一种磁性复合纳米粒子及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种磁性复合纳米粒子及其制备方法，具体说是设及一种W乙締基化 晚为配基，对抗体具有选择性吸附的的复合磁性纳米粒子及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 抗体工程技术随着现代生物技术发展而逐步完善，已成为生物技术产业化的主力 军，尤其在生物技术制药领域中占有重要地位。抗体药物W其高度特异性的疗效，对人体毒 副作用小，己被广泛应用于临床诊疗，主要用于提高人体免疫力W及治疗恶性肿瘤等。由于 用途不同，抗体的来源也有很大的差别，如用于提高人体免疫力的抗体来源于健康人的血 浆；治疗恶性肿瘤的抗体则是人源化的单克隆抗体，来源于杂交瘤细胞。无论是何种来源的 抗体在应用于之前都要经过严格的安全性和药效性审查；作为注射制剂的应用模式也对抗 体的纯度提出了更高的要求，高效的分离纯化工艺是抗体质量的保证，也是决定生产成本 的关键环节。
[0003] 在纯化抗体过程中应用频率较多的是W蛋白A和蛋白G为配基的亲和色谱。蛋白 A和蛋白G是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，能与IgG类抗体的Fc片断特异性结合。由于 其对抗体具有很高的选择性而专口用于抗体的分离纯化，已经被广泛应用到工业化的抗体 制备中扣SPatent4230685)。该方法存在一些缺陷，如蛋白A亲和层析介质的价格昂贵、成 本高；使用寿命短、缺乏有效的清洗方法；在酸性洗脱条件W及反复使用易导致其丧失生 物活性；由于配基属于蛋白质，易被存在原料液中的蛋白酶水解，从而降低分离效果，而配 基的脱落易造成抗体产品的污染等。运些不足之处限制了其在大规模抗体纯化领域中的应 用。而且蛋白质A配基所具有的缺点，蛋白质G和蛋白质L同样具有，此外蛋白质G的价格 比蛋白质A还要昂贵，同样面临着大规模应用困难的问题。
[0004] 免疫亲和法（IAC) W抗原（或抗体）作为配体与载体结合，组成固定相，用于分离 样品中能特异结合的抗体（或抗原）。由于抗原与抗体的结合的特异性非常强，免疫亲和法 是分离抗体非常有效的方法，且纯度很高。但抗原相当昂贵，使用寿命短，故不适用于工业 规模大量生产。 阳〇化]离子交换色谱作为一种最常用的色谱技术被用于抗体的分离纯化。通常情况下运 种层析介质对蛋白质的吸附要求在比较低的离子强度（20-50mM缓冲液）下进行。因此，料 液一般需要预先脱盐或稀释，运样会增加操作步骤和时间，影响生产能力。由于免疫球蛋白 大多是疏水的，且不同的抗体的疏水程度也不同，所W疏水色谱化1C)亦被用于免疫球蛋 白的分离纯化。由于HIC使用的是高浓度的硫酸锭作为流动相，因此，分离后的样品必须进 行脱盐后才可进行下一步的分离操作。运不仅会增加生产成本，而且加入的盐有可能会破 坏目标蛋白质的稳定性，干扰后续的分离步骤。但通常仅采用离子交换或疏水色谱很难一 步纯化得到高纯度的抗体蛋白。
[0006] 为了解决蛋白质A亲和分离介质存在的上述问题，采用对抗体具有特异亲和作用 的小分子配体来取代昂贵的蛋白质A亲和配体。如将含有讽基和琉基乙醇为配基的亲硫色 谱（Porathetal.阳BSLetters,1985, 185:306)用于抗体的分离纯化。疏水电荷诱导色 谱化y化ophobicchargeinductionC虹omatogra地y,肥1C)是一种分离纯化抗体的新技 术灯ongHF，LinDQ，GaoD，etal.JC虹omatogr4,2013，1285:88-96)，肥1(：主要通过增 加疏水基团的键合密度，同时选择合适的离子化配基，使其在较高抑时不带电荷，使蛋白 在吸附时只依靠疏水相互作用。解吸附时通过调节洗脱液抑值，使固定相表面带上与蛋白 表面相同的电荷，从而依靠静电斥力将蛋白质洗脱下来。美国专利扣SPatent5, 652, 348; 5, 719, 269 ;7, 144, 743)报道了利用杂环配体进行抗体的疏水相互作用进行吸附分离的新 型分离介质及其制备方法。其中W琉基乙基化晚为配基的层析介质已经有化11 Bios巧ara 公司商品化生产。中国专利（CN101284224)报道了一种W琉基化晚和讽基为配基、W纤 维素/无机增重剂复合微球为基质的分离抗体的扩张床吸附介质及制备方法。中国专利 (CN201210202165. 8)报道了一种W亲水性凝胶微球为基质，在均S嗦活化剂中制成活化基 质，然后键合4-(2-径基乙基）-化晚等两个小分子配体，用于分离抗体的扩张床分离介质 及制备方法。
[0007] 磁性纳米材料作为一种新型功能复合材料，因其具有吸附能力强、表面可修饰、易 分离和良好的生物相容性等特点，已广泛应用于生物、环境等复杂体系样品的前处理过程 中。相对于传统色谱分离技术，磁性复合微球在外磁场作用下可迅速地进行分离、回收和再 利用。
[0008] 近年来，磁性分离技术在蛋白质分离纯化方面表现出很好的优势。运种吸附剂粒 子的磁学响应性可W达到在其他悬浮固体颗粒存在的情况下选择性的富集和分离目标物 的目的，使得从生物粗制样品中直接分离纯化目标蛋白成为可能，比如，发酵液、细胞悬浮 液、血浆、牛奶、乳清W及植物萃取液等。磁性分离技术的应用擬除了色谱填充柱繁琐的处 理过程，比如离屯、、过滤、基质分离等，而且，磁性分离技术有其独一无二的优势，比如快速、 溫和、适用范围广、容易操作、可W实现其他技术难W实现或者不能实现的分离等。
[0009] 将对抗体具有特异吸附性能的琉基-乙基化晚（ME巧作为配基键合到磁性复合微 球的表面，可将磁性纳米粒子的超顺磁性和疏水电荷诱导色谱配基MEP对抗体的特异吸附 性能相结合，制备出一种对抗体具有选择性吸附的新型生物功能化的磁性复合纳米材料， 是一种疏水电荷诱导磁性吸附剂。该磁性复合微球含有一个可离子化的化晚环和一个含有 硫元素的疏水尾部，其地a为5. 8,在通常的生理条件下如抑7-8时，化晚环不带电，MEP与 抗体通过溫和的疏水相互作用结合，当抑降低后，化晚环带上正电荷，此时抗体由于抑低 于它的等电点也带上相同的正电荷，当静电排斥作用大过疏水作用时，抗体就从介质上洗 脱下来。该磁性复合微球既有很好的超顺磁性，又表现出对抗体吸附很高的亲和性和选择 性，可用于抗体的快速分离与制备。
【发明内容】
[0010] 本发明所设及的W乙締基化晚为配基，对抗体具有选择性吸附的磁性复合纳米粒 子：W磁性复合纳米粒子Fe3〇4@Si〇2或Fe 3〇4@聚合物为基质，配基为经硅烷偶联剂琉乙基立 甲氧基硅烷通过琉基-締点击反应偶联的乙締基化晚，本实验制备的磁性复合纳米粒子的 结构组成为：
[0011]
[0012] 配基为乙締基化晚，包括4-乙締基化晚、3-乙締基化晚、2-乙締基化晚。
[0013] 所述一种磁性复合纳米粒子是一种W乙締基化晚为配基，对抗体具有选择性吸附 的磁性复合纳米粒子，所述的磁性复合纳米粒子W具有超顺磁性的化化纳米粒子为核，具 有包覆的Si化或聚合物为壳的核-壳结构，Fe 3〇4@Si化或化3〇4@聚合物磁性复合纳米粒子 的粒径为250~lOOOnm，所述的乙締基化晚，包括4-乙締基化晚、3-乙締基化晚、2-乙締基 化晚。
[0014] 所述的一种磁性复合纳米粒子，具有疏水电荷诱导固相吸附剂的性质，是一种疏 水电荷诱导磁性吸附剂。配基偶联后含有一个可离子化的化晚环和一个含有硫元素的疏水 尾部，在通常的生理条件下如抑7-8时，化晚环不带电，MEP与抗体通过溫和的疏水相互作 用结合，当抑降低后，化晚环带上正电荷，此时抗体由于抑低于它的等电点也带上相同的 正电荷，当静电排斥作用大过疏水作用时，抗体就从介质上洗脱下来。
[0015] 所述的一种磁性复合纳米粒子，在进行特异性吸附时，将含有特异性抗体的样品， 如血液、血清、血浆、腹水、细胞培养液、乳液、生物工程表达的单克隆抗体或卵黄等生物原 料中免疫球蛋