一种在真核细胞内其稳定性受蓝光调控的光敏降解子desVVD的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因技术领域、生物化学领域、细胞生物学和生物物理学领域，涉及一 种在真核细胞内其降解速率和稳定性受蓝光调控的光敏蛋白质降解子。具体说，利用蓝光 提高光敏降解子在真核细胞内的稳定性，而在避光条件下该光敏降解子在真核细胞内发生 降解。融合该光敏降解子的融合蛋白质在真核细胞内的降解和稳定性同样受到蓝光调控。
【背景技术】
[0002] 基因敲除和RNA干扰技术是研究细胞内蛋白质功能最常用的方法。但是基因敲除 技术无法获得看家基因编码的蛋白质缺失的表型。RNA干扰技术在研究蛋白质功能中最大 的缺陷是对于稳定性高的蛋白质来说，编码的mRNA降解后，该蛋白质仍然在细胞内存在很 长时间。RNA干扰是一个催化过程，没有浓度依赖的关系。同时，RNA干扰存在明显的非特异 性，可能对其它细胞过程产生影响[Raina等J Biol Chem, 2010, 285 (15) :11057-11060]。 因此，目前对于研究看家基因编码的蛋白质的功能还没有特别有效和直接的方法。
[0003] 条件性控制蛋白质降解的蛋白质敲除技术是研究蛋白质功能最直接的方法。 目前已经报道的条件性控制蛋白质降解的方法主要有两种方式：温度控制[Dohmen等 ，Science, 1994, 263 (5151) : 1273-1276]、化学小分子控制[Schneekloth 等，J Am Chem Soc. 2004,126(12) :3748-3754 ;Nishimura 等，Nature Methods. 2009,6(12):917-U978 ; Pratt 等，P Natl Acad Sci USA. 2007, 104 (27) : 11209-11214 ;Banaszynski 等，Cell. 2006,126(5):995-1004 ;Iwamoto, Chem Biol. 2010, 17(9):981-988 ;Bonger 等，Nat Chem Biol. 2011，7(8) :531-537]。温度控制蛋白质降解的方法最大的缺陷在于温 度的改变可能较大程度地改变细胞的表型，因而难以区分表型的改变是由于温度改变引起 还是蛋白质降解引起的。
[0004] 化学小分子控制蛋白质降解的方法有以下几种方法：①化学小分子控制蛋白质泛 素的发生进而控制革巴标蛋白质降解[Schneekloth等，J Am Chem Soc. 2004, 126 (12) : 3748- 3754Nishimura 等，Nature Methods. 2009, 6 (12) :917_U978];②化学小分子控制蛋白质二 聚化，引起断裂泛素的重组，进而导致泛素碳端连接的蛋白被切割分离，切割分离下来的蛋 白质片段保持稳定，而不含化学小分子的情况下，整个融合蛋白在氮端降解子的作用下降 解[Pratt 等，P Natl Acad Sci USA. 2007, 104(27) :11209-11214];③不稳定的蛋白质在化 学小分子作用下保持稳定[Banaszynski 等，Cell. 2006, 126 (5) :995-1004 ;Iwamoto, Chem Biol. 2010, 17(9) :981-988];④稳定的蛋白质在化学小分子诱导下暴露降解肽发生降解 [Bonger等，Nat Chem Biol. 2011，7 (8) :531-537]。不过，依赖蛋白质相互作用的方式，需要 表达两个复杂的融合蛋白，因此在应用上存在一定的限制。目前真正将蛋白质敲除技术应 用于基因功能发现或控制细胞生理的只有③这种方法。小分子化合物改变蛋白质稳定性的 过程是一个不可逆过程，尤其是在活体内，小分子化合物的清除严重依赖其代谢的速率。同 时该方法不具有空间分辨率。另外，可能要考虑到小分子化合物较高的成本，阻碍了该方法 的应用。
[0005] 光遗传学已经成为生命科学研究最炙手可热的一门新兴学科。光遗传学技术可 以实现快速地、时空地、非侵入地对系统进行扰动，已经在许多神经科学研究方面获得了 应用，包括光控制蛋白质相互作用、光控基因表达、光控信号转导、光控制蛋白质聚集、光控 蛋白质活性等方面。光、氧、电压敏感（LOV)结构域是一类对光响应的光敏蛋白结构域， 它们普遍存在于细菌、真菌和植物[Crosson等，Biochemistry. 2003, 42 (1) : 2-10]。LOV 结构域可以结合FAD或FMN、对蓝光敏感并发生光化学反应的半胱氨酸黄素加成产物，进 而发生结构域构象改变和/或二聚化[Crosson等，Plant Cell. 2002, 14(5) :1067-1075 ; Christie, Annual review of plant biology. 2007, 58:21-45] 〇
[0006] 最近，两个基于光遗传学的蛋白质降解调控方法相继获得了报道[Renicke 等，Chem Biol. 2013, 20 (4) : 619-626 ;Bonger 等，Acs Chem Biol. 2013]，这两个系统都是基 于一个原理，黑暗下Lov2屏蔽降解标签，而蓝光照射下，由于lov2上的J a螺旋解离，使降 解标签暴露，被蛋白酶体识别并降解。由于革巴标蛋白质在融合光敏蛋白1〇ν2的冋时还融合 了一个降解子，因此，该方法最大的缺陷在于无论在光照还是黑暗条件下靶标蛋白质的浓 度都发生了下降，同时靶标蛋白质的浓度在光照与黑暗下的区别并不是非常显著。
[0007] 来自于粗糙麦胞杆菌的vivid (VVD)是一类最小的LOV结构域，利用该结 构域构建的光遗传学方法具有响应快速、光灵敏度高、可逆性强、时空分辨率高、 细胞毒性低等优点，该光敏蛋白已经应用于蓝光控制基因表达系统[Wang等，Nat Methods. 2012, 9(3):266-U264]。
[0008] 本发明者首先发现野生型的VVD在真核细胞内其稳定性没有显著的差别，通过预 试验选择，优选稳定性受蓝光调节的一类VVD突变体，称为光敏蛋白质降解子desVVD (简称 光敏降解子）。在宿主细胞中，光敏降解子desWD在蓝光照射下保持稳定，而在避光处理 的环境中发生降解。将靶标蛋白融合在这类蛋白的氮端或碳端都会造成其在真核细胞内的 稳定性受到蓝光的调控。融合这类光敏降解子的靶标蛋白的降解调控具有显著的时空分辨 率。这类光敏降解子可以适用于酵母细胞、果蝇细胞、哺乳动物细胞内靶标蛋白质稳定性的 调控。这类光敏降解子已经成功使功能蛋白质的水平受蓝光的调控，从而完成了本发明。 [0009] 发明概述
[0010] 本发明的第一个目的是提供一种光敏降解子desVVD的编码基因。
[0011] 本发明的第二个目的是提供包含所述光敏降解子desVVD编码基因的质粒载体。
[0012] 本发明的第三个目的是提供所述光敏降解子desVVD编码基因编码的光敏降解子 desWD。
[0013] 本发明的第四个目的是提供所述光敏降解子desVVD的制备方法。
[0014] 本发明的第五个目的是提供所述光敏降解子desVVD与靶标蛋白的融合蛋白。
[0015] 本发明的第六个目的是提供所述光敏降解子desVVD与所述融合蛋白在真核宿主 细胞内的蛋白质水平的调控方法。
[0016] 本发明的第一个方面，提供一种光敏降解子desVVD的编码基因，所述编码基因是 在野生型VVD截去氮端36个氨基酸残基基础上至少含有Y50W突变的突变体的编码基因。
[0017] 优选地，所述编码基因选自序列表中的序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37 和 39 所示的基因。
[0018] 本发明的第二个方面，提供包含所述光敏降解子desVVD的编码基因的表达载体。
[0019] 本发明的第三个方面，提供所述编码基因编码的光敏降解子desVVD，其稳定性在 真核细胞内受蓝光调控。
[0020] 优选地，所述光敏降解子desVVD的序列选自序列表中的序列2、4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 和 40。
[0021] 本发明的第四个方面，提供光敏降解子desVVD的制备方法。
[0022] 光敏降解子desVVD的制备方法是利用大肠杆菌克隆菌株将光敏降解子desVVD的 编码基因构建到真核宿主细胞表达载体中，将该真核宿主细胞表达载体转染/转化真核宿 主细胞并表达光敏降解子desVVD。
[0023] 在构建的光敏降解子desVVD的真核宿主细胞表达载体基础上，设计突变引物，并 以此引物扩增包含突变序列的真核宿主细胞表达载体，环化后转化大肠杆菌克隆菌株，可 构建包含新的突变类型的光敏降解子desVVD的真核宿主细胞表达载体，进而表达并分离 纯化新的突变类型的光敏降解子desVVD。
[0024] 本发明的第五个方面，提供光敏降解子desVVD与靶标蛋白的融合蛋白，其中所 述革巴标蛋白选自 mCherry、SFGFP、Flue、Ura3-mCherry，His3-mCherry，Sir2-mCherry， Hst2_mCherry 和 mAZ-mCherry〇
[0025] 优选地，本发明的光敏降解子desVVD与靶标蛋白的融合蛋白中，所述靶标蛋白选 自mCherry、SFGFP和Fluc，所述融合蛋白分别为mCherry-desVVD融合蛋白、SFGFP-desVVD 融合蛋白和Fluc-desVVD融合蛋白。
[0026] 本发明的第六个方面，提供了光敏降解子desVVD或其与靶标蛋白的融合蛋白在 真核宿主细胞内的蛋白质水平的调控方法，即通过控制蓝光的强弱控制蛋白质水平的高 低，或通过不断切换光照和黑暗的光照条件使蛋白质水平发生大幅度振荡。
[0027] 发明详述
[0028] 野生型的VVD在真核宿主细胞内的稳定性在蓝光照射和避光两种条件下并没有 显著的差别。经过突变筛选，本发明提供了一系列在真核细胞内稳定性受蓝光调控的光敏 蛋白的突变体。
[0029] 本文所用术语"光敏蛋白质降解子"、或"光敏降解子"或"desVVD"，指一类在 真核宿主细胞内其稳定性受蓝光调控的光敏蛋白结构域，可以结合FAD或FMN、对蓝光 敏感并发生光化学反应的半胱氨酸黄素加成产物，进而发生结构域构象变化和/或二聚 化[Crosson 等，Plant Cell. 2002, 14(5):1067-1075 ;Christie，Annual review of plant biology. 2007, 58:21-45]。
[0030] 在蓝光照射下，光敏降解子desVVD在真核宿主细胞中保持稳定，而在避光处理的 环境中发生降解。
[0031] 本文所用术语"真核宿主细胞"指真核细胞，例如酵母细胞、果蝇细胞S2、哺乳动物 细胞HEK293和Hela，但不局限于这些种类的真核细胞。
[0032] 本文所用术语"革巴标蛋白"指可在真核细胞内表达的蛋白质，包含mCherry、SFGFP、 Flue、Ura3_mCherry、His3_mCherry、Sir2_mCherry、Hst2_mCherry、mAZ-mCherry 等，但不 局限于这些蛋白质。
[0033] 本文所用术语"融合蛋白"指光敏降解子desVVD与靶标蛋白融合而成的蛋白质， 其稳定性在真核细胞内受蓝光调控。
[0034] 本文所用术语"蛋白质水平"指在宿主细胞中光敏降解子desVVD或其与靶标蛋白 融合蛋白的蛋白质含量。
[0035] 本发明提供了一种光敏降解子desVVD的编码基因，所述编码基因是在野生型WD 截去氮端36个氨基酸残基基础上至少含有Y50W突变的突变体的编码基因，优选地，所述 编码基因选自序列表中的序列 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37 和39所不的基因。
[0036] 具体地说，本发明的编码基因选自序列1所示VVD(50)的编码基因、序列3所示的 WD(50,56)的编码基因、序列5所示VVD(50,71)的编码基因、序列7所示VVD(50,56,71)的 编码基因、序列9所示VVD (40, 50, 56, 71)的编码基因、序列11所示VVD (50, 56, 71，76)的编 码基因、序列13所示VVD (40, 50, 56, 71，76)的编码基因、序列15所示VVD (48, 50, 56, 71)的 编码基因、序列17所示VVD (50, 51，56, 71)的编码基因、序列19所示VVD (48, 50, 51，56, 71) 的编码基因、序列21所示VVD (48, 50, 52, 56, 71)的编码基因、序列23所示 VVD(48, 50, 55, 56, 71)的编码基因、序列25所示VVD(50, 51，55, 56, 71)的编码基因、序 列 27 所示 VVD (48, 50, 51，52, 56, 71)的编码基因、序列 29 所示 VVD (48, 50, 51，55, 56, 71) 的编码基因、序列31所示VVD (48, 50, 51，52, 55, 56, 71)的编码基因、序列33所示 VVD (48, 50, 56, 67, 71)的编码基因、序列35所示VVD (48, 50, 55, 56, 67, 71)的编码基因、序 列 37 所示 VVD (48, 50, 51，52, 56, 67, 71)的编码基因和序列 39 所示 VVD (50, 56, 69, 71)的 编码基因。
[0037] 本发明提供了一类包含所述光敏降解子desVVD的编码基因的质粒载体（见下表 1)。
[0038] 表 1
CN 105177023 A 说明书 5/27 页
[0040]
[0041] 本发明提供了一种由所述编码基因编码的光敏降解子desVVD，其序列选自序列表 中的序列 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 和 40。所述光敏降 解子desVVD的稳定性在真核细胞内受蓝光调控。在蓝光照射下，真核宿主细胞中的光敏降 解子desWD保持稳定，在黑暗下，光敏降解子desWD发生降解。
[0042] 本发明提供的光敏降解子desVVD是粗糙麦胞杆菌的VVD至少包括Y50W突变的突 变体，还可以包含 Y40E、M48E、L51A、I52S、M55A、N56K、V67A、C71V、C76A 等突变的突变体， 或是这些突变位点的两个、三个、四个、五个、六个、七个随机组合而成的突变体。但是突变 不局限于在这些突变位点上，突变后的氨基酸残基也不局限于给定的氨基酸残基，突变位 点的总数也不局限于七个。
[0043] 本发明提供了制备稳定的光敏降解子desVVD的方法。利用大肠杆菌克隆菌株将 光敏降解子desVVD的编码基因构建到真核宿主细胞表达载体中，将该真核宿主细胞表达 载体转染/转化真核宿主细胞并表达光敏降解子desVVD。
[0044] 本发明提供的制备光敏降解子desVVD的方法中，在构建的表达截去氮端36个氨 基酸残基的野生型VVD或是已知的一种突变类型的光敏降解子desVVD的真核宿主细胞表 达载体基础上，设计突变引物，并以此引物扩增包含突变序列的真核宿主细胞表达载体，环 化后转化大肠杆菌克隆菌株，构建包含新的突变类型的光敏降解子desVVD的真核宿主细 胞表达载体，表达并分离纯化新的突变类型的光敏降解子desVVD。
[0045] 本发明提供了靶标蛋白与光敏降解子desVVD融合的融合蛋白，其稳定性在真核 细胞内受蓝光调控。在蓝光照射下，真核宿主细胞中的靶标蛋白与光敏降解子desVVD融合 的蛋白保持稳定，在黑暗下，该融合蛋白发生降解。
[0046] 本发明提供的靶标蛋白与光敏降解子desVVD融合的融合蛋白中，靶标蛋白可选 自 mCherry、SFGFP、Flue、Ura3_mCherry, His3_mCherry, Sir2_mCherry, Hst2_mCherry 和 mAZ-mCherry〇
[0047] 在一个优选实施方案中，提供了红色突光蛋白mCherry与光敏降解子desVVD融合 的mCherry-desVVD融合蛋白，所述融合蛋白在宿主细胞内的蛋白质水平受蓝光调控。
[0048] 在另一个优选实施方案中，提供了绿色荧光蛋白SFGFP与desVVD融合的 SFGFP-desVVD融合蛋白，所述融合蛋白在宿主细胞内的蛋白质水平受蓝光调控。
[0049] 在另一个优选实施方案中，提供了荧光素酶Fluc与desVVD融合的Fluc-desWD 融合蛋白，所述融合蛋白在宿主细胞内的蛋白质水平受蓝光调控。