Fluc-desVVD则更加稳定。
[0373] 实施例18.真核细胞中mCherry-VVD(40, 50, 56, 71)的稳定性具有光照强度依赖 性
[0374] 参照实施例9的方法，蓝光照射强度分别设为0.0 OlW ·πι 2、0. 03W ·πι 2、0. 08W ·πι2、 0. 15W ·πι 2UW ·πι2,检测在不同光照强度照射下表达mCherry-VVD(40, 50, 56, 71)的细胞的 荧光值。图9A结果显示随着光照强度增强，荧光值不断增强，说明随着光照强度不断增强， mCherry-VVD(40, 50, 56, 71)的稳定性也在提高。
[0375] 按上面相同的方法检测表达mCherry-VVD(40, 50, 56, 71，76)的细胞的荧光值，图 9B表明随着光照强度不断增强，mCherry-VVD(40, 50, 56, 71，76)的稳定性也在提高。图9 的结果表明desVVD在宿主细胞中的稳定性具有明显的光照强度依赖性。
[0376] 实施例19.光敏降解子在果蝇细胞S2中的表达
[0377] 按照上面所述的方法将果蝇表达质粒载体转染果蝇细胞S2并在培养基中培养， 转染的果蝇细胞在蓝光照射的条件下培养24h，为了降低蓝光对果蝇细胞的毒性，蓝光采用 照射Is停29s间隔照射，光照强度仍然为0. 67W · m 2。由于本发明所使用的果蝇表达载体 的启动子是组成型启动子，例如ΡΑ?，因此在培养条件下不需要加入其它的诱导剂光敏降解 子可以表达。
[0378] 实施例20.在果蝇细胞中，mCherry_VVD(50, 56)的水平受到蓝光调控
[0379] 按照上面所述的方法将pAc5. 1-mCherry-VVD (50, 56)转染果蝇细胞S2,转染的果 蝇细胞在所述蓝光照射的条件下培养24h。之后将转染并蓝光处理的细胞平均分成两份，一 份继续光照处理，另一份用两层锡箔纸包裹避光处理，6-10h后离心收集细胞，并检测细胞 的红色荧光值。图IOA显示避光处理的果蝇细胞表达的mCherry-VVD (50, 56)显著低于光 照处理的样品，表明在黑暗处理的果蝇细胞S2中，mCherry-VVD(50, 56)发生降解。
[0380] 按上面相同的方法检测表达mCherry-VVD (50, 56, 71)的果蝇细胞分别经过光照 和黑暗处理后的荧光值（图10B)。图10的结果表明desVVD适用于果蝇细胞，在蓝光处理 下desWD稳定存在，而在黑暗下被降解。
[0381] 实施例21.光敏降解子在哺乳动物细胞中的表达
[0382] 按照上面所述的方法将pcdna3. 1-mCherry-VVD (50, 56)转染两块6孔板上的人肾 脏来源的转化细胞株HEK293。转染的细胞在蓝光处理（照射Is停29s)下，在含10% FBS 的DMEM培养基中培养。由于本发明所使用的哺乳动物细胞表达载体的启动子是组成型的， 例如CMV启动子，因而在不加入任何诱导剂的情况下光敏降解子可以表达。
[0383] 实施例22.在哺乳动物HEK293中，mCherry-VVD (50, 56)的水平受到蓝光调控
[0384] 按照上面所述的方法将pcdna3. 1-mCherry-VVD (50, 56)转染两块6孔板上的人肾 脏来源的转化细胞株HEK293,转染的细胞经过24h蓝光处理（照射Is停29s)，其中一块 继续蓝光照射处理，另一块避光处理。6-10h后，先用荧光显微镜（Nikon，日本）成像（图 11)，然后细胞用胰酶消化，消化后的细胞用酶标仪检测细胞的红色荧光值（如图12A)。而 单独表达mCherry的细胞经蓝光照射后，荧光并没有发生显著下降，此蓝光照射条件对哺 乳动物细胞无显著毒性。
[0385] 按上面相同的方法检测表达mCherry-VVD (50, 71)(图12B)和 mCherry-VVD (50, 56, 71)(图12C)的HEK293细胞分别经过光照和黑暗处理后的荧光值。图 11和图12表明在哺乳动物细胞中，desVVD在蓝光处理下desVVD稳定存在，而在黑暗下被 降解。
[0386] 实施例23.在哺乳动物HEK293中，Fluc-VVD (50, 71)的蛋白质水平受到蓝光调控
[0387] 按照上面所述的方法将pcdna3. I-Fluc-VVD (50, 71)转染两块6孔板上的人肾脏 来源的转化细胞株HEK293,转染的细胞经过24h蓝光处理（照射Is停29s)，其中一块继续 光照处理，另一块避光处理。6-10h后，经PBS洗涤一次后，裂解细胞检测裂解细胞中的Fluc 荧光素酶活力。每个样品取10 μ L三组平行的细胞裂解液到384白板中，加入20 μ L根据 荧光素酶检测试剂盒（promega)配制的Fluc反应工作液，立即在酶标下检测反应液的发光 值。根据发光值的高低即表征Fluc荧光素酶活力的高低。图13A的结果显示黑暗下表达 Fluc-VVD (50, 71)的细胞的细胞裂解液中，Fluc荧光素酶活力要显著低于蓝光处理的细胞 裂解液。
[0388] 按上面相同的方法检测表达Fluc-VVD (50, 56, 71)(图13B)的HEK293细胞 裂解液分别经过光照和黑暗处理后的Fluc的活力。在黑暗处理的哺乳动物细胞中， Fluc-VVD (50, 71)发生降解。图13的结果表明desVVD适用于哺乳动物细胞，在蓝光处理下 desVVD稳定存在，而在黑暗下被降解。
[0389] 实施例24.在哺乳动物Hela中，Fluc-VVD (50, 56)的蛋白质水平受到蓝光调控
[0390] 按照实施例17的方法将pcdna3. I-Fluc-VVD(50, 56)转染两块6孔板上的人宫 颈癌细胞Hela并检测在Hela细胞中的分别经蓝光和避光处理后Fluc的活力（图14)。 在黑暗处理的哺乳动物细胞癌细胞中，Fluc-VVD(50,56)发生降解，而在蓝光照射下， Fluc-VVD(50, 56)仍然保持在较高的浓度水平。图14结果表明desVVD适用于癌细胞中蛋 白质降解的调控。
[0391] 实施例25. Ura3-mCherry-VVD (50, 56, 71)的稳定性受蓝光调控
[0392] 按照上面所述的酵母细胞表达质粒载体转化酵母细胞的方法，将 pAGDH-Ura3-mCherry-VVD (50, 56, 71)转化酵母BY4742,参照实施例9的方法，通过检测红 色荧光值的方法表征Ura3-mCherry-VVD(50, 56, 71)的蛋白质水平，图15的结果表明在黑 暗处理的酵母细胞中，Ura3-mCherry-VVD(50,56,71)发生降解，而在蓝光处理的细胞中仍 然保持稳定。图15的结果表明融合靶标蛋白Ura3的融合蛋白的稳定性受蓝光调控。
[0393] 实施例 26. His3-mCherry-VVD (48, 50, 51，52, 55, 56, 71)的稳定性受蓝光调控
[0394] 按照上面所述的酵母细胞表达质粒载体转化酵母细胞的方法，将PGADH-His3-mCh erry-VVD (48, 50, 51，52, 55, 56, 71)转化酵母BY4742,参照实施例9的方法，通过检测红色 荧光值的方法表征His3-mCherry-VVD(48, 50, 51，52, 55, 56, 71)的蛋白质水平，图16的结 果表明在黑暗处理的酵母细胞中，His3-mCherry-VVD(48, 50, 51，52, 55, 56, 71)发生降解， 而在蓝光处理的细胞中仍然保持稳定。图16的结果表明融合靶标蛋白His3的融合蛋白的 稳定性受蓝光调控。
[0395] 实施例 27. Sir2-mCherry-VVD (48, 50, 56, 71)的稳定性受蓝光调控
[0396] 按照上面所述的酵母细胞表达质粒载体转化酵母细胞的方法，将pGADH-Sir2_mCh erry-VVD (48, 50, 56, 71)转化酵母BY4742,参照实施例9的方法，通过检测红色荧光值的方 法表征Sir2-mCherry-VVD(48, 50, 56, 71)的蛋白质水平，图17的结果表明在黑暗处理的酵 母细胞中，Sir2-mCherry-VVD(48, 50, 56, 71)发生降解，而在蓝光处理的细胞中仍然保持稳 定。图17的结果表明融合靶标蛋白Sir2的融合蛋白的稳定性受蓝光调控。
[0397] 实施例 28. Hst2-mCherry-VVD (50, 51，55, 56, 71)的稳定性受蓝光调控
[0398] 按照上面所述的酵母细胞表达质粒载体转化酵母细胞的方法，将PGADH-Hst2-mCh erry-VVD (50, 51，55, 56, 71)转化酵母BY4742,参照实施例9的方法，通过检测红色荧光值 的方法表征HSt2-mCherry-VVD(50, 51，55, 56, 71)的蛋白质水平，图18的结果表明在黑暗 处理的酵母细胞中，Hst2-mCherry-VVD(50, 51，55, 56, 71)发生降解，而在蓝光处理的细胞 中仍然保持稳定。图15的结果表明融合靶标蛋白Hst2的融合蛋白的稳定性受蓝光调控。
[0399] 实施例 29. mAZ-mCherry-VVD (50, 56, 71，76)的稳定性受蓝光调控
[0400] 按照上面所述的酵母细胞表达质粒载体转化酵母细胞的方法，将pGADH-mAZ-mChe rry-VVD (50, 56, 71，76)转化酵母BY4742,参照实施例9的方法，通过检测红色荧光值的方 法表征mAZ-mCherry-VVD (50, 56, 71，76)的蛋白质水平，图19的结果表明在黑暗处理的酵 母细胞中，mAZ-mCherry-VVD(50,56,71，76)发生降解，而在蓝光处理的细胞中仍然保持稳 定。图15的结果表明融合靶标蛋白mAZ的融合蛋白的稳定性受蓝光调控。
[0401] 实施例30.通过蓝光和避光的振荡处理，可以使mCherry-VVD(40, 50, 56, 71，76) 蛋白质的水平发生振荡
[0402] 参照实施例 9 的方法，取转化 pGADH-mCherry-VVD (40, 50, 56, 71，76)酵母 BY4742 菌株的细胞，按所述方法在蓝光照射下培养12h。然后采取避光处理6h，之后切换蓝光处理 6h，重复此步操作，共处理24h。在此过程中每2h-次取样检测细胞的红色荧光值。图20 的结果表明mCherry-VVD(40, 50, 56, 71，76)的蛋白质水平可以利用光照条件的切换发生 反复震荡。
[0403] 实施例31.蓝光光照强度可以控制mCherry-VVD (50, 56, 71)的蛋白质水平
[0404] 参照实施例9的方法，取转化pGADH-mCherry-VVD (50, 56, 71)酵母BY4742菌株 的细胞，按照所述方法在蓝光照射培养12h。然后平均分成五份，蓝光照射强度分别为最大 光照（0. 67W.m2)的 100%、12. 5%、6. 25%、3. 13%、0,继续培养 6h。图 21 的结果表明， mCherry-VVD(50, 56, 71)的蛋白质水平在不同的蓝光照射强度下可以维持在一定水平，照 射强度越强，蛋白质水平越高，并且非常稳定。
[0405] 实施例32. mCherry-VVD (40, 50, 56, 71)在避光条件下的降解具有空间分辨率
[0406] 参照实施例 9 的方法，取转化 pGADH-mCherry-VVD (40, 50, 56, 71)酵母 BY4742 菌 株的细胞，按所述方法在蓝光照射下培养12h。准备一瓶固体培养基，加热，待温度降至 50-60°C左右，加入培养的酵母（50ml的培养基加入1ml的菌液），混匀，倒在平板上，在光 照强度为〇. 67W · m 2的蓝光照射下，28°C培养箱中培养48h。将整个平板用黑色胶带封闭， 留下靠菌体底物的一面，贴上区域控制的胶面，只有字母部分可以透光（图22中的Mask)。 培养结束后，利用活体成像仪（Kodak，美国）对平板进行荧光成像，激发滤光片570nm，发射 滤光片670nm。图22的结果表明mCherry-VVD (40, 50, 56, 71)的降解严格受光调控，只有蓝 光直接照射的细胞的蛋白质才不会被降解，未被照射的细胞中的desVVD被降解。图22的 结果说明desVVD在细胞中的稳定性调控具有显著的空间分辨率。
[0407] 应该理解，在实施例或实验材料方法中所显示的成分用量、反应条件等数字或是 本申请说明书内容所使用的数字均为大约数值。因此，除非文中特别注明，本说明书的上述 数字参数均为近似值，可根据所需要获得的本发明结果而加以变化。并且，这些参数并非 用来限定与本发明申请专利范围均等的原理，而是应用正常的操作技术下所得到的较佳数 据。
[0408] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料及可以应用于本发明中。文中 所述的较佳实验方法与材料仅作为示范之用。
[0409] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用为参考。此外应该理解，在阅读了本 发明的上述内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同 样属于本申请所附权利要求书所限定的范围内。
【主权项】
1. 一种光敏降解子desVVD的编码基因，所述编码基因是在野生型VVD截去氮端36个 氨基酸残基基础上至少含有Y50W突变的突变体的编码基因。2. 如权利要求1所述的编码基因，所述编码基因选自序列表中的序列1、3、5、7、9、11、 13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37 和 39 所示的基因。3. -种包含权利要求1所述光敏降解子desVVD的编码基因的表达载体。4. 一种由权利要求1所述编码基因编码的光敏降解子desVVD，其稳定性在真核细胞内 受蓝光调控。5. 如权利要求4所述的光敏降解子desVVD，所述光敏降解子desVVD的序列选自序列 表中的序列 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 和 40。6. 权利要求4所述光敏降解子desVVD的制备方法，其特征在于：利用大肠杆菌克隆菌 株将光敏降解子desVVD的编码基因构建到真核宿主细胞表达载体中，将该真核宿主细胞 表达载体转染/转化真核宿主细胞并表达光敏降解子desVVD。7. 如权利要求6所述的制备方法，其中还包括：在构建的光敏降解子desVVD的真核宿 主细胞表达载体基础上，设计突变引物，并以此引物扩增包含突变序列的真核宿主细胞表 达载体，环化后转化大肠杆菌克隆菌株，构建包含新的突变类型的光敏降解子desVVD的真 核宿主细胞表达载体，表达并分离纯化新的突变类型的光敏降解子desVVD。8. 权利要求4所述光敏降解子desVVD与靶标蛋白的融合蛋白，其中所述靶标蛋白选 自mCherry、SFGFP、Flue、Ura3_mCherry,His3_mCherry,Sir2_mCherry,Hst2_mCherry和 mAZ-mCherry〇9. 如权利要求8所述的融合蛋白，其中所述革巴标蛋白选自mCherry、SFGFP和Flue,所 述融合蛋白分别为mCherry-desVVD融合蛋白、SFGFP-desVVD融合蛋白和Fluc-desVVD融 合蛋白。10. 权利要求4所述光敏降解子desVVD或权利要求8所述融合蛋白在真核宿主细胞内 的蛋白质水平的调控方法，其特征在于：通过控制蓝光的强弱控制蛋白质水平的高低，或通 过不断切换光照和黑暗的光照条件使蛋白质水平发生大幅度振荡。
【专利摘要】本发明提供了一种在真核细胞内其稳定性受蓝光调控的光敏降解子desVVD、该光敏降解子desVVD的编码基因、包含该编码基因的重组质粒载体。本发明提供了用该重组质粒载体制备光敏降解子desVVD或其突变体的方法，还提供了包含靶标蛋白融合该光敏降解子desVVD的融合蛋白。本发明的光敏降解子desVVD及融合该降解子的融合蛋白在真核细胞内的稳定性受蓝光调控。本发明提供通过蓝光控制或改变靶标蛋白在宿主细胞中的蛋白质水平的方法。该方法具有改变幅度大、蓝光灵敏度高、作用时间短、可恢复性强、细胞毒性小等优点。
【IPC分类】C07K19/00, C12N15/31, C12R1/645, C07K14/37, C12N15/81, C12N15/85
【公开号】CN105177023
【申请号】
【发明人】杨弋, 张文耀, 茅缪伟, 孙万圣, 冯秀英
【申请人】华东理工大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年5月30日