百脉根ap2/erf转录因子及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及转录因子，尤其涉及一种从百脉根（Lotus corniculatus L.)中分离 的与抗逆相关的AP2/ERF转录因子，本发明还涉及所述转录因子在提高植物抗逆境胁迫中 的应用，属于AP2/ERF转录因子及其应用领域。
【背景技术】
[0002] 土壤盐碱化和次生盐碱化问题在世界范围内广泛存在，特别是干旱、半干旱地区 更为严重。土壤干旱、盐碱化严重阻碍了农作物的生长，降低了农作物的产量，已经成为制 约世界灌溉农业可持续发展和影响生态环境的重要因素。
[0003] 百脉根（Lotus corniculatus L.)是世界范围内广泛种植的多年生优良豆科牧 草，具有营养丰富、耐贫瘠、耐酸碱、耐牧和饲用安全、适口性好等优点。其不仅是建设生态 农业的优质草种，还是用于土壤改良的重要作物，在用作地被植物、保持水土、改良人工草 场、防止土壤荒漠化等方面具有独特作用。
[0004] 植物抗逆性是受多基因控制的复杂数量性状，单个基因表达的增强并不能从根本 上改良植物对多种不良环境的抵抗能力，而转录因子（Transcriptional Factors, TFs)是 能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在 特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白，是目前抗逆研究最多、应用最广的一类 基因。
[0005] 植物逆境抗性相关转录因子可以分：AP2/ERF、bZIP、WRKY、MYB、NAC五大类。其中 AP2/ERF转录因子是植物特有的一大类超基因家族，具有非常保守的DNA结合域，特异性的 与ERE、GCC-box等顺式元件结合，调控胁迫应答基因表达，是参与植物生长发育、生物/非 生物胁迫应答基因表达及信号转导的重要转录调控因子。AP2/ERF超家族分为AP2、DREB、 ERF、RAV和Soloist共5个亚家族，目前已有大量文献报道了 DREB和ERF亚家族基因的功 能与分子机制研究，但是有关单独亚家族（Soloist)文献报道还很少。因此，从优良豆科牧 草百脉根中分离、鉴定AP2/ERF转录因子并分析其抗逆功能，对于农牧业生产、生态环境建 设、土壤改良等方面均具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供从百脉根（Lotus corniculatus L.)中分离的 AP2/ERF转录因子及其编码基因；
[0007] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供含有上述编码基因的重组植物表达载 体及含有该表达载体的宿主细胞；
[0008] 本发明所要解决的第三个技术问题是将所述AP2/ERF转录因子及其编码基因应 用于提高植物对逆境胁迫的抗性。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0010] 本发明首先公开了从百脉根（Lotus corniculatus L.)中分离的AP2/ERF转录因 子编码基因（命名为：LcAP2/ERF107)，其多核苷酸为（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示：
[0011] (a)、SEQ ID NO. 1所示的多核苷酸；或
[0012](b)、编码SEQ ID NO. 2所示氨基酸的多核苷酸；或
[0013](c)、与SEQ ID NO. 1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多 核苷酸所编码蛋白质仍具有AP2/ERF转录因子功能；或
[0014](d)、与SEQ ID NO. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸；或
[0015](e)、在SEQ ID NO. 1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代 或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有AP2/ERF转录因子的功能 或活性。
[0016] 本发明上述LcAP2/ERF107转录因子编码基因编码的AP2/ERF转录因子，其氨基酸 为（a)或（b)所示：
[0017](a)、SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸；
[0018] (b)、将SEQ ID NO. 2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有AP2/ERF转录因子功能或活性的蛋白变体。
[0019] 其中，SEQ ID NO. 2的氨基端第108至159位氨基酸残基序列为AP2/ERF结合域 的编码序列（SEQ ID NO. 3所示），该结合域第14位（第121位）氨基酸为丙氨酸（A)，第 19位（第126位）氨基酸为天冬氨酸（D)，此类结构域能够与GCC box顺式作用元件结合 而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达。
[0020] 本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本 领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备AP2/ERF转录因子的氨基酸序列变体或片段， 其中用于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸 残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。
[0021] 本发明所述的LcAP2/ERF107转录因子编码基因包括天然存在的序列和变体两种 形式。"变体"意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个 位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗 传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过 现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点 诱变所得到的仍编码SEQ ID NO. 2所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法 (例如DNA改组）。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核 苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达 的激活情况或转基因植物中表达的效应等。
[0022] 本发明将SEQ ID NO. 2所示的氨基酸（LcAP2/ERF107转录因子）与拟南芥、水稻 的同源AP2/ERF的氨基酸序列进行多序列比对，构建进化树，结果表明LcAP2/ERF107与拟 南芥单独亚家族（Soloist)的At4gl3040同源关系最近。因此，LcAP2/ERF107是单独亚家 族的新基因。
[0023] 本发明还公开了含有所述LcAP2/ERF107转录因子编码基因的重组表达载体以及 含有所述重组表达载体的重组宿主细胞；其中，所述重组表达载体是重组植物表达载体。
[0024] 将所述LcAP2/ERF107转录因子编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到 可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5'端非 编码区，SEQ ID NO. 1所示的核苷酸和3'非编码区组成；其中，所述的5'端非编码区可以 包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱 导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3'非编码区可以包含终止子序列、mRNA切 割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱 合成酶终止区。
[0025]另外，本领域技术人员可以将SEQ ID NO. 1所示的核苷酸进行优化以增强在植物 中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目 标植物中的表达效率。
[0026] 所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因，用于选择 经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的 基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如(6-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。
[0027] 本发明还涉及将所述的LcAP2/ERF107转录因子编码基因引入到植物中以提高植 物对逆境胁迫的抗性。
[0028] 本发明公开了一种提高植物对逆境胁迫抗性的方法，包括以下步骤：（1)构建含 有从百脉根中分离的LcAP2/ERF107转录因子编码基因的重组植物表达载体；（2)将所构建 的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；(3)培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的 转基因植物。
[0029] 本发明还公开了一种培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种的方法，包括以下步 骤：（1)构建含有从百脉根中分离的LcAP2/ERF107转录因子编码基因的重组植物表达载 体；（2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；(3)培育筛选得到对逆境 胁迫抗性提尚的转基因植物新品种。
[0030] 其中，所述的逆境胁迫包括：高盐、干旱或低温。
[0031] 转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物（单 子叶植物或双子叶植物）或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞 的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击 等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的LCAP2/ERF107转录因子编码 基因提供给植物。在其它实施方案中，本发明的LcAP2/ERF107转录因子编码基因可通过 将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的LcAP2/ ERF107转录因子编码基因构建体引入病毒DNA或RNA分子中。