用于检查样本材料的微腔的制作方法

本发明涉及用于检查样本材料的微腔，当填充微腔时样本材料浸入在液体中，微腔包含：

· 用于盛装样本材料的检查体积，检查体积由以下限定：

· 第一刚性层，

· 与第一刚性层隔开的第二刚性层，以及

· 在第一和第二刚性层之间的气密密封。

背景技术：

这样的微腔从国际申请公开号WO2006031104A1中获知。所述公开描述了用在显微镜中的微型反应器，其包含第一和第二刚性层，两个刚性层至少局部可被电子显微镜的电子束透过，且靠近彼此在距彼此共同的距离处延伸，检查体积被包围在两者之间。刚性层（这里也称为“芯片”或“晶片”）的间隔通常小于10μm，且很可能在数十纳米的范围中。

微腔进一步具有入口和出口以将样本材料加进检查体积。

所述微型反应器的缺点是，为给检查体积填充带有浸入样本材料的液体，必须制作入口和液体的供给源之间的连接，并且必须制作出口和真空泵之间的连接。

注意到，有时毛细管力是足够的，但这取决于液体、悬浮液中的样本材料的数量等。因此它是不能被依赖的事物。

由于微腔的尺寸小（通常小于3×3mm²），因此制作可靠的连接是困难的，导致过程费时。

本发明的目标是提供创新的微型反应器。更具体地，本发明的目标是，该微型反应器将在没有早前提及的缺陷的情况下填充样本材料。

技术实现要素：

这些和其它目标的实现是通过以上开始段落中提出的微型反应器，所述微型反应器的特征在于，在用带有浸入的样本材料的液体填充检查腔之前，

· 至少一个刚性层的薄部将检查体积与外面隔离，

· 薄部配备来被刺破，以及

· 检查体积是真空体积，

其结果是，液体和浸入的样本材料，当被放在薄部上时，在薄部被刺破时被吸入到检查体积中。

注意到，在该上下文中，样本材料的浸入包括悬浮液、乳状液和胶体。在“检查”被用到的地方，这是“观察”的同义词。

通过预先抽空检查体积并随后刺破薄部，带有浸入样本材料的液体被吸入检查体积中而不依赖毛细管力或者需要外部的泵连接。薄部的刺破是容易的，并且此外，当利用半导体技术时，制造这样的薄部不困难，如稍后将示出的。因此，此微腔提供对该问题的廉价、快速和可靠的解决办法。

注意到，L. Marton, "Electron Microscopy of Biological Objects", Nature 133(1934), page 911描述了微腔，其中样本被保持在两个各自厚度为0.5μm的铝膜之间，这两个膜被夹持在一起。膜的使用暗示膜之间的间隔是不定的。

进一步注意到，US专利号US5,406,087描述了相似的利用两片膜的微腔，尽管这里薄膜优选是高分子膜。

进一步注意到，相似于描述在WO2006031104A1中的微腔的微腔被描述在"An all-in-one nanoreactor for high-resolution microscopy on nanomaterials at high pressures", J.F. Creemer et al., proceedings of MEMS 2011, Cancun, Mexico, January 23-27, 2011中，该文献进一步被称为Creemer[-1-]。这里结构被建立在单个硅片（第一刚性层）上。在片上首先形成牺牲层，在其上形成另一刚性层（第二刚性层）。在形成第二刚性层之后，牺牲层通过湿法刻蚀除去。在第一刚性层中，牺牲层和第二刚性层孔被形成在需要的地方，例如需要将第一和第二刚性层密封或结合在一起的地方、需要提供入口孔和出口孔的地方、需要制作透明窗的地方、需要提供湿法刻蚀所需的进入孔的地方等。

作为最后步骤中的一项，进入孔通过（局部地）淀积另外的材料层被封闭起来。

提及的是，在"Wafer-level assembly and sealing of a MEMS nanoreactor for in situ microscopy", L. Mele et al., J. Micromech. Microeng. 20(2010)085040中，该文献进一步被称为Mele[-2-]，微型反应器被描述为，在生产期间，还包含真空腔（见它的图5(c)）。然而，成品具有打开的入口和出口（见图5(d)），因此该出版物没有公开带有真空检查体积的微型反应器。

在一个实施例中，微腔配备有辐射可透过的窗口，其结果是所述辐射可经由该窗口进入和/或离开检查体积。

刚性层可被检查样品所用类型的辐射透过。如果其不是这种情况，例如当使用可被电子透过的窗口时，可形成呈凹口形式的窗口，凹口或窗口可被电子透过，而刚性层的其余部分则几乎不能被电子透过或不能被电子透过，或者凹口仅留有薄膜。这可以是例如硅中的凹口中的氮化硅膜或者这类类似的。

注意到，在本方面，在辐射穿过窗口时，当小于10％，更加优选地小于1％，的辐射被散射或吸收时，使用“可透过的”这一表述。

在另外的实施例中，微腔配备有两个辐射可透过的窗口，一个窗口在第一刚性层，第二个窗口在第二刚性层，窗口相对于彼此定位，以使经由一个窗口进入检查体积的辐射可经由另一个窗口离开检查体积，从而能够透射地检查样本材料。

通过对准两个窗口这样，辐射可穿过两个刚性层。

在仍另外的实施例中，辐射是来自红外线、可见光、紫外线，X射线、高能电子、中子的组中的辐射，并且进入窗口对于所述辐射是可透过的。

通过使用例如UV照射样本，可在样本材料中诱发荧光。优选地，窗口对于大范围的辐射是可透过的，但不排除微腔配备有对于UV可透过的进入窗口和对于可见光可透过的观察窗口。

在另一实施例中，气密密封由弹性体形成。

通过利用O形圈将两个刚性层密封到彼此，形成可靠的密封。O形圈可涂覆有例如欧洲专利号EP2722566中所描述的金属氧化物。O形圈可被装配在一个或两个刚性层中的凹口中。

在仍另一实施例中，气密密封通过将第一和第二刚性层结合到彼此形成。

通过结合两个刚性层形成气密密封。结合（bonding）是在半导体工艺中熟知的技术，因而使得半导体过程能够用于生产微腔。结合还已知作为一种将两块玻璃连接在一起的方法，并因此能够被用在玻璃衬底被用作刚性层的地方。

在仍另一实施例中，第一和第二刚性层彼此间隔小于10μm，优选小于2.5μm。

Mele[-2-]中描述的微腔的间隔是2μm，而Creemer[-1-]中描述的微腔的间隔是，例如，0.5μm。

在一个实施例中，刚性层中的至少一个是半导体芯片。

早前提及的描述在WO2006031104A1中的微腔使用两个夹层半导体芯片，而Creemer[-1-]和Mele[-2-]所描述的微腔使用一个半导体芯片，在其上形成第二刚性层。

在本发明的方面中，根据本发明的填充微腔的方法包含下列步骤：

· 提供根据前述权利要求中任一项的微腔，

· 提供浸入在液体中的样本材料，

· 放一滴带有浸入样本材料的液体在微腔的薄部上，

· 刺破薄部，

· 检查样本材料。

在方法的实施例中，跟在刺破薄部的步骤后的是密封刺孔的步骤。

当应该避免液体的蒸发时，密封刺孔是有益的。液体可以是水，也可以是例如酒精或带有高蒸发速率的别的液体。可使用例如蜂蜡或像氰基丙烯酸（cyanoacrylic）胶、环氧树脂等胶作为密封剂。

在另一实施例中，在检查样本材料的步骤之前，其中浸没了样本材料的液体被蒸发。

当将在真空中检查样本材料（如在电子显微镜中的情况）时，有益的是在检查之前除去液体，因为那样液体不能引起检查所使用的辐射的散射。除去液体可通过例如将带有刺破的窗口的微腔暴露在真空中一段延长的时间而进行。而且，当将要在干燥条件下检查样本材料时，应该除去液体。通过将微腔暴露到真空中或者通过加热微腔可实现蒸发。

注意到，当检查在真空下操作时蒸发也可以是优选的，从而避免当薄部暴露到真空中时液体的那部分被推回。替代地，如早前提及的，薄部可被再次密封。

在方法的另一实施例中，样本材料的检查包含将样本材料暴露到从红外线、可见光、紫外线、X射线、高能电子、中子的组中的辐射，并且允许所述辐射穿过从而达到样本的窗口对于所述辐射是可透射的。

在方法的仍另一实施例中，样本材料的检查包含检测由样本材料放射的辐射，辐射来自红外线、可见光、紫外线、X射线、高能电子、中子组成的组，并且被检测的所述辐射穿过的窗口对于所述辐射是可透射的。

注意到，有时照射样本所用的辐射不同于被检测的辐射。例子是利用UV光照射并且检测由UV诱发的荧光，荧光例如是绿色（可见）光。另外的这样的例子是利用电子照射引起所谓的阴极发光，阴极发光是将要检测的可见光放射。

在仍另一实施例中，微腔（及因此在微腔中的样本材料）在检查之前被玻璃化。

已知玻璃化是类似这样的过程，即在该过程中生物样本被迅速冷却到制冷温度（低于约135K）。如果冷却足够迅速（10⁵K/s数量级），则形成不带有冰晶的无定形冰，因而没有由所述冰晶引起的对样本的损坏。高压冷冻可用来在较低的冷却速率下实现相同结果。

现将在示范实施例和伴随的示意图的基础上更为详细地阐明本发明，其中相同的附图标号指示相同部件。

附图说明

为此：

图1示意性地示出微腔，

图2示意性地示出在样本材料引入时刻的微腔，

图3示出使用微腔的示例性方法的流程图。

具体实施方式

图1示意性地示出微腔。

检查体积101由第一刚性层102A+102B，第二刚性层103A+103B和气密密封104限定。

第一刚性层通过在硅片102A上形成例如氮化硅的薄层102B而形成。在硅片102A中，凹口108被形成以便形成可被辐射透过的窗口106B。如Mele[-2-]描述的薄（氮化物）层的厚度是15nm，使得窗口可被大范围的辐射透过。

第二刚性层103A+103B相似地通过在硅片103A上形成例如氮化硅的薄层103B而形成。在硅片103A中，凹口107被形成以便形成可被辐射透过的窗口106A。

第二刚性层包含另外的凹口109，以使薄部105将检查体积与外面隔离。薄层容易被刺破。

气密密封104被用于将两个片结合在一起。当在真空中完成结合时，因而被密封的检查体积是真空检查体积。

注意到，微腔可包含许多窗口、另外的结构（在Creemer[-1-]中被称为“柱”）以避免氮化硅层的变形（“鼓起”），包含一体化的加热元件以控制温度，例如能够在升高的温度下检查。

注意到，代替背对背地密封两个片，也可使用由Mele[-2-]所描述的过程来形成微腔。熟练技术人员将找到很多变型。

进一步注意到，刚性层不一定是硅，而可以是别的类型的半导体材料，或者例如玻璃。当期望仅用可见光检查时，后者尤其有吸引力。相似地，薄层可由别的材料形成。

聚合物（“塑料”）可被用于使用X射线的检查。

密封可以是所形成的产品的固有部分（见Mele[-2-]）、可被形成为粘合剂（见Creemer[-1-]），但还可以采用O形圈或者例如环氧胶的形式。

图2示意性地示出在样本材料被引入时刻的微腔。

在之前的段落中示出并描述且在图1中示出的微腔，在这里加载了一滴带有样本材料203的液体202的液滴201。针204准备来刺破薄部105，在刺破薄部105之后液滴被吸入检查体积101中。

注意到，替代用专用针刺破薄部，载有容纳了样本材料的液体的注射器可被用来刺破薄部，在所述注射器将液体施加到凹口之后，通过首先挤压出一点液体，同时注射器从薄部稍微移开，然后通过在薄部的方向上移动它（穿过包含样本材料的液滴）从而用注射器刺破薄部。优点是，用来施加液体的注射器不需要被移除给刺破用的针挪地方。

图3示出使用微腔的示范方法。

在步骤301中，提供微腔。

在步骤302中，提供带有浸入的样本材料的液体。带有浸入样本材料的液体可以是带有生物材料（细胞或者其局部、酶等）的水，并且生物材料可以是处在它的自然形式，或者它可被着色、标以标记等。带有样本材料的液体还可以是带有浸入的固体颗粒的液体，所述液体是水或者例如溶剂（酒精、丙酮等），并且所述固体颗粒是例如催化剂、碾碎的矿物或者类似的。

在步骤303中，带有浸入样本材料的液体被放置到微型反应器的薄部上。

在步骤304中，薄部被刺破。因此液体在一侧暴露到环境压力中，在另一侧暴露到真空中，导致液滴被吸入到真空的检查体积中。

注意到，该步骤需要在压力显著高于微腔中的真空的环境中执行，例如在环境空气压力下。

如早前指出的，刺破可通过专用针（如图1中所示）或通过在之前的步骤中施加浸入的样本材料所用的注射器完成。

在可选步骤305中，液体被除去，仅剩样本材料在检查体积中。除去液体可包含加热微型反应器，或者把微型反应器放在真空腔或至少具有降低的压力的腔中。

在可选步骤306中，密封薄部中的刺孔。尤其当在真空中检查时（例如在电子显微镜中），可能需要封闭刺孔以避免液体蒸发以及蒸汽进入电子显微镜的真空腔，并且/或者避免不想要的样本材料变干。密封可包含添加蜂蜡、添加胶（例如氰基丙烯酸胶）或者环氧基树脂。

在可选步骤307中，微型反应器（及因此在其中的样本材料）被玻璃化。冷冻电子显微术中的玻璃化是这样的过程：冷冻水足够快从而没有冰晶形成。这通常暗示以大约10⁵K/s的速率将水冷却到低于约135K的温度。玻璃化被用在电子显微术中，因为辐射对生物样本，例如细胞的酶和细胞器官，的损坏在低温下比在高温下减少。

在步骤308中，检查样本材料。检查可包含将样本材料暴露到（可见或UV）光中以及确定结构的位置（通过光学显微术或通过荧光），或者X射线检查，或者通过电子显微术的检查，或者（在时间上顺序地或同时地）它们的结合。

注意到，对于改进的检查，可通过铣掉微腔的材料形成窗口，例如利用聚焦离子束铣削。尤其在检查玻璃化的样本时，那么仅无定形冰和装入的样本材料散射（电子）波束。

非专利文献：

-1- J.F. Creemer et al., "An all-in-one nanoreactor for high-resolution microscopy on nanomaterials at high pressures", proceedings of MEMS 2011, Cancun, Mexico, January 23-27, 2011.

-2- L. Mele et al., "Wafer-level assembly and sealing of a MEMS nanoreactor for in situ microscopy", J. Micromech. Microeng. 20(2010) 085040.