隔3-4d浇灌，7-15d后观察，取样，统计存活率，进行生理指标 检测。
[0171] (3)转基因拟南芥在盐胁迫条件下的生理生化指标测定
[0172] 相对含水量的测定：
[0173] 对NaCl胁迫处理后的转基因和野生型拟南芥，用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干表 面水分。每个处理取3棵单株，并迅速测其鲜重，之后放入120°C烘箱中烘烤30min，80°C烘 烤24h至恒重，称量其干重。对上述测得的干、鲜重，采用公式：相对含水量（占鲜重％ )= (鲜重-干重）/鲜重进行含水量的计算。
[0174] 相对电导率分析：
[0175] 称取经胁迫处理的拟南芥叶片0.2g于IOml EP管中，加入5ml去离子水，自然浸 泡lh，之后测定电导率Jl并记录，然后放入沸水浴中煮沸lOmin，冷却至室温测电导率J2 并记录。
[0176] 相对电导率的计算公式：相对电导率=(Jl-JO) AJ2_J0) X 100%
[0177](注：JO表示去离子水的电导率值）。
[0178] 2实验结果
[0179] 2. 1植物表达载体的构建
[0180] 2. I. 1植物表达载体pH7WG2D-LcAP2/ERF107的构建流程
[0181] 植物表达载体pH7WG2D-LcAP2/ERF107的构建流程见图6。
[0182] 2. 1. 2重组质粒的PCR鉴定
[0183] 在重组质粒的转化LB(Spe+)平板上，分别挑取10个白色单菌落，进行菌落PCR 鉴定，结果有1个阳性克隆，提取阳性克隆的质粒，用基因LcAP2/ERF107的上、下游引物 (表1)和35S上游引物（35S-F :5' -GACGCACAATCCCACTATCC-3'）和目的基因的下游引物 (LcAP2/ERF107-R)进行PCR鉴定，结果见图7,都扩增出了目的条带，说明植物表达载体构 建正确。
[0184] 2. 2含有表达载体的农杆菌鉴定
[0185] 将重组质粒pH7GW2D-LcAP2/ERF107转化农杆菌GV3101，以转化后的农杆菌的菌 液为模板，未转化的农杆菌作阴性对照，质粒做阳性对照，进行菌液PCR鉴定。结果可见图 8,10个单菌落都是阳性克隆，说明该重组质粒已成功转入农杆菌中。
[0186] 2. 3转基因LcAP2/ERF107拟南芥阳性苗的鉴定
[0187] 2. 3. I DNA 水平的 PCR 检测
[0188] 选取潮霉素抗性苗，剪取其叶片，采用CTAB法提取其DNA，以拟南芥基因组DNA为 模板，以35S-F和LcAP2/ERF107-R为引物，采用PCR技术，对潮霉素抗性苗进行DNA水平的 检测。结果见图9,共检测出了 22株阳性苗，这表明基因LcAP2/ERF107已经整合到拟南芥 基因组中。
[0189] 2. 3. 2 RNA 水平的 PCR 检测
[0190] 随机选取DNA水平鉴定的3株阳性拟南芥植株叶片为材料，提取总RNA，以反转录 获得的cDNA为模板，RT-PCR对阳性苗作进一步的检测。结果见图10,3株都为阳性，这说 明基因LcAP2/ERF107能够在拟南芥中进行正常转录表达从而发挥正常的调控功能。
[0191] 2. 4转基因拟南芥种子在盐胁迫下发芽率实验
[0192] 将野生型和转基因LcAP2/ERF107拟南芥种子分别铺在含有0、100、150和200mM NaCl的MS平板上，培养10d，结果见图11，转基因LcAP2/ERF107拟南芥种子在150mMNaCl 的MS培养基中，发芽率为80 %，极显著地比野生型45 %的发芽率高，并且在200mMNaCl的 MS培养基中，结果也极显著，转基因种子萌发率为50%，而野生型的发芽率骤降至5%，说 明转基因LcAP2/ERF107拟南芥种子显著提高了对高盐的抗性。
[0193] 2. 5转基因拟南芥幼苗在盐胁迫下存活率实验
[0194] 三周龄的拟南芥幼苗，用300mM NaCl浇透，每隔一周浇一次盐水，共浇3次，周期 21d，在此过程中时常注意观察表型，统计存活率。由图12看出，高盐胁迫处理21d时，野生 型和转基因LcAP2/ERF107拟南芥的表型差异显著，95%的野生型拟南芥叶片干枯、植株死 亡，而95%的转基因拟南芥叶片仍是绿色，植株存活率为95 %。可见，在高盐持续胁迫下， 转基因拟南芥具有极显著的耐盐表型，说明转录因子LcAP2/ERF107显著提高了转基因植 株的耐盐性，因此，转录因子LcAP2/ERF 107是百脉根AP2/ERF家族中优良的耐盐调控因子。
[0195] 2. 6转基因拟南芥在盐胁迫条件下的生理生化指标测定
[0196] 在逆境胁迫下，植物体内会发生一系列复杂的生理生化变化，来适应或抵御外 界环境造成的伤害，因此，本实验测量了盐处理、未处理的野生型和转基因LcAP2/ERF107 拟南芥中的抗逆生理指标，相对含水量和电导率，由图13A看出，在正常条件下，转基因 LcAP2/ERF107拟南芥和野生型的相对含水量无显著差别，在高盐胁迫下，野生型相对含水 量降低至70%，而转基因的相对含水量保持在85%，极显著地比野生型的含水量高，这与 表型结果也一致；由图13B看出，在正常条件下，转基因LcAP2/ERF107和野生型的电导率在 20%左右，在高盐胁迫下，野生型电导率升至90%，转基因的电导率为45%，极显著地比野 生型低。说明转基因LcAP2/ERF107拟南芥是通过提高相对含水量和降低细胞膜的损伤程 度提高耐盐性的。
【主权项】
1. 从百脉根（LotuscorniculatusL.)中分离的AP2/ERF转录因子编码基因，其特征 在于，其多核苷酸为（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a)、SEQIDNO. 1所示的多核苷酸；或 (b) 、编码SEQIDNO. 2所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、与SEQIDNO. 1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷 酸所编码蛋白质仍具有AP2/ERF转录因子功能；或 (d) 、与SEQIDNO. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸；或 (e) 、在SEQIDNO. 1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插 入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有AP2/ERF转录因子的功能或活 性。2. 权利要求1所述编码基因编码的AP2/ERF转录因子，其特征在于，其氨基酸为（a)或 (b)所示： (a)、SEQIDNO. 2所示的氨基酸； (b) 、将SEQIDNO. 2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有AP2/ERF转录因子功能或活性的蛋白变体。3. 与顺式作用元件结合而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达的AP2/ERF转录 因子的结构域，其特征在于：其氨基酸序列为SEQIDNO. 3所示。4. 含有权利要求1所述编码基因的重组表达载体；优选的，所述重组表达载体是重组 植物表达载体。5. 含有权利要求4所述重组表达载体的重组宿主细胞。6. 权利要求1所述的编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用。7. 按照权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1)构建含有权利要求1 所述编码基因的重组植物表达载体；（2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物 细胞中；（3)培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物。8. -种培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1) 构建含有权利要求1所述编码基因的重组植物表达载体；（2)将所构建的重组植物表达载 体转化到植物或植物细胞中；(3)培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品 种。9. 权利要求2所述的AP2/ERF转录因子或权利要求3所述的结构域在提高植物对逆境 胁迫抗性中的应用。10. 按照权利要求6、7或9所述的应用，其特征在于，所述的逆境胁迫包括：高盐胁迫、 干旱胁迫或低温胁迫。
【专利摘要】本发明公开了百脉根AP2/ERF转录因子及其编码基因和应用，属于AP2/ERF转录因子及应用领域。本发明首先公开了从百脉根中分离的AP2/ERF转录因子基因，其核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1所示，所编码蛋白的氨基酸序列为SEQ？ID？NO.2所示。本发明还公开了能够与顺式作用元件结合而启动抗逆应答基因表达的AP2/ERF转录因子结构域，其氨基酸序列为SEQ？ID？NO.3所示。功能转化实验证明，在植物中过表达AP2/ERF转录因子基因能够显著提高转基因植株的耐盐性，说明其所编码蛋白具有AP2/ERF转录因子的功能。本发明AP2/ERF转录因子基因在提高植物对逆境胁迫的抗性中有重要应用前景。
【IPC分类】C12N15/29, C07K14/415, C12N5/10, C12N15/82, A01H5/00
【公开号】CN105175522
【申请号】
【发明人】许建新, 吴燕民, 雷江丽, 孙占敏, 李诗刚, 周美亮, 赵亮, 李金博, 唐益雄
【申请人】深圳市铁汉生态环境股份有限公司, 中国农业科学院生物技术研究所, 深圳市中国科学院仙湖植物园
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月26日