-Ι阳性细胞（图2C);JWH133治疗可显著增加神 经轴突标志物蛋白MAP-2的表达(图2D)。
[0056] 实施例2
[0057] II型大麻素受体选择性激动剂(JWHl 33)对原代培养大鼠神经干细胞受凝血酶刺 激后分化情况的影响
[0058]选取孕14.5d SD大鼠，5%水合氯醛腹腔麻醉，打开腹膜，取出胚胎，去除头皮、头 骨和硬膜，剥离鼠脑。在解剖显微镜下，以嗅球为中心矢状位纵切，于大脑皮层取材。加入增 殖培养基(DMEM/F12，bFGF 20ng/mL，EGF 20ng/mL，2 %B27)，经200目滤网过滤后，台盼蓝染 色后细胞计数，调整细胞数为I X IO6Ail，转入培养瓶，放入5%CO2、37°C恒温孵箱中培养，三 天传代一次。
[0059] 取对数期生长的NSCs，0.25%EDTA胰蛋白酶消化2min，10%DMEM/F12终止消化后， 调整细胞数至8000/100μ1，接种于激光共聚焦培养皿中，设凝血酶（20U/ml)组和凝血酶 (20U/ml)+JWH133(4yM/ml)组，其中凝血酶在孵育6小时NSCs贴壁良好后给予，再隔6小时候 给予JWHl 33,孵育24小时后进行免疫组化荧光双标染色。结果如图3所示。
[0060] 本实施例通过培养原代大鼠NSCs，以凝血酶(Thrombin，20U/ml)为致伤因素模拟 体外脑出血环境，从图3可以看出JWH133(4yM)能促进NSCs向GFAP(星型胶质细胞)分化。 [0061 ] 实施例3
[0062]米诺环素(Minocycline)又称"二甲胺四环素"或"美满环素"，是一种广谱抗菌的 四环素类抗生素，具有半衰期长、亲脂性等药理特性。
[0063]由于大脑存在血脑屏障，直接服用JWH133并不容易进入脑部，从而实现其功能。
[0064] VII型胶原酶诱导新生7天(P7)SD大鼠脑出血伴脑室出血(GMH/IVH)模型同前，分 为假手术组、生理盐水组、单独JWH133组以及JWH133+米诺环素组，用药3天后检测幼鼠脑水 含量变化。结果如图4所示。
[0065]从图4可以看出，JWH133联合米诺环素治疗新生儿脑出血疗效优于单纯腹腔注射 JffHl33〇
[0066] 实施例4
[0067] VII型胶原酶诱导新生7天(P7)SD大鼠脑出血伴脑室出血(GMH/IVH)模型同前，不 同组别间的JWH133组与米诺环素的用量不同，用药7天后检测神经元数目变化。结果如图5 所示。
[0068]图5中，A组大鼠（n = 6)GMH模型建立后给予腹腔注射JWH1331mg/kg加米诺环素 45mg/kg;B组大鼠（11 = 6)模型建立后给予腹腔注射1!1133211^/1^加米诺环素4511^/1^;(：组 大鼠（]1 = 6)模型建立后给予腹腔注射1!1133311^/1^加米诺环素4511^/1^;0为显微镜下每视 野海马区神经元特异性抗体(NeuN+)阳性细胞数比较。
[0069]从图5可以看出，A组大鼠与B组大鼠海马神经元阳性个数有显著差异(p〈0.01)然 而使用2mg/kg与3mg/kg JWH133无统计学差异(ρ>0·05)。
[0070] 本发明将JWH133与米诺环素的作用基团有机结合，制成一种同时发挥JWH133的神 经保护效应并拥有米诺环素的高血脑屏障通透性的药物，增加治疗效果。
[0071] 实施例5
[0072] 本发明提供的药物包括II型大麻素受体激动剂和药学上可接受的辅料，制成注射 剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、乳剂、膏剂、霜剂、透皮贴剂等。
[0073] 各剂型的制备进行以下举例说明：
[0074] 1、制备注射剂
[0075] 称取1.5g II型大麻素受体激动剂，加入50g PEG-400,溶解;配制50g ρΗ5·5的磷 酸盐缓冲液，称取〇. 〇2g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓冲液加入到PEG溶液 中，混合均匀，加入0.01 %针用活性炭l〇〇°C保温30分钟，G3垂熔玻璃漏斗过滤、0.22μπι的微 孔滤膜过滤，过滤后的药液分装成2ml/支的针剂，分装好的注射剂可以直接压塞、压铝盖成 针剂。
[0076] 2、冻干粉针的制备
[0077] 称取2g II型大麻素受体激动剂，加入50g PEG-400,使皂苷溶解。配制50g pH5.5 的磷酸盐缓冲液，称取0.02g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓冲液加入到皂苷 的PEG溶液中，混合均匀，加入0.01 %针用活性炭100°C保温30分钟，G3垂熔玻璃漏斗过滤、 0.22μπι的微孔滤膜过滤;过滤后的药液分装成2ml/支的西林瓶中，经冻干机冻干制成冻干 粉针。
[0078] 3、片剂的制备
[0079]称取II型大麻素受体激动剂80g、淀粉870g、滑石粉50g，混合均匀，压成500片。 [0080] 4、胶囊的制备
[0081 ]称取II型大麻素受体激动剂20g、淀粉40g、羧甲基纤维素钠50g、聚乙烯吡咯烷酮 l〇g、滑石粉5g，混合均匀，装成100个胶囊。
[0082] 实施例6
[0083] 本发明提供的药物包括II型大麻素受体激动剂、米诺环素和药学上可接受的辅 料，制成注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、乳剂、膏剂、霜剂、透皮贴剂 等。
[0084] 各剂型的制备进行以下举例说明：
[0085] 1、制备注射剂
[0086]称取2g II型大麻素受体激动剂和45g米诺环素，加入100g PEG-400,使皂苷溶解； 配制150g pH5.5的磷酸盐缓冲液，称取0.05g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓 冲液加入到皂苷的PEG溶液中，混合均匀，加入0.01 %针用活性炭100°C保温30分钟，G3垂熔 玻璃漏斗过滤、0.22μπι的微孔滤膜过滤，过滤后的药液分装成2ml/支的针剂，分装好的注射 剂可以直接压塞、压铝盖成针剂。
[0087] 称取3g II型大麻素受体激动剂和45g米诺环素，加入100g PEG-400,使皂苷溶解； 配制150g pH5.5的磷酸盐缓冲液，称取0.05g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓 冲液加入到皂苷的PEG溶液中，混合均匀，加入0.01 %针用活性炭100°C保温30分钟，G3垂熔 玻璃漏斗过滤、0.22μπι的微孔滤膜过滤，过滤后的药液分装成2ml/支的针剂，分装好的注射 剂可以直接压塞、压铝盖成针剂。
[0088] 2、冻干粉针的制备
[0089] 称取2g II型大麻素受体激动剂和45g米诺环素，加入150g PEG-400，使皂苷溶解。 配制300g pH5.5的磷酸盐缓冲液，称取0.1 g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓 冲液加入到皂苷的PEG溶液中，混合均匀，加入0.01 %针用活性炭100°C保温30分钟，G3垂熔 玻璃漏斗过滤、0.22μπι的微孔滤膜过滤;过滤后的药液分装成2ml/支的西林瓶中，经冻干机 冻干制成冻干粉针。
[0090] 称取3gII型大麻素受体激动剂和45g米诺环素，加入150g PEG-400,使皂苷溶解。 配制300g pH5.5的磷酸盐缓冲液，称取0.1 g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓 冲液加入到皂苷的PEG溶液中，混合均匀，加入0.01 %针用活性炭100°C保温30分钟，G3垂熔 玻璃漏斗过滤、0.22μπι的微孔滤膜过滤;过滤后的药液分装成2ml/支的西林瓶中，经冻干机 冻干制成冻干粉针。
[0091] 3、片剂的制备
[0092]称取II型大麻素受体激动剂20g、米诺环素 450g、淀粉950g、滑石粉80g，混合均匀， 压成500片。
[0093] 4、胶囊的制备
[0094]称取II型大麻素受体激动剂30g、米诺环素 450g、淀粉500g、羧甲基纤维素钠 500g、 聚乙烯吡咯烷酮I OOg、滑石粉20g，混合均匀，装成800个胶囊。
[0095]其中，本发明中的II型大麻素受体激动剂为JWH133，CAS登录号：259869-55-1，化 学结构式为
[0096]米诺环素的化学结构式为：
[0097]
[0098] 尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的 精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中 包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
【主权项】
1. II型大麻素受体激动剂在制备治疗新生儿脑出血药物中的应用。 2. II型大麻素受体激动剂在制备治疗新生儿脑出血后促进神经再生、神经前体细胞分 化以及神经干细胞增殖药物中的应用。 3. II型大麻素受体激动剂在制备治疗新生儿脑出血后脑积水药物中的应用。4. 根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括米诺环素。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在所述药物中，II型大麻素受体激动剂与 米诺环素的重量比例为2-3:45。6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料，所 述药学可接受的辅料包括稀释剂、赋形剂、崩解剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活 化剂、稳定剂中的任一种或多种组合。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述赋形剂包括甘露醇、乳糖、淀粉、右旋 糖酐、微晶纤维素中的任一种或多种组合。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述崩解剂包括聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基 纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素中的任一种或多种组合。9. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述润滑剂包括滑石粉、硬脂酸镁中的任 一种或两种组合。10. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、针剂、片剂、 冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂中的任一种。
【专利摘要】本发明涉及新生儿脑出血药物领域，特别涉及II型大麻素受体激动剂在制备治疗新生儿脑出血药物中的应用。本发明提供的II型大麻素受体激动剂在制备治疗新生儿脑出血后促进神经再生、神经前体细胞分化以及神经干细胞增殖药物中的应用。本发明通过试验发现，II型大麻素受体激动剂具有促进新生儿神经再生、神经前体细胞分化以及神经干细胞增殖的作用，另外还能显著降低GMH诱导的脑积水。另外，II型大麻素受体激动剂与米诺环素配合使用，米诺环素能显著增加II型大麻素受体激动剂的血脑屏障的透过率，并增加抗炎作用治疗效果。
【IPC分类】A61K31/65, A61K31/352, A61P25/00, A61P9/10, A61K45/06
【公开号】CN105640934
【申请号】
【发明人】唐俊, 朱刚, 陶一浩, 陈前伟, 谭亮, 姜兵
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月20日