GCAAAGCTTGGAGTTGATTGT-3 '
[0138] Pl与gal4的AD结构域编码基因序列下游的25个核苷酸完全一致，P2与AD结构 域编码基因序列上游的25个核苷酸完全反向互补。采用Pl和P2引物，以pGADT7为模板， 按上面所述长片段的PCR条件扩增不含AD结构域编码基因序列的载体序列。用1%琼脂糖 凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子。按照 上面所述DNA片段5'端磷酸化反应然后自身环化反应的步骤，将环化的反应液转化大肠杆 菌克隆菌株Machl，通过提取质粒获得pGADH。
[0139] 2.构建酵母细胞表达载体pGADH-mCherry
[0140] 根据mCherry基因核苷酸序列设计以下引物：
[0141] 引物 P3 :5，-TTTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3，
[0142] 引物 P4 :5，-GACGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCA-3 '
[0143] P3含NcoI酶切位点（下划线CCATGG)，第10-11个核苷酸是添加的防止移码突 变的两个核苷酸，第12-27个核苷酸与mCherry基因的编码序列的5'端16个核苷酸完全 一致，P4含EcoRI酶切位点（下划线GAATTC)，第10-26个核苷酸与mCherry基因的编码 序列的3'端17个核苷酸（不包含终止密码子）完全反向互补。采用P3和P4引物，以含 mCherry基因的pcdna3. Ι-mCherry载体（本实验室原先构建并保存）中的mCherry基因 为模板，按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增mCherry基因。用1%琼脂糖凝胶电泳 分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用NcoI和 EcoRI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pGADH。用DNA纯化试剂盒（BBI)分别回收酶切 的载体和mCherry基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质 粒转化菌株Machl并培养，通过提取获得pGADH-mCherry质粒。
[0144] 3.构建酵母细胞表达载体pGADH-mCherry-VVD
[0145] 根据VVD基因核苷酸序列设计以下引物：
[0146] 引物 P5 :5，-CCCGAATTCCATACGCTCTACGCTCCC-3 '
[0147] 引物 P6 :5 ' -GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3 '
[0148] P5含EcoRI酶切位点（下划线GAATTC)，第10-27个核苷酸与VVD基因（不含1-36 个氨基酸编码基因序列）的编码序列的5'端18个核苷酸完全一致，P6含XhoI酶切位点 (下划线CTCGAG)，第10-25个核苷酸与VVD基因的编码序列的3'端16个核苷酸完全反向 互补。采用P5和P6引物，以含VVD基因的pET28a-VVD载体（本实验室原先构建并保存） 中的VVD基因为模板，按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增VVD基因。用1%琼脂糖 凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列 用EcoRI和XhoI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pGADH-mCherry。用DNA纯化试剂盒 (BBI)分别回收酶切的载体和VVD基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环， 取连接后的质粒转化菌株Machl并培养，通过提取获得pGADH-mCherry-VVD质粒。
[0149] 4.构建酵母细胞表达载体pGADH-mCherry-VVD (50)
[0150] 要将VVD第50位的Tyr突变成Trp (Y50W)，根据Trp的密码子TGG设计突变引物：
[0151] P7:5 ' -GGCTGGCTGATTCAGATTATGAA-3 '
[0152] P8:5，-CATAATGTCATAACCGCCGGGAG-3 '
[0153] P7的第4-6个核苷酸是Trp的密码子TGG，第7-23个核苷酸与VVD蛋白质51位及 下游氨基酸的编码基因序列的17个核苷酸完全相同。P8的序列与VVD蛋白质48位及上游 氨基酸的编码基因序列的23个核苷酸完全互补。采用P7和P8引物，以pGADH-mCherry-WD 为模板，按上面所述长片段的PCR条件扩增的载体序列。用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产 物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子。按照上面所述DNA片段5' 端磷酸化反应然后自身环化反应的步骤，将环化的反应液转化大肠杆菌克隆菌株Machl，通 过提取质粒获得 pGADH-mCherry-VVD (50)。
[0154] 以相同的突变体构建方法构建了以下表达其它VVD突变体的pGADH-mCherry-VVD 突变质粒载体，所用方法相同，但是所用的引物不同（以下引物对中，前者为正向引物，后 者为反向引物），模板质粒也可能不同。
[0155] pGADH-mCherry-VVD (5〇, 56)(含 Y5〇W，N56K 突变）：
[0156] 模板：pGADH-mCherry-VVD (50)
[0157] P9 :5, -CCAAACCCCCAAGTAGAAC-3，
[0158] PlO :5, -CCTCTTCATAATCTGAATCAG-3'
[0159] pGADH-mCherry-WD (50, 71)(含 Y50W，C7IV 突变）：
[0160] 模板：pGADH-mCherry-VVD (50)
[0161] Pll :5, -GTTGCTCTGATTCTGTGCGACC-3'
[0162] P12 :5，-TGACGTGTCAACAGGTCCCAG-3 '
[0163] pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)(含 Y50W，N56K，C7IV 突变）：
[0164] 模板：pGADH-mCherry-VVD (50, 56)
[0165] Pll :5, -GTTGCTCTGATTCTGTGCGACC-3'
[0166] P12 :5，-TGACGTGTCAACAGGTCCCAG-3 '
[0167] pGADH-mCherry-WD(40, 50, 56, 71)(含 Y40E，Y50W，N56K，C71V 突变）：
[0168] 模板：pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)
[0169] P13 :5，-GAAGCTCCCGGCGGTTATGACATT-3 '
[0170] P14 :5' -GAGCGTATGAGAACCGAATTCC-3'
[0171] pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71，76)(含 Y50W，N56K，C71V，C76A 突变）：
[0172] 模板：pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)
[0173] P15 :5，-GCTGACCTGAAGCAAAAAGAC-3，
[0174] P16 :5, -CAGAATCAGAGCAACTGACG-3'
[0175] pGADH-mCherry-WD (40, 50, 56, 71，76)(含 Y40E，Y50W，N56K，C71V，C76A 突变）：
[0176] 模板：pGADH-mCherry-WD (4〇, 5〇, 56, 7I)
[0177] P15 :5，-GCTGACCTGAAGCAAAAAGAC-3，
[0178] P16 :5, -CAGAATCAGAGCAACTGACG-3'
[0179] pGADH-mCherry-WD (48, 50, 56, 71)(含 M48E，Y50W，N56K，C71V 突变）：
[0180] 模板：pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)
[0181] P17 :5，-CAGAATCAGAGCAACTGACG-3 '
[0182] P18 :5, -CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3'
[0183] pGADH-mCherry-WD (50, 51，56, 71)(含 Y50W，L51A，N56K，C71V 突变）：
[0184] 模板：pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)
[0185] P19 :5' -GCTATTCAGATTATGAAGAGGCCAAACCCC-3'
[0186] P20 :5, -CCAGCCCATAATGTCATAACCG-3'
[0187] pGADH-mCherry-WD (48, 50, 51，56, 71)(含 M48E，Y50W，L51A，N56K，C71V 突变）：
[0188] 模板：pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)
[0189] P19 :5' -GCTATTCAGATTATGAAGAGGCCAAACCCC-3'
[0190] P18 :5, -CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3'
[0191] pGADH-mCherry-WD (48, 50, 52, 56, 71)(含 M48E，Y50W，I52S，N56K，C71V 突变）：
[0192] 模板：pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)
[0193] P21 :5, -CTGTCTCAGATTATGAAGAGGCC-3'
[0194] P18 :5, -CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3'
[0195] pGADH-mCherry-WD (48, 50, 55, 56, 71)(含 M48E，Y50W，M55A，N56K，C71V 突变）：
[0196] 模板：pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)
[0197] P22 :5, -CTGATTCAGATTGCTAAGAGGCCAAACCCC-3'
[0198] P18 :5, -CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3'
[0199] pGADH-mCherry-WD (50, 51，55, 56, 71)(含 Y50W，L51A，M55A，N56K，C71V 突变）：
[0200] 模板：pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)
[0201] P23 :5' -GCTATTCAGATTGCTAAGAGGCCAAACCCC-3'
[0202] P20 :5, -CCAGCCCATAATGTCATAACCG-3'
[0203] pGADH-mCherry-WD (48, 50, 51，52, 56, 71)(含 M48E，Y50W，L51A，I52S，N56K，C71V 突变）：
[0204] 模板：pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)
[0205] P24 :5' -GCTTCTCAGATTATGAAGAGGCCAAACCCC-3'
[0206] P18 :5, -CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3'
[0207] pGADH-mCherry-WD (48, 50, 51，55, 56, 71)(含 M48E，Y50W，L51A，M55A，N56K，C71V 突变）：
[0208] 模板：pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)
[0209] P23 :5, -GCTATTCAGATTGCTAAGAGGCCAAACCCC-3'
[0210] P18 :5, -CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3'
[0211] pGADH-mCherry-WD (48, 50, 51，52, 55, 56, 71)(含 M48E，Y50W，L51A，I52S，M55A， N56K，C71V 突变）：
[0212] 模板：pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)
[0213] P25 :5, -GCTTCTCAGATTGCTAAGAGGCCAAACCCC-3'
[0214] P18 :5, -CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3'
[0215] pGADH-mCherry-WD (48, 50, 56, 67, 71)(含 M48E，Y50W，N56K，V67A，C71V 突变）：
[0216] 模板：pGADH-mCherry-WD (48, 5〇, 56, 7I)
[0217] P26 :5 ' -CAGGTCCCAGTTCTACTTGG-3 '
[0218] P27 :5, -CTGACACGTCAGTTGCTCTG-3'
[0219] pGADH-mCherry-WD (48, 50, 55, 56, 67, 71)(含 M48E，Y50W，M55A，N56K，V67A，C7IV 突变）：
[0220] 模板：pGADH-mCherry-WD (48, 50, 55, 56, 67, 71)
[0221] P26 :5' -CAGGTCCCAGTTCTACTTGG-3'
[0222] P27 :5, -CTGACACGTCAGTTGCTCTG-3'
[0223] pGADH-mCherry-WD (48, 50, 51，52, 56, 67, 71)(含 M48E，Y50W，L51A，I52S，N56K， V67A，C71V 突变）：
[0224] 模板：pGADH-mCherry-WD (48, 50, 51，52, 56, 71)
[0225] P26 :5' -CAGGTCCCAGTTCTACTTGG-3'
[0226] P27 :5, -CTGACACGTCAGTTGCTCTG-3'
[0227] pGADH-mCherry-WD (50, 56, 69, 71)(含 Y50W，N56K，T69W，C7IV 突变）：
[0228] 模板：pGADH-mCherry-WD (50, 56, 71)
[0229] P28 :5, -TGGTCAGTTGCTCTGATTCTGTGCG-3'
[0230] P29 :5' -GTCAACAGGTCCCAGTTCTAC-3'
[0231] 实施例 2. pGADH-Fluc-WD (50, 56)的构建
[0232] 根据Fluc基因核苷酸序列设计以下引物：
[0233] 引物 P30 :5，-GAACCATGGAAGACGCCAAAAAC-3，
[0234] 引物 P31 :5 ' -CCCGAATTCCACGGCGATCTTTCCG-3 '
[0235] P30含NcoI酶切位点（下划线CCATGG)，第5-23个核苷酸与Fluc基因的编码序列 的5'端18个核苷酸完全一致，P31含EcoRI酶切位点（下划线GAATTC)，第10-25个核苷 酸与Fluc基因的编码序列的3'端16个核苷酸（不包含终止密码子）完全反向互补。采用 P30和P31引物，以含Fluc基因的pcdna3. I-Fluc载体（本实验室原先构建并保存）中的 Fluc基因为模板，按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增Fluc基因。用1%琼脂糖凝胶 电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用NcoI 和EcoRI双酶切，同时用此二酶双酶切质粒pGADH-mCherry-VVD (50, 56)。用DNA纯化试剂盒 (BBI)分别回收酶切mCherry基因序列，用1 %琼脂糖凝胶电泳分离酶切的载体，纯化回收 较大的片段即为酶切的载体（此时不含mCherry基因），按上面所述酶切后连接方法将二者 连接成环，取连接后的质粒转化菌株Machl并培养，通过提取获得pGADH-Fluc-VVD (50, 56) 质粒。
[0236] 同样，按照构建 pGADH-Fluc-VVD (50, 56)的方法构建 pGADH-Fluc-VVD (50, 71) 和pGADH-Fluc-VVD(50,56,71)，其中只有所用的载体不同，分别是 pGADH-mCherry-VVD(50, 71)和 pGADH-mCherry-VVD(50, 56, 71)。
[0237] 同样，按照构建pGADH-Fluc-VVD (50, 56)等三个质粒的方法构建 pGADH-SFGFP-WD (50, 56)、pGADH-SFGFP-WD (50, 71)和 pGADH-