一种无创制作慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于动物实验模型构建技术领域，具体地说，涉及一种无创制作慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型的方法。
【背景技术】
[0002]目前慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型的构建方法有很多，目前最长使用的方法包括:内毒素经气管内注入加熏香烟法、气管内滴入蛋白酶加二氧化硫刺激法、持续细菌感染加吸烟法、气道内注入促弹性蛋白酶和脂多糖、气道内注入蛋白酶加常压低氧法、CaCl2联合山黎豆类制剂。上述造模方法均需要气道内滴入化学制剂，由于慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型的构建时间较长，故造模过程中动物的存活率是一个很关键的问题。造模过程中气道内滴入化学制剂的步骤相当关键，可以有气管切开法、直视下给药法、盲插法等，均属于有创操作，对动物造成一定程度的损伤，会影响成型动物的存活数量以及质量。
[0003]气管切开法:为有创操作，简单易行，且在切开后，视野暴露良好，易于准确定位；但术后感染与否以及操作对于气管局部以及周围组织的破坏难以掌握，存活率低。
[0004]直视下给药法:选取光源暴露声门后，操作者在直视声门的情况下，进行气管内给药的相关操作，较其他方法创伤小，器械和技术水平要求相应也降低，但选择合适的光源清晰暴露声门则是此法关键环节，多选用灯泡，冷光源，手电等透过颈部的光线。此时辅以牵拉舌根暴露声门，但大鼠头部狭长，声门狭小并且在口腔深部，选用的给药装置如过粗或形态不能很好配合生理曲度时，在逐渐接近会厌部，则会挡住大部分视线，在声门暴露的短暂时间内，较难准确插入声门完成操作，并容易将给药装置误入食管或因为视野不清反复多次插入造成喉头水肿，气道损伤，声带出血，严重时甚至大鼠死亡。
[0005]盲插法:经口气管内给药，在没有暴露声门的情况下，容易反复刺激喉部，造成粘膜水肿出血，气道分泌物增加，导致气道阻塞，另外极易将注射装置误入食道，成功率较低。经皮气管内给药，则需要从外部皮肤直接准确定位气管位置并从环状软骨间隙给药，对操作人的技术要求较高，否则容易多次刺激局部肌肉及筋膜等，给药效果难以评估，还容易造成水肿出血，成功率低。
[0006]针对上述现有的操作技术，目前，需要一种操作方便，成功率高，损伤小且成本低廉的大鼠用气管内给药方法。
【发明内容】
[0007]为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提出了一种无创制作慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型的方法。其技术方案如下:
[0008]一种无创制作慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型的方法，包括以下步骤:
[0009]步骤1、菌株与细菌培养
[0010]肺炎链球菌标准菌株由天津市临床检验中心提供，菌株号:ATCC49619，取菌株ATCC49619接种于血琼脂培养皿，37°C培养18_24h，挑取单菌落接种THB液体培养基，37°C，200rpm/min振荡培养12h，离心浓缩后，备用；
[0011]步骤2、实验动物
[0012]清洁级Wistar雄性大鼠60只，月龄3_6个月，体重180 士 20g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物合格(许可)证号:SCXK(京)2009-0004 ;实验大鼠喂养在天津实验动物中心，饲养环境室内相对湿度为50% -60%，温度控制在18-22°C ;常规饲料喂养，自由饮用水，按时通风冲刷粪便，保持环境安静，适应性喂养I周后开始实验；
[0013]步骤3、肺气肿动物模型构建:
[0014]采用内窥镜引导下气管内灌注的滴注菌液方式，设备采用鼻O度4#硬式内窥镜、氙灯冷光源及松下KS-822摄录监视系统；
[0015]将大鼠置于直径为26cm的干燥器内乙醚麻醉，麻醉满意后迅速将鼠从麻醉器中取出，呈仰卧位状以弹力固定夹将其四肢分别固定于鼠板上；
[0016]两名操作者并排位于鼠头顶方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉镜，自鼠上唇齿伸入口腔、提压鼠舌，伸至鼠会厌缘处时提拉鼠舌根，以右手持牵拉套圈，套住鼠上列长尖牙门齿，左右手同时相反方向上下牵拉舌根与长尖牙门齿，使鼠自唇齿至喉部间上呼吸畅通暴露声门区域，此时主操作者以左手持O度硬式内窥镜，右手持7号长针注射器，内装定量造模所用肺炎链球菌菌悬液，在监视器显示引导下将7号长注射针插入气管内，并深入声门下15?20mm，此时观察鼠的声带活动情况，当双侧声带由内收状向外展状变化时，缓慢滴注6u 0.15ml弹性蛋白酶溶液7.7 μ /mg, Sigma公司，随后注入100 μ I空气，此时鼠呈吸气阶段，使药物随吸气时的气流充分进入支气管内，推注完毕后，将鼠板迅速立起鼠头在上左右翻转15?20秒，空白组不做处理，盐水对照组注入同等量的无菌生理盐水；每7天滴入一次，共3次，造模时间21天；
[0017]解除鼠四肢弹力固定夹将鼠放回鼠笼内待复苏，鼠复苏时间约30?60秒，然后置于恒温动物房饲养；接种后每日观察其活动、取食、精神的一般情况，记录相应数据；
[0018]步骤4、制备肺炎链球菌琼脂珠悬液:
[0019]肺炎链球菌标准菌株由天津市临床检验中心提供，菌株号:ATCC49619 ;营养琼脂平板培养后，调整细菌浓度为2X 1012-6X 1012CFU/ml，取浓缩菌液与45°C溶化的琼脂溶液等量混合，迅速注入4°C快速搅拌的脑心浸液培养基中，制成由琼脂包裹细菌的肺炎链球菌琼脂珠悬液；悬浮液包含细菌浓度为lX1012-3X1012CFU/ml的不定形琼脂珠。
[0020]本发明的有益效果为:
[0021]本发明使用的是无创手段气管内滴入弹性蛋白酶以及肺炎链球菌的方法构建慢性阻塞性肺疾病动物模型。该方法通过无创的方法，减少了对动物的损伤，提高了成活率，保证了在较长时间的造模过程中动物能够免于有创操作带来的死亡。研宄发现每次能够保证滴入足够量的弹性蛋白酶能够相对缩短造模时间，节省了时间的同时也节约了造模成本。
【附图说明】
[0022]图1为空白组动物肺组织HE染色(50倍);
[0023]图2为模型组动物肺组织HE染色(50倍);
[0024]图3为盐水对照组动物肺组织HE染色(50倍)。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细地说明。一种无创制作慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型的方法
[0026]步骤1、菌株与细菌培养
[0027]肺炎链球菌标准菌株由天津市临床检验中心提供，菌株号:ATCC49619，取菌株ATCC49619接种于血琼脂培养皿，37°C培养18_24h，挑取单菌落接种THB液体培养基，37°C，200rpm/min振荡培养12h，离心浓缩后，备用。
[0028]步骤2、实验动物
[0029]清洁级Wistar雄性大鼠60只，月龄3_6个月，体重180 士 20g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物合格(许可)证号:SCXK(京)2009-0004 ;实验大鼠喂养在天津实验动物中心，饲养环境室内相对湿度为50% -60%，温度控制在18-22°C ;常规饲料喂养，自由饮用水，按时通风冲刷粪便，保持环境安静，适应性喂养I周后开始实验。
[0030]步骤3、肺气肿动物模型构建:
[0031]采用内窥镜引导下气管内灌注的滴注菌液方式，设备采用鼻O度4#硬式内窥镜、氙灯冷光源及松下KS-822摄录监视系统；
[0032]将大鼠置于直径为26cm的干燥器内乙醚麻醉，麻醉满意后迅速将鼠从麻醉器中取出，呈仰卧位状以弹力固定夹将其四肢分别固定于鼠板上；
[0033]两名操作者并排位于鼠头顶方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉镜，自鼠上唇齿伸入口腔、提压鼠舌，伸至鼠会厌缘处时提拉鼠舌根，以右手持牵拉套圈，套住鼠上列长尖牙门齿，左右手同时相反方向上下牵拉舌根与长尖牙门齿，使鼠自唇齿至喉部间上呼吸畅通暴露声门区域，此时主操作者以左手持O度硬式内窥镜，右手持7号长针注射器，内装定量造模所用肺炎链球菌菌悬液，在监视器显示引导下将7号长注射针插入气管内，并深入声门下15?20mm，此时观察鼠的声带活动情况，当双侧声带由内收状向外展状变化时，缓慢滴注6u(0.15ml)弹性蛋白酶溶液(7.7 μ/mg，Sigma公司)，随后注入10yl空气，此时鼠呈吸气阶段，使药物随吸气时的气流充分进入支气管内，推注完毕后，将鼠板