一种含有非天然氨基酸的漆酶、制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种含有非天然氨基酸的漆酶、制备方法及 应用。
【背景技术】
[0002] 漆酶（EC 1. 10. 3. 2)是一种含铜多酚氧化酶，在自然界中广泛存在。漆酶能够催 化多达250种不同的底物的氧化，包括酚类物质、多酚类物质、苯硫酚、多胺、生物色素、木 质素、染料大分子芳香化合物等。伴随着底物的氧化，漆酶可以将分子氧还原为水，不会产 生过氧化氢和活性氧等有害的中间产物。漆酶较宽松的底物特异性以及绿色环保的催化性 能，使其在纺织、造纸、环保、家具制造和食品生产等行业具有广阔的应用前景。
[0003]目前我国市场上成熟的漆酶均为真菌来源的漆酶。由于真菌漆酶需要进行翻译后 修饰，只能依靠筛选高产菌株自身表达或者使用真核表达系统进行重组表达，存在着生产 周期长、产量低、成本高等缺点，严重限制了漆酶的大规模产业化应用。
[0004] 相比现有的真菌漆酶，大肠杆菌漆酶CueO具有无需翻译后修饰、热稳定性好、可 大规模重组表达、生产周期短、产量高、成本低等优势，因此成为真菌漆酶的良好替代者。但 是CueO也存在着多酚氧化酶酶活较低和酶活依赖外源铜离子等，如果能解决CueO的这些 问题，将大大推动漆酶的大规模产业化应用。
[0005] 基因密码子扩展技术是近年来发展起来的一项蛋白修饰技术，利用琥珀终止密码 子来编码多种非天然氨基酸并在生物活体内将非天然氨基酸定点插入蛋白中。目前这一技 术已经将超过50种的非天然氨基酸成功地定点表达在活体细胞的蛋白质当中，并赋予了 这些蛋白质各种新颖的物理、化学和生理性质。
【发明内容】
[0006] 本发明是针对现有技术和产品的不足，利用基因密码子扩展技术，将可以结合铜 的非天然氨基酸定点插入到漆酶CueO中，从而提高漆酶CueO对铜离子的亲和力，并进而提 高漆酶CueO的漆酶酶活，改善漆酶CueO的外源铜离子依赖性。
[0007] 本发明采用如下技术方案：
[0008] -种含非天然氨基酸的漆酶CueO突变体，所述漆酶CueO的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1 ;所述漆酶CueO突变体为漆酶CueO的第106位的谷氨酸、第132位的天冬氨酸、第144 位的谷氨酰胺、第147位的赖氨酸、第354位的丝氨酸、第355位的甲硫氨酸、第408位的天 冬酰胺和第412位的甘氨酸中至少一个位点突变为非天然氨基酸。
[0009] 进一步的改进，所述非天然氨基酸为3 -吡唑酪氨酸（PyTyr)或8 -羟基喹啉丙氨 酸（HqAla)。
[0010] 其中，3 -吡唑酪氨酸的结构如下图所示：
[0011] CN 105176939 A 说明书 2/5 页
[0012] 其中，8 -羟基喹啉丙氨酸的结构如下图所示：
[0014] 进一步的改进，所述漆酶CueO突变体于大肠杆菌中表达。
[0015] -种利用表达漆酶CueO突变体的方法，包括如下步骤：
[0016] 1)根据漆酶CueO的氨基酸序列和蛋白空间结构，选择突变位点；
[0017] 2)使用定点突变PCR技术，将选定的突变位点的密码子突变为终止密码子；
[0018] 3)将突变的漆酶CueO基因序列构建到pET - 28c表达载体上；
[0019] 4)将漆酶CueO突变体表达载体与可特异性引入3 -吡唑酪氨酸的辅助质粒 pEVOL - tRNA - PyTyrRS或8 -羟基喹啉丙氨酸的辅助质粒pEVOL - tRNA - HqAlaRS共同转 化大肠杆菌BL21 (DE3)，在培养基中添加 IPTG、阿拉伯糖和非天然氨基酸进行CueO突变体 的诱导表达；
[0020] 5)将表达有目的蛋白的大肠杆菌收集后，超声破碎，并亲和纯化得到含非天然氨 基酸的漆酶CueO突变体。
[0021] 进一步的改进，所述终止密码子为琥珀密码子TAG。
[0022] 进一步的改进，突变的漆酶CueO基因序列由SEQ ID NO: 2中第316~318位的 GAA，第 394 ~396 位 GAT，第 430 ~432 位的 CAG，第 439 ~441 位的 AAA，第 1060 ~1062 位的TCT，第1063~1065位的ATG，第1222~1224位的AAC，第1234~1236位的GGT中 的至少一个替换为TAG形成。
[0023] -种含非天然氨基酸的漆酶CueO突变体于降解苯并芘的应用。
[0024] 与现有的技术相比，本发明中的漆酶CueO有如下优点：
[0025] 大肠杆菌漆酶CueO虽有无需翻译后修饰、热稳定性好、可大规模重组表达、生产 周期短、产量高、成本低等优势，但也存在着多酚氧化酶酶活较低和酶活依赖外源铜离子等 影响CueO大规模应用的缺点。大量的研究表明，CueO酶活低可能与其蛋白结构内Cu离子 占有率不高有关。因此，目前对CueO的定向改造主要是通过分析CueO的空间结构，对Cu 离子附近的氨基酸进行突变，筛选出高酶活的CueO突变体。但由于天然氨基酸对Cu离子 的结合能力一般，目前CueO的酶活提高都不能令人满意。本发明通过基因密码子扩展技术 将结合铜的非天然氨基酸定点插入到漆酶CueO中，提高了 CueO对铜离子的亲和力，增加了 CueO内部Cu离子的占有率，并进而提高了 CueO的漆酶酶活，改善了 CueO的外源铜离子依 赖性。
【附图说明】
[0026] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
[0027] 图1为CueO的晶体结构示意图，T1/T2/T3/T4分别表示CueO中发挥不同功能的 四个Cu离子；
[0028] 图2为根据实施例3得到的CueO - M355 - HqAla及CueO - WT的重组表达SDS - PAGE电泳图，其中：1为蛋白marker，2为CueO - M355 - HqAla，3为CueO - WT，箭头所示即 为大肠杆菌漆酶M355突变体及野生型；
[0029] 图3为根据实施例4得到的CueO各突变体的酶活检测结果；
[0030] 图4为根据实施例5得到的CueO突变体降解苯并芘的结果。
【具体实施方式】
[0031] 如下采用【具体实施方式】对本发明的技术方案进行进一步详细说明，但应当理解本 发明技术方案不限于以下所列举【具体实施方式】，任何根据本发明的原理所做的改变或替代 都应当落入本发明的范围之内。
[0032] 本发明的说明书，尤其是实施例中所使用的材料、试剂、装置等，如没有特别地指 出，均是从商业可购得的或本领域常规使用的。
[0033] 实施例1 CueO突变体的构建
[0034] 根据PDB数据库中CueO的晶体结构信息（PDB ID :1N68,见图1)，分析可能与Tl/ T2/T4铜离子发生相互作用的氨基酸残基，选定漆酶CueO突变体由漆酶CueO的第106位 的谷氨酸、第132位的天冬氨酸、第144位的谷氨酰胺、第147位的赖氨酸、第354位的丝氨 酸、第355位的甲硫氨酸、第408位的天冬酰胺和第412位的甘氨酸，这几个突变位点。
[0035] 根据CueO的DNA序列（SEQ ID NO: 2)，分别设计能够使上述突变位点密码子突变 为琥珀密码子的引物，具体引物序列如下表所示。
[0036] 表1:突变引物列表
CN 105176939 A 兄明干ι 4/5 页
[0038] 利用定点突变PCR技术，以野生型CueO的DNA序列为模板，将E106、D132、Q144、 K147、S354、M355、N408和G412这几个位点的密码子突变为琥珀密码子TAG。
[0039] 将PCR得到的CueO突变体DNA分别插入pET - 28c质粒（Novagen，购自Merck Millipore)，得到突变体表达载体，测序验证突变成功。
[0040] 实施例2特异性引入非天然氨基酸辅助质粒的获得
[0041] 根据发明人之前提交的发明专利"3 -吡唑基酪氨酸翻译系统及其应用"（公开号 CN103571804A)和"8 -羟基喹啉丙氨酸翻译系统及其应用"（公开号CN104059891A)，获得 可特异性引入3 -吡唑酪氨酸的辅助质粒pEVOL - tRNA - PyTyrRS和可特异性引入8 -羟基 喹啉丙氨酸的辅助质粒pEVOL - tRNA - HqAl