： 发现一组基因中统计上过度代表的基因本体）.Bioin化rmatics20,1464-1465)针对一组 "通用"基因检验，"通用"基因是由（MAS,Affymetrix)在3种处理样品中至少2种或6种对 照样品中4种中的"P"值限定的。为了估计抑R，W从"通用"基因组中随机产生的基因列 表进行50次检验，计算富集的GO条件的平均数（Ashburner等人；Beissbarth等人）。选 择P-值的截止W反映~10%的抑R。具有可能的〇ct4结合位点的差异表达的基因通过与 Zhou等人此前鉴定的推定的0ct4-调苄基因狂houQ，Qiippe;rfieldH，MeltonDA，&Wong WH(2007)Ageneregulatorynetworkinmouseembryonicstemcells(小鼠胚胎干细胞 中的基因调节网络）.化ocNatlAcadSciUSA104,16438-16443)比较而鉴定，随后利用 BIOCONDUCTORANNOTPACKAGE化C.GentlemanVJC，D.M.Bates,B.Bolstad，EDettling， S.Dudoit，B.Ellis，L.Gautier，Y.Ge，J.Gentry，K.Hornik，T.Hothorn，W.Huber，S.lacus， R.Irizarry，F.Leisch，C.Li，M.Maechler，A.J.Rossini，G.Sawitzki，C.Smith，G.Smyth， L.Tierney，J.Y.比Yang，J.Zhang. (2004)Bioconductor:0pensoftwaredevelopmentfor computationalbiologyandbioinformatics度ioconductor:计算生物学和生物信息学 的开放软件开发）.GenomeBiology5,R80)将探针组与Refseq绘图。
[0212] RT-PCR、q-PCR和单胚胎q-PCR分析
[0213]将裂解缓冲液加到经PBS/PVP洗涂的胚胎（Cells-to-cDNA试剂盒，Ambion)，用 lyLDNA酶I处理样品。反转录（RT)按照实验方案利用l.OyLSuperscriptIIIRT 酶（200U/yL) (Invitrogen)进行。基因-特异性产物的扩增由Taq聚合酶高保真试剂 盒（Invitrogen)在溫控循环器（Master巧clergradient5331，Elppendorf)上如下进行： 94. 0°C2min.，94. 0°C15sec.，60. 0°C30sec.，68. 0°C45sec，68. 0°C7 分钟，50 个循环（参 见表2的所有引物序列和化qMan探针）。单胚胎qRT-PCR利用Biomark48. 48动态阵列系 统（Fluidigm，SouthSanRrancisco,CA)进行。Wtyrode酸处理单胚胎，收集在lOul反 应缓冲液中，随后按照制造商的说明书预扩增（TaqMan基因表达试验，AppliedBiosystem; 表S8)。利用NanoFlexIFC控制器（Fluidigm)将扩增的cDNA上样到48. 48动态阵列上。 作为相对巧光强度的测量的阔值周期（Ct)从BioMarkPCR分析软件（Fluidigm)提取。所 有反应W两份或S份进行，在至少S个至五个独立实验中伴有阴性RT、PBS和阳性对照。每 个测定基因的数据W线性模型（ANC0VA)检验，其中Ct~P。+@1*条件+P2*Ct[憐酸甘油 醒脱氨酶]+P3*Ct[P-肌动蛋白]，其中"条件"是指无注射或0ct4敲低。Ct值直接用于数 据分析，因为在单细胞水平的基因表达已经显示遵循对数正态分布。
[0214]表2.用在q-PCR中的Taqman啜探针和基因-特异性引物[021 引
[0216]
阳2引]连施俩I1 阳22引 临巧巧肺胎学撒据
[0223] 在2005年在StanfordUniversity进行的所有1117个IVF治疗中，822个是使用 患者自身的卵母细胞的新的IVF周期（图1，图A)。基于我们的排除标准，出于多种医学和 非医学原因排除了 157周期。
[0224] 排除的157个周期由W下组成：由于卵巢刺激差