Fe3O4@SiO2复合纳米磁珠的制备方法与流程

本发明属于纳米复合材料领域，具体涉及的是一种用于生物样品dna分离提纯的fe3o4@sio2复合纳米磁珠的制备方法。

背景技术：

随着基因诊断、转基因食品检测、个性化医疗的快速发展，对dna的提取已成为生物医药及农林牧渔等领域内科学研究的基础。磁珠法核酸提取，具有传统dna提取方法无法比拟的优势，主要体现在：①能够实现自动化、大批量操作；②操作简单、用时短，提取流程步骤少；③安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂；④提取的核酸纯度高、浓度大。磁珠法核酸提取的关键因素是纳米磁珠，因此研制性能良好的纳米磁珠具有重要的实用价值。fe3o4因其生物安全性好，制备方法简单，在外磁场下容易分离等特点，是生物和医学的常用磁性材料，也是目前核酸提取常用的磁性粒子。溶剂热法合成出的fe3o4纳米粒子其性能优于其它传统合成方法，具有产物粒度分布均一、分散性好、强磁响应性等优点(h.deng,x.l.li,q.peng,et.al.,angew.chem.int.ed.2005,44,2782–2785)。磁性纳米粒子由于具有较高的比表面能和磁偶极相互作用，具有强烈的聚集倾向，很难保持稳定状态。因此需要对粒子表面进行修饰形成磁性复合粒子以提高粒子的分散性，保护裸露的磁性粒子。二氧化硅具有良好的物理化学稳定性和生物相容性、表面易修饰，能应用于各种不同的环境中，对dna具有良好的吸附分离能力，是当今最为理想的包被材料。目前在fe3o4上包裹sio2制备fe3o4/sio2纳米磁球最常用的方法是法(w.a.fink,e.bohn,et.al.,j.colloidinterfacesci.,1968,26,62–69)，通过在fe3o4纳米粒子表面水解有机硅氧烷，使sio2包覆在磁性微粒上，得到功能化的磁性复合微粒。目前用于解离产生sio2的有机硅氧烷为正硅酸乙酯(二氧化硅含量为28％)，制备的磁性微球往往存在分散性不够理想、粒径不均匀，形状不够规则、重现性不好等问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明创造旨在提出一种新的fe3o4@sio2复合纳米磁珠的制备方法，以更低的成本更高效的合成可高效分离提纯dna的纳米磁珠。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一种fe3o4@sio2复合纳米磁珠的制备方法，其特征在于：所述制备方法是以溶剂热法制备的四氧化三铁纳米颗粒为核，通过法包裹sio2制得所述fe3o4@sio2复合纳米磁珠，其中所述sio2的硅源为聚硅酸乙酯-40。

进一步的，所述的fe3o4@sio2复合纳米磁珠的制备方法包括以下步骤：

(1)fe3o4纳米颗粒的制备：将六水合氯化铁溶解在乙二醇中，然后加入三水醋酸钠和聚乙二醇-2000，混合物搅拌90min，加入聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中密封，在185～200℃下反应6～72h，冷却后倒出反应液，所得产物离心分离，并用乙醇和去离子水洗涤3～4次，干燥即得所述fe3o4纳米颗粒备用；

(2)fe3o4@sio2复合纳米磁珠的制备：将步骤(1)中得到的纳米颗粒加入到乙醇、去离子水和氨水的混合碱性溶液中，加入柠檬酸，机械搅拌中逐滴加入聚硅酸乙酯-40，搅拌反应12h，磁分离得到包覆有硅层的磁球，用去离子水和无水乙醇洗涤至中性，即得所述fe3o4@sio2复合纳米磁珠。

进一步的，步骤(1)中的物料填充度为92-96％。

进一步的，步骤(1)中六水合氯化铁、三水醋酸钠和聚乙二醇-2000的质量比是1：(2～3)：(0.5～1)。

进一步的，步骤(2)中乙醇：去离子水：氨水的体积比是(3～4)：4：(1～1.2)，每1升混合溶液中加入fe3o4纳米颗粒的质量在20-30克之间。。

进一步的，步骤(2)中聚硅酸乙酯-40、柠檬酸和fe3o4纳米颗粒的质量比是(2.5～3.2)：1：(7～10)，聚硅酸乙酯-40的加入量的改变可调节磁球表面的二氧化硅层厚度。

进一步的，步骤(1)中的反应时间及温度可以控制得到的纳米fe3o4颗粒的粒径，粒径范围为160–600nm。

相对于现有技术，本发明所述的fe3o4@sio2复合纳米磁珠的制备方法具有以下优势：

(1)本发明所述的制备方法在制备不同粒径fe3o4纳米微球阶段，通过调整配方，增加体系内的含水量(使用含结晶水的无机盐)，提高填充度，以接近混合体系沸点的温度加热，提高了产率降低了成本并提高了生产时的安全性；在包裹sio2阶段，使用聚硅酸乙酯-40为核心原料的新型配方，可提高纳米磁珠分离提纯dna效果，并极大地降低生产成本；

(2)本发明硅源主要原料为聚硅酸乙酯-40，区别于正硅酸乙酯，聚硅酸乙酯-40中二氧化硅含量比正硅酸乙酯高66.7％，相应各种原料的用量都相应减少，可减低成本，并减少废弃物的排放，对环境污染较小，符合绿色环保的要求；

(3)采用本发明制备得到fe3o4@sio2复合纳米磁珠，磁性复合微球载体的批内差和批间差都在5％以内，重复性好，通过自动化纯化体系每毫升新鲜血液平均可以提取大于40μg的基因组dna，电泳中dna呈明亮均一的条带，未发生降解，化学稳定性高，具有更好的dna分离提纯效果。

附图说明

图1为实施例1所制得的fe3o4@sio2复合纳米磁珠粒径分布图；

图2为实施例2所制得的fe3o4@sio2复合纳米磁珠粒径分布图；

图3为全血基因组dna电泳图；

图4为唾液样品加入实施例1所得纳米磁珠所提取dna的紫外光谱图；

图5为全血样品加入实施例2所得纳米磁珠所提取dna的紫外光谱图；

图6为鼠尾基因组dna电泳图；

图7为实施例1所得纳米磁珠形貌图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明创造。

实施例1

一种fe3o4@sio2复合纳米磁珠的制备方法，包括以下步骤：

(1)将六水合氯化铁27g溶解在800ml乙二醇中，然后加入无水醋酸钠72g和20g聚乙二醇-2000，混合物搅拌90min，加入不锈钢反应釜中密封，在200℃中反应9h；冷却后倒出反应液，所得产物离心分离，并用无水乙醇和去离子水洗涤3–4次，干燥即得所述fe3o4纳米颗粒备用；

(2)取制备得到的fe3o4纳米颗粒100g加入10l的三颈瓶中，依次加入无水乙醇，去离子水各2l，机械搅拌；再加入10g柠檬酸，500ml氨水，缓慢滴加聚硅酸乙酯-4030ml，机械搅拌12h；磁分离得到包覆有硅层的磁球，用去离子水和无水乙醇洗涤至中性，即得到尺寸在300nm左右的fe3o4@sio2复合纳米磁珠，得到产品3。

实施例2

一种fe3o4@sio2复合纳米磁珠的制备方法，包括以下步骤：

(1)将六水合氯化铁36g溶解在800ml乙二醇中，然后加入无水醋酸钠100g和20g聚乙二醇-2000，混合物搅拌90min，加入聚四氟乙烯容器中密封，在195℃中反应36h；冷却后倒出反应液，所得产物离心分离，并用无水乙醇和去离子水洗涤3-4次，干燥即得所述fe3o4纳米颗粒备用；

(2)取制备得到的fe3o4纳米颗粒100g加入10l的三颈瓶中，依次加入无水乙醇，去离子水各2l，机械搅拌；再加入8.3g柠檬酸，500ml氨水，缓慢滴加聚硅酸乙酯-4025ml，机械搅拌12h；磁分离得到包覆有硅层的磁球，用去离子水和无水乙醇洗涤至中性，即得到尺寸在500nm左右的fe3o4@sio2复合纳米磁珠，得到产品4。

对比例1

一种fe3o4@sio2复合纳米磁珠的制备方法，包括以下步骤：

(1)将六水合氯化铁27g溶解在800ml乙二醇中，然后加入无水醋酸钠72g和20g聚乙二醇-2000，混合物搅拌90min，加入不锈钢反应釜中密封，在200℃中反应9h；冷却后倒出反应液，所得产物离心分离，并用无水乙醇和去离子水洗涤3–4次，干燥即得所述fe3o4纳米颗粒备用；

(2)取制备得到的fe3o4纳米颗粒100g加入10l的三颈瓶中，依次加入无水乙醇，去离子水各2l，机械搅拌；再加入10g柠檬酸，500ml氨水，缓慢滴加正硅酸乙酯30ml，机械搅拌12h；磁分离得到包覆有硅层的磁球，用去离子水和无水乙醇洗涤至中性，即得到尺寸在300nm左右的fe3o4@sio2复合纳米磁珠，得到产品1。

对比例2

一种fe3o4@sio2复合纳米磁珠的制备方法，包括以下步骤：

(1)将六水合氯化铁27g溶解在800ml乙二醇中，然后加入无水醋酸钠72g和20g聚乙二醇-2000，混合物搅拌90min，加入不锈钢反应釜中密封，在200℃中反应9h；冷却后倒出反应液，所得产物离心分离，并用无水乙醇和去离子水洗涤3-4次，干燥即得所述fe3o4纳米颗粒备用；

(2)取制备得到的fe3o4纳米颗粒100g加入10l的三颈瓶中，依次加入无水乙醇，去离子水各2l，机械搅拌；再加入500ml氨水，缓慢滴加聚硅酸乙酯-4030ml，机械搅拌12h；磁分离得到包覆有硅层的磁球，用去离子水和无水乙醇洗涤至中性，即得到尺寸在300nm左右的fe3o4@sio2复合纳米磁珠，得到产品2。

实验：wg为目前市售效果最好的产品(为度生物，ma0309c磁性微球)。

粒径测试：

对于产品3和产品4，分别取1mgfe3o4@sio2分散于2ml的蒸馏水中，超声分散，然后用nanozs90粒径测试仪测定粒径分布。测试结果表明粒径均匀，图1显示产品3得到的复合纳米磁球粒径分布为250-400nm；图2显示产品4得到的复合纳米磁球粒径分布为400-600nm。

电泳实验：

配制1％的琼脂糖凝胶进行电泳实验。

选用实施例1、实施例2、对比例1、对比例2的产品以及wg进行电泳实验。

(1)称取0.7g琼脂糖放于锥形瓶中，再量取70ml的1×tae溶液混合，放于微波炉中煮沸，至溶液清彻透明为止。

(2)组装好制胶器，并调至水平。将胶倒于制胶器中，插好梳子。待40分钟胶冷却凝固后，就可放于倒好电泳缓冲液的电泳槽中进行点样。

(3)取带有溴酚蓝的样品溶液5μl进行点样。每排点样孔要点一个5μl的marker。

(4)点完后，调电泳仪各参数进行电泳。

(5)电泳结束后，取出凝胶，用含eb的缓冲液染液进行染色20min，在缓冲液清洗。

(6)最后在紫外灯下观察。采用本专利产品提纯的dna呈明亮均一的条带，显示出良好的dna分离提纯效果。而改变本专利配方所合成产品提纯的dna，其条带亮度明显减弱，其dna分离提纯效果远差于前者，说明改变配方对复合纳米磁球的dna提纯效果有很大影响。

如图3所示，对于全血样品，采用本专利产品3和产品4提纯的dna其纯度及产率略优于目前市售效果最好产品。

如图6所示，对于鼠尾样品，采用本专利产品3和产品4提纯的dna其纯度明显优于目前市售效果最好产品(对照组产品1和产品2条带有明显拖尾现象)。

紫外光谱测定

选用实施例1的产品

提纯所得dna溶液样品100μl扫紫外区波长，od260/280比值在1.8左右说明纯度达标，吸收峰强度与dna浓度成正比。根据公式：dna浓度(ng/μl)＝od260×50ng/μl，可计算dna产品浓度，200μl唾液样品可提纯64.7ng/μldna样品(图4)；

选用实施例2的产品

提纯所得dna溶液样品100μl扫紫外区波长，od260/280比值在1.8左右说明纯度达标，吸收峰强度与dna浓度成正比。根据公式：dna浓度(ng/μl)＝od260×50ng/μl，可计算dna产品浓度，120μl全血样品可提纯172.0ng/μldna样品(图5)。

图7为实施例1的产品所得纳米磁珠形貌图。采用本专利配方制备的纳米磁珠，均具有良好的稳定性和分散性，超声或摇匀后可在一段时间内(大于2分钟)悬浮在溶液中，分布均匀，沉降速度慢。磁响应性强，在外加磁场下可快速聚集，便于对dna的分离提纯。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。