一种串联鸭α、γ干扰素基因及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域的基因融合表达，具体涉及一种串联鸭α、γ干扰素基因 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 干扰素（interferon，IFN)是一类在同种细胞上具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等 多种生物学功能的糖蛋白。1957年，由Isaacs等首次发现。国际干扰素命名委员会根据干扰 素的抗原特性和分子结构的差异，将干扰素分为2个型。α干扰素（IFN-α)属I型干扰素，在 1995年，由Schultz等成功克隆并表达，随后，研究者相继克隆出北京鸭、番鸭、麻鸭和绍兴 鸭的IFN-a基因。IFN-a基因由576个核苷酸构成，共编码191个氨基酸，含有信号肽。不同品 种间的鸭a干扰素基因相对较保守，核苷酸序列同源性在99.5 %~100 %之间。IFN-a主要参 与抗病毒、抗肿瘤过程，研究表明，重组鸭IFN-a对DHV有一定的治疗作用，可以减少乙肝病 毒cccDNA向pgRNA的转录。此外，重组鸭a干扰素对流感病毒、新城疫病毒和呼肠孤病毒也有 一定的抑制作用。γ干扰素（IFN-γ )属于II型干扰素，1999年，Schultz等证明了鸭IFN-γ 开放阅读框含有495个碱基，可编码164个氨基酸。IFN-γ可诱导病毒感染的细胞表达病毒 抗原，增加免疫系统识别和杀伤感染细胞的能力，还可作为免疫佐剂参与机体的免疫反应。 目前，关于鸭重组干扰素的研究仍局限于对单个干扰素的表达及活性研究，尚无将两个鸭 干扰素基因串联表达并检测其抗病毒活性的例子。
[0003] 禽流感(Avian influenza,AI)是由流感病毒(Avian influenza virus)引起的急 性高度接触性传染病，临床表现为严重的发病和死亡，或轻度呼吸道感染，或无症状。1878 年首次在意大利发现，目前，几乎已遍布世界各地，给养殖业造成了严重的经济损失。流感 在家禽中以鸡和火鸡的易感性最高，鸭、鹅和鹌鹑等动物也能感染，1956年英国科学家首次 证明甲型流感病毒能够感染鸭。近年来，在我国部分省份不断出现鸭感染流感病毒的现象， 严重阻碍养鸭业的健康发展。
[0004] 鸭瘟(Duck plague，DP)是鸭的一种急性败血性传染病，临床特征主要为体温升 高，下痢，两脚发软无力，部分发病鸭表现为头颈部肿大。该病传播迅速，发病率高，鸭群感 染鸭瘟病毒后，往往引起大批量死亡。鸭瘟主要通过疫苗预防，若出现发病，可用聚肌胞(简 称Poly I: C，属A级干扰素诱生剂)肌肉注射，效果显著。
【发明内容】
[0005] 为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种串联 鸭α、γ干扰素基因。本发明所述的串联鸭α、γ干扰素基因易于生产，成本低，活性高，具有 叠加的鸭IFN-a、IFN- γ抗病毒功能，对流感和鸭瘟均有很好的治疗效果。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述串联鸭α、γ干扰素基因的制备方法。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述表达串联鸭α、γ干扰素基因的原核表达质粒 pET32a-IFNa-linker-IFNy。
[0008] 本发明的另一目的在于提供上述原核表达质粒pET32a-IFNa-linker-IFNy的制 备方法。
[0009] 本发明的再一目的在于提供上述串联鸭α、γ干扰素基因的应用。
[0010]本发明的目的通过下述技术方案实现：一种串联鸭〇、γ干扰素基因（1?_-linker-IFNy )，其核苷酸序列如下：
[0011] Ttctcctgcagccccctgcgcctccacgacagcgccttcgcctgggacagcctccagctcctccgcaacatggctcc cagccccacacagccctgcccgcagcaacacgcgccttgctccttcccggacaccctcctggacaccaacgacacgc agcaagccgcacacaccgccctccacctcctccaacacctcttcgacaccctcagcagccccagcacccccgcgcac tggctccacaccgcacgccacgacctcctcaaccagcttcagcaccacatccaccacctcgagcgctgcttcccagc cgacgccgcgcgcctccacaggcgagggccccgcaaccttcacctcagcatcaacaagtacttcggctgcatccaac acttcctccagaaccacacctacagcccctgcgcatgggaccacgtccgcctcgaggctcacgcctgcttccagcgc atccaccgcctcacccgcaccatgcgcggtggaggaggctctggtggaggcggtagcggaggcggagggtcgatgac ttgccagacctactgcttgtttgttctctctgtcatcatgatttattttggatgttctggaagtgctttatttctag gtcaacttcaaaatgacatagacaaactgaaagctgattttaatgcaagtaattcggatgtagctgatggcaatcct gtttttatagagaaagtgaaaaactggacagagagaaatgaaaaaaggatcatactgagccagattgttaccctgta cttggaaatgctaaagaaaactgacatgtcaaagccacacatcaaaaatttatctgagcagctcaatactctgagaa ataccctttccaatgactacaagaagttcagagacctcgtggaactgtcaaaccttcagctgactggcttgaaaatc caacgcaaggctgtgagtgagctgttcagtgtcttacagaaactggtggagacttcgacttccaaaaggaaaaggag ccagtctccaaagagatgcagatgttaa〇
[0012] 所述的串联鸭α、γ干扰素基因是应用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap eXtenSi〇n，S0E-PCR)方法，将去除信号肽的鸭α、γ干扰素基因通过一疏水性柔性氨基酸接 头（linker)(G4S)3连接，然后将串联好的鸭IFNa-linker-IFNy基因克隆至原核表达载体 pET32a( + )上，构建成重组表达载体pET32a-IFNa-linker-IFNγ，通过BL21系统进行表达， 鉴定纯化后，分别在体内和体外检测其抗流感和鸭瘟活性。
[0013]上述的串联鸭α、γ干扰素基因的制备方法，具体包括以下步骤：
[0014] (1)引物的设计与合成
[0015] 根据Genbank中提供的鸭IFN-a和IFN-γ序列，分别设计2对引物IFNa-Fl、IFNa-Rl 和IFN γ -FI、IFN γ -R1，用于扩增去除信号肽后的鸭IFN-a基因（核苷酸序列信息如SEQ ID N0:2)和IFN-γ基因（核苷酸序列信息如SEQ ID N0:3)，并分别在IFN-a上游和IFN-γ下游 加入BamH I和Hind III两个酶切位点；同时，设计用于S0E-PCR的引物IFNa-R2和IFNy -F2， 其中，IFNa-R2中含有部分linker序列，IFN γ-F2中含有与IFNa-R2互补的linker序列；引物 序列如下:去除信号肽后IFN-a的扩增引物：
[0016] IFNa-Fl:CGGGATCC TTCTCCTGCAGCCCCCTGCG;
[0017] IFNa-Rl：CCCAAGCTTTTAGCGCATGGTGCGGGTGA；
[0018] IFNa-R2：
[0019] CTCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCGCGCATGGTGCGGGTG;去除信号肽后IFN- γ 的扩增引物：
[0020] IFN γ-FI：CGGGATCC TCTGGAAGTGCTTTATTTCT；
[0021] IFN γ-F2：
[0022] TCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTCTGGAAGTGCTTTATTTCT；
[0023] IFN γ-R1:CCCAAGCTTTTAACATCTGCATCTCTTTGGA;
[0024] (2)鸭α、γ干扰素基因的扩增
[0025] 从鸭外周血淋巴细胞中抽提RNA，经反转录后，得到扩增鸭α、γ干扰素基因的cDNA 模板；以此cDNA为模板，分别用上述引物IFNa-Fl、IFNa-Rl和正以41、正"-1?1，扩增出所 需鸭a、γ干扰素目的基因；
[0026] (3)S0E_PCR扩增串联鸭α、γ干扰素基因（鸭IFNa-linker-IFNy基因）
[0027] 该过程主要包含3个PCR反应，第一个PCR:以IFNa-Fl和IFNa-R2为引物扩增出含有 部分1 inker序列的IFN-a，以IFN γ -F2和IFN γ -R1为引物扩增出含有部分1 inker序列的 IFN- γ，并分别进行胶回收;第二个PCR:以第一个PCR扩增出的基因为模板，不加引物，进行 10-15个PCR反应;第三个PCR反应，以