门51d，其中，第一阀门51a和第三阀门51c相互导通并且在两者中间设置第一接口 511，第二阀门51b和第四阀门51d相互导通并且在两者中间设置第二接口 512。
[0029]所述分管路52包括与所述第一阀门51a连接的第一分管路52a，与所述第二阀门51b连接的第二分管路52b，与所述第三阀门51c连接的第三分管路52c，与所述第四阀门51d连接的第四分管路52d，其中，所述第一分管路52a和第四分管路52d的另一端相互连接形成第三接口 521，第二分管路52b和第三分管路52c的另一端相互连接形成第四接口522 ;还包括第五分管路52e，其两端分别与所述第一接口 511和第二接口 512连接，并且该第五分管路52e将所述灌流液瓶2、蠕动栗3和膜式氧合器4串接起来；还进一步包括连接所述第三接口 521和培养罐I的第一端口 12的第六分管路52f，以及连接所述第四接口 522和培养罐I的第二端口 13的第七分管路52g。
[0030]进一步地，所述第一阀门51a、第二阀门51b、第三阀门51c和第四阀门51d的开、闭状态影响了该微重力悬浮培养动物细胞的系统中液体培养基的流动方向，具体情况如下:
[0031](I)如图1所示，假设所述蠕动栗3驱动液体培养基向左流动，所述第一阀门51a和第二阀门51b处于打开状态，所述第三阀门51c和第四阀门51d处于关闭的状态；该系统中的液体培养基从所述灌流液瓶2 —侧流出，沿所述第五分管路52e经过所述膜式氧合器4后通过所述第一接口 511进入所述第一分管路52a，再通过所述第三接口 521进入所述第六分管路52f并且进一步通过所述第一端口 12灌入所述培养罐I中；所述培养罐I内满溢的液体培养基从所述第二端口 13流出进入所述第七分管路52g，通过所述第四接口 522进入所述第二分管路52b，进一步通过所述第二接口 512再次进入所述第五分管路52e，直到回流到所述灌流液瓶2，以此完成一轮循环(参考虚线箭头指示的循环路线)。
[0032](2)如图2所示，假设所述蠕动栗3驱动液体培养基向左流动，所述第一阀门5Ia和第二阀门51b处于关闭状态，所述第三阀门51c和第四阀门51d处于打开的状态；该系统中的液体培养基从所述灌流液瓶2 —侧流出，沿所述第五分管路52e经过所述膜式氧合器4后通过所述第一接口 511进入所述第三分管路52c，再通过所述第四接口 522进入所述第七分管路52g并且进一步通过所述第二端口 13灌入所述培养罐I中；所述培养罐I内满溢的液体培养基从所述第一端口 12流出进入所述第六分管路52f，通过所述第三接口 521进入所述第四分管路52d，进一步通过所述第二接口 512再次进入所述第五分管路52e，直到回流到所述灌流液瓶2，以此完成一轮循环(参考虚线箭头指示的循环路线)。
[0033]进一步地，采用本发明的系统培养由改良原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞，具体操作流程如下:
[0034]将已分离的猪肝细胞在方瓶中进行平面培养，待平面生长的猪肝细胞长到对数生长期，用0.25%胰酶消化，生理盐水洗涤3次，离心收集细胞，计数，悬浮于15g/L的海藻酸钠溶液中，利用微囊静电液滴发生器喷入0.lmol/L CaCl2S液中，形成海藻酸钙胶珠，然后用0.5g/L多聚赖氨酸包裹，再与1.5g/L的海藻酸钠溶液反应，最后用55mmol/L柠檬酸钠溶液处理，获得微囊化的猪肝细胞la。将制备好的微囊化猪肝细胞Ia于37°C，体积分数5% CO2的培养箱中继续培养。
[0035]在无菌超净台内完成所述微重力悬浮培养动物细胞的系统的循环管路5的连接，收集各方瓶中微囊包裹的猪肝细胞la，血球细胞计数板计数，待细胞总数约19?10 10,台盼蓝染色细胞活力大于95%后，将微囊细胞悬液加入到所述培养罐I中(如图1和图2所示)，驱动所述蠕动栗3向所述培养罐I中缓缓注入液体培养基。当该系统内的管道因为液体培养基的填充而排尽空气后，将所述整个系统搬到已经过紫外线消毒过的孵箱里，在37°C、5% 0)2培养箱内连接所述膜式氧合器4，接通含50%氧气的混合气体，开始猪肝细胞的微重力悬浮培养。所述培养罐I的搅拌装置的旋转速度维持在30?80r/min。每24小时更换新鲜的液体培养基500ml，更换培养基时，停止所述蠕动栗3和培养罐I的搅拌装置，将所述培养罐I置于灭菌超净台中，更换装有新鲜液体培养基的所述灌流液瓶2。
[0036]操作中需要取样检测时将所述培养罐I置于灭菌超净台中，用75%酒精棉球擦拭取样口 15的外盖，旋开所述取样口 15的外盖，接入5ml注射器，待所述微囊化猪肝细胞Ia尽可能在所述培养罐I中分布均匀后抽取Iml样品。然后，待所述微囊化猪肝细胞Ia下沉后抽取5ml细胞培养上清样品，75%酒精棉签擦拭取样口 15，盖上取样口 15的外盖，再用75%酒精棉签擦拭取样口 15的外盖，将所述培养罐I放回二氧化碳孵箱中，重新安装循环管路，开启蠕动栗3和搅拌装置，继续猪肝细胞的培养。取样过程要避免在整个系统内产生气泡，若产生气泡需要用注射器及时抽出。
[0037]综上所述，本发明微重力悬浮培养动物细胞的系统有效增加培养罐内物质交换效率，提高细胞培养质量。
[0038]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种微重力悬浮培养动物细胞的系统，其包括为动物细胞提供生长场所的培养罐、为所述培养罐提供氧气的供氧器、储存培养基的灌流液瓶、用于驱动所述培养基在该系统内流动的蠕动栗，以及将所述培养罐、供氧器、灌流液瓶和蠕动栗导通连接的循环管路，其特征在于:所述培养罐设置有两个相对的用于灌注培养基的端口 ；该培养罐罐体内部靠近所述端口处设有筛网。2.如权利要求1所述的微重力悬浮培养动物细胞的系统，其特征在于:所述筛网的孔径为50?500微米。3.如权利要求2所述的微重力悬浮培养动物细胞的系统，其特征在于:所述筛网由混合纤维素酯滤膜制成，所述滤膜的膜厚为0.22微米。4.如权利要求1所述的微重力悬浮培养动物细胞的系统，其特征在于:所述培养罐开设有取样口，该取样口的口径为4?8毫米。5.如权利要求1所述的微重力悬浮培养动物细胞的系统，其特征在于:所述培养罐为微囊化细胞旋转培养罐。6.如权利要求1所述的微重力悬浮培养动物细胞的系统，其特征在于:所述供氧器为膜式氧合器。7.如权利要求1所述的微重力悬浮培养动物细胞的系统，其特征在于:所述循环管路包括阀门组件和多条通过该阀门组件导通所述培养罐、供氧器、灌流液瓶和蠕动栗分管路。8.如权利要求7所述的微重力悬浮培养动物细胞的系统，其特征在于:所述阀门组件包括第一阀门、第二阀门、第三阀门和第四阀门，其中，第一阀门和第三阀门相互导通并且在两者中间设置第一接口，第二阀门和第四阀门相互导通并且在两者中间设置第二接口。9.如权利要求8所述的微重力悬浮培养动物细胞的系统，其特征在于，所述分管路包括:与所述第一阀门连接的第一分管路，与所述第二阀门连接的第二分管路，与所述第三阀门连接的第三分管路，与所述第四阀门连接的第四分管路，其中，所述第一分管路和第四分管路的另一端相互连接形成第三接口，第二分管路和第三分管路的另一端相互连接形成第四接口 ；还包括第五分管路，其两端分别与所述第一接口和第二接口连接，并且该第五分管路将所述灌流液瓶、蠕动栗和供氧器串接起来；还包括连接所述第三接口和培养罐的第六分管路，以及连接所述第四接口和培养罐的第七分管路。
【专利摘要】本发明公开一种微重力悬浮培养动物细胞的系统，其包括为动物细胞提供生长场所的培养罐、为所述培养罐提供氧气的供氧器、储存培养基的灌流液瓶、用于驱动所述培养基在该系统内流动的蠕动泵，以及将所述培养罐、供氧器、灌流液瓶和蠕动泵导通连接的循环管路，其中，所述培养罐设置有两个相对的用于灌注培养基的端口；该培养罐罐体内部靠近所述端口处设有筛网。本发明微重力悬浮培养动物细胞的系统有效增加培养罐内物质交换效率，提高细胞培养质量。
【IPC分类】C12M1/04, C12M3/02, C12M3/06
【公开号】CN105176818
【申请号】
【发明人】蔡磊, 高毅, 李阳, 张志
【申请人】南方医科大学珠江医院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月14日