一种从西兰花种子中提取分离萝卜硫苷的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及天然产物纯化方法，具体涉及一种从西兰花种子中提取分离萝卜硫苷的方法。
【背景技术】
[0002]萝卜硫苷(4-甲基亚磺酰基丁烯基硫代葡萄糖苷)广泛存在于十字花科植物中，如西兰花、羽衣甘蓝、抱子甘蓝、花椰菜、辣根、大白菜等[中国农学通报，2008,24(2):335-338;食品科技，2009,34(12): 250-252]，其中以西兰花、花椰菜中有效成分最多，特别是西兰花种子中含量最高。萝卜硫苷的降解产物主要萝卜硫素，萝卜硫素腈，嚅唑烷硫酮等，其中含量最高的是萝卜硫素[食品科技，2009,34(12):250-252]。萝卜硫素是迄今为止蔬菜中发现的抗癌活力最强的一类异硫代氰酸盐，是目前公认的防癌和抗癌效果最好的天然产物之一。能够抑制I相酶和诱导Π相酶的表达，对肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前列腺癌、胃癌有明显的阻断作用，并且萝卜硫素还具有保护皮肤、抗菌、提高机体抗氧化能力和免疫力等药理作用[食品发酵与工业，2011,37(7): 197-200]。但萝卜硫素很不稳定，而萝卜硫苷比较稳定，并且可以在生物体内水解成萝卜硫素等，因此研究萝卜硫苷的分离提纯是非常必要的。
[0003]我国对萝卜硫苷的分离进行了一些的研究，但目前高效分离得到高纯度的萝卜硫苷方法不多。如专利CN103709211采用花椰菜为原料提取分离萝卜硫苷，先用弱极性的大孔树脂初次分离后，再次用硅胶柱分离得到高纯度的萝卜硫苷，但是采用的原料萝卜硫苷含量较低，体积较大，不易储运，因此收率较低。专利CN102295667经过多次萃取和制备色谱柱分离后，得到了高纯度萝卜硫苷，但是制备色谱规模小，单次得到产品量少，不利于工业化生产。因此，寻找一种通过简单廉价的分离提纯方法得到高含量的萝卜硫苷产品，将对开发以萝卜硫苷为主要活性成分的药品和保健品的发展具有积极推动作用。
[0004]中国专利CN104961667 A公布了一种萝卜硫素的纯化方法，该方法包括以下步骤:
(I)制备萝卜硫素溶液；(2)对萝卜硫素溶液进行萃取，然后萃取液浓缩，得到萝卜硫素浓缩液；
(3)将萝卜硫素浓缩液与硅藻土混合，挥发溶剂，得到吸附萝卜硫素的硅藻土；(4)用硅藻土填柱，将吸附萝卜硫素的硅藻土加至硅藻土柱上层；(5)用洗脱剂进行洗脱，收集不同溶剂的洗脱液；(6)将洗脱液浓缩、干燥即得吸附萝卜硫素产品。该发明采用硅藻土分离萝卜硫素，工艺简单易行，容易工业化，硅藻土价廉、易得，整个工艺价格便宜，投资少，并且能够得到高纯度的萝卜硫素产品(纯度大于95%)。但该专利分离的是萝卜硫素，萝卜硫素是萝卜硫苷经黑芥子硫酸苷酶酶解或酸水解，脱掉一分子葡萄糖后生成一个中间体，并在一定条件下通过重组反应产生的异硫氰酸盐衍生物。萝卜硫苷和萝卜硫素分子结构不同，性质有很多差异，因此分离提纯方法也不一样。
【发明内容】
[0005]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单、环保节能、纯度高、成本低的从西兰花种子中提取分离萝卜硫苷的方法。
[0006]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:一种从西兰花种子中提取分离萝卜硫苷的方法，主要包括以下步骤:
[0007](I)从西兰花种子中提取萝卜硫苷溶液，并将所得的萝卜硫苷溶液进行浓缩得到萝卜硫苷浓缩液；
[0008](2)将步骤(I)所得萝卜硫苷浓缩液用大孔吸附树脂进行吸附；
[0009](3)用乙醇溶液对大孔吸附树脂进行洗脱，得到树脂洗脱液；
[0010](4)将步骤(3)所得树脂洗脱液进行浓缩后，加入硅胶混合，挥发乙醇，得到吸附萝卜硫苷的硅胶，并将其加至由硅胶填柱所得的硅胶柱上层；
[0011](5)用洗脱剂对硅胶柱进行洗脱，收集洗脱液，并将洗脱液进行浓缩、干燥，即得萝卜硫苷产品。
[0012]步骤(I)所述从西兰花种子中提取萝卜硫苷溶液包括以下步骤:取干燥的西兰花种子置于100-120°C，优选105°C，烘箱处理20min?60min，将其粉碎后加入乙醇溶液，加热至40?70 0C提取30min?2h，过滤，滤液即为萝卜硫苷溶液，其中西兰花种子与乙醇的质量比为1: (2?10)。通过高温将西兰花种子中的黑芥子硫酸苷酶灭活，避免在种子粉碎及后续的提取过程中酶将萝卜硫苷水解。采用乙醇溶液提取，一方面乙醇对萝卜硫苷溶解大，可以充分将萝卜硫苷从种子提取出来;另外一方面，乙醇无毒，价格便宜。
[0013]步骤(I)所述浓缩是将所述的萝卜硫苷溶液置于旋转蒸发仪上进行蒸发，直至萝卜硫苷浓缩液与萝卜硫苷溶液的体积比为1: (3?10)。
[0014]步骤(2)所述用大孔吸附树脂进行吸附的方法包括以下步骤:将大孔吸附树脂填柱，得到树脂柱，萝卜硫苷浓缩液以I?5BV/h速度通过树脂柱，其中通过树脂柱的萝卜硫苷浓缩液的体积为(2?20 )BV，所述的大孔吸附树脂包括DM-301、ADS-17中极性的大孔吸附树月旨。本发明选择中极性的DM-30UADS-17的大孔吸附树脂对萝卜硫苷有很大的吸附量，因为萝卜硫苷本身具有一定的极性，通过中极性的树脂可以提高对其的吸附量。
[0015]步骤(3)所述洗脱包括以下步骤:将吸附萝卜硫苷的大孔吸附树脂用去离子水洗涤，然后用(2?20)BV体积的乙醇溶液进行洗脱，其中洗脱速度为I?5BV/h速度通过树脂柱，所述乙醇溶液的浓度为65 %?95 %。在以上条件下，乙醇溶液可以有效的将萝卜硫苷从树脂中洗脱下来。
[0016]步骤(4)所述浓缩为将所述的洗脱液置于旋转蒸发仪上进行蒸发，直至浓缩前后的洗脱液的体积比为30:1，浓缩后的洗脱液加入硅胶，并挥发其中的乙醇，得到吸附萝卜硫苷的硅胶，加入的硅胶的质量(g)与浓缩后的洗脱液的体积(mL)之比为1:1。
[0017]步骤(4)所述填柱采用湿法装柱，包括以下步骤:用石油醚将200?800目的硅胶润湿，装入玻璃柱中，让硅胶自然沉降，然后通氮气将硅胶压实，从玻璃柱下部放出石油醚，然后再将吸附萝卜硫苷的硅胶填至硅胶柱上部，其中石油醚与硅胶、吸附萝卜硫苷的硅胶的体积之比为(10?30): (5?10):1。上述比例的选择保持吸附萝卜硫苷的硅胶与硅胶有一定的比例，可以使萝卜硫苷得到较高的分离。
[0018]步骤(5)所述洗脱剂包括石油醚、乙酸乙酯与石油醚体积比1:1的混合溶剂和乙酸乙酯与乙醇体积比9:1的混合溶剂。以上溶剂，具有不同的极性，通过石油醚洗脱，可以极性低的杂质除去，采用乙酸乙酯与石油醚混合溶剂，可以将一些极性较大的杂质除去，得到纯度较低的萝卜硫苷产品，而采用乙酸乙酯与乙醇混合溶剂洗脱，杂质都大部分除去，从而可以得到高纯度的萝卜硫苷。
[0019]步骤(5)所述对硅胶柱进行洗脱包括以下步骤:先用石油醚以0.1?6BV/h的速度洗脱，然后用乙酸乙酯与石油醚体积比1:1的混合溶剂以的0.1?6BV/h的速度洗脱，最后用乙酸乙酯与乙醇体积比9:1的混合溶剂以的0.1?6BV/h的速度洗脱，其中石油醚、乙酸乙酯与石油醚体积比1:1的混合溶剂、乙酸乙酯与乙醇体积比9:1的混合溶剂的体积为2?10倍柱体积。采用以上体积的洗脱剂和洗脱速率，可以有效的将萝卜硫苷洗脱下来。
[0020]步骤(5)所述干燥为冷冻干燥，其中冷冻干燥的温度为-50 °C?-20 °C。
[0021]通过本方法得到的萝卜硫苷的纯度大于95%，最高收率为1.2%。
[0022]与现有技术相比，本发明的有益效果体现在:采用中极性的大孔树脂和硅胶分离萝卜硫苷，工艺简单易行，容易工业化，大孔树脂和硅胶价廉、易得，整个工艺价格便宜，投资少，并且能够得到高纯度的萝卜硫苷产品(纯度大于95%)，最高收率为1.2%。
【具体实施方式】
[0023]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0024]实施例1
[0025]—种从西兰花种子中提取分离萝卜硫苷的方法，包括以下几个步骤:
[0026](I)取干燥的西兰花种子200g，于105 °(:烘箱处理30min，然后粉碎，加入100mL含量为65 % (体积分数)的乙醇溶液，加热至60 0C提取Ih，过滤，得到萝卜硫苷溶液。萝卜硫苷溶液于旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至100mL。
[0027](2)将已经预处理的DM-301大孔吸附树脂填柱，萝卜硫苷浓缩液以3BV/h速度通过树脂柱，然后用4BV的去离子水洗涤，然后用4BV体积的含量为95%乙醇溶液进行洗脱。
[0028](3)萝卜硫苷洗脱液于旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至20mL，与20g硅胶(300目)混合，挥发溶剂，得到吸附萝卜硫苷的硅胶。
[0029](4)取150g硅胶(300目)，用石油醚润湿装入玻璃柱中，让硅胶自然沉降，然后通氮气将硅胶压实，从玻璃柱下部放出石油醚，然后再将吸附萝卜硫苷的硅胶填至硅胶柱上部。
[0030](5)硅胶柱先用5BV石油醚以0.5BV/h的速度洗脱，然后用5BV乙酸乙酯与石油醚体积比1:1的混合溶剂以的0.5BV/h的速度洗脱，最后用8BV乙酸乙酯与乙醇体积比9:1的混合溶剂以的0.5BV/h的速度洗脱，分别收集不同的洗脱剂。分别将石油醚、乙酸乙酯与石油醚体积比1:1的混合溶剂、乙酸乙酯与乙醇体积比9:1的混合溶剂洗脱液蒸发溶剂，并进行冷冻干燥，其中冷冻干燥的温度为_20°C。
[0031](6)中通过乙酸乙酯与乙醇体积比9:1的混合溶剂洗脱得到的产品萝卜硫苷纯度为96.1%，最高收率为1.2%。
[0032]实施例2
[0033]—种从西兰花种子中提取分离萝卜硫苷的方法，包括以下几个步骤:
[0034](I)取干燥的西兰花种子200g，于105 °(:烘箱处理30min，然后粉碎，加入100mL含量为65 %乙醇溶液，加热至60 0C提取Ih，过滤，得到萝卜硫苷溶