第二个PCR反应扩增出的基因为模板，用引物IFNa-Fl 和IFN γ -R1扩增出融合基因，即串联鸭a、γ干扰素基因（鸭IFNa-linker-IFN γ基因）。 [0028] 一种表达串联鸭€1、丫干扰素基因的原核表达质粒邱了32&-正_-1丨111?^-正~丫，通 过BamH I和Hind III酶切位点将串联鸭α、γ干扰素基因（鸭IFNa-linker-IFN γ基因）连接 到原核表达质粒pET32a( + )上。
[0029] 上述原核表达质粒pET32a-IFNa-linker-IFNy的制备方法，具体步骤如下：
[0030] 1)串联鸭α、γ干扰素基因（鸭IFNa-linker-IFNy基因）克隆至PMD-19T载体：
[0031] 将PCR扩增纯化后的串联鸭a、γ干扰素基因（鸭IFNa-linker-IFN γ基因）连接入 PMD-19T载体，16°C连接过夜后进行转化;挑取菌落接种于氨苄青霉素抗性的LB培养基中继 续培养，用菌液PCR的方法筛选出阳性克隆，测序正确后扩大培养，获取该基因的阳性质粒 pMD-19T-IFNa-linker-IFNy ；
[0032] 2)重组原核表达质粒pET32a-IFNa-linker-IFNy的构建：
[0033] 用BamH I和Hind III限制性内切酶分别对pMD-19T-IFNa-linker-IFNy 和pET32a 空载体进行双酶切，胶回收获得酶切后的基因片段和载体片段，应用T4连接酶，将目的片段 连接到pET32a( + )载体上，构建出重组原核表达质粒pET32a-IFNα-linker-IFNγ;将上述构 建好的质粒转化DH5a感受态细菌，培养后，挑取菌落接种于氨苄青霉素抗性的LB培养基中 进行培养，应用菌液PCR方法筛选出阳性克隆，获得重组原核表达质粒pET32a-IFNa-linker-IFN γ 〇
[0034] 上述串联鸭α、γ干扰素基因的应用，具体体现在上述串联鸭α、γ干扰素基因表达 的融合蛋白在制备鸭的抗病毒药物方面的应用。
[0035] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0036] (1)本发明成功构建了重组鸭α、γ干扰素原核表达质粒pET32a-IFNa-linker-IFN γ，实现了鸭IFN-a和IFN- γ基因在大肠杆菌原核表达系统上的串联表达。另外，两个基因 通过(G4S)3疏水的柔性氨基酸接头连接，不仅可以保证两个干扰素基因以1:1的比例进行 表达，还可以使两种鸭干扰素充分延展、正确折叠，以获取最大的生物学活性。
[0037] (2)体外体内抗病毒实验证明，本发明所构建的融合蛋白具有较高的抗病毒活性。 体外抗病毒实验中，纯化复性后的重组鸭IFNa-linker-IFN γ融合蛋白抗VSV、AIV和DPV活 性分别为2.61 X 107U/mg、1.12 X 107U/mg和1.07 X 107U/mg，明显高于单个鸭干扰素的抗病 毒活性;体内实验表明，纯化复性后的重组鸭IFNa-1 inker-IFN γ融合蛋白对AIV和DPV感染 鸭的保护率明显提高，感染鸭的排毒量及脏器含毒量也明显降低。因此，该发明提供了一种 成本低、活性高的重组鸭干扰素融合蛋白，可有效控制病毒性疾病的快速传播，减少经济损 失。
【附图说明】
[0038] 图1为S0E-PCR扩增的鸭IFNa-1 inker-1FN γ基因电泳检测结果图；其中，泳道Μ: DL2000marker;泳道 1: S0E-PCR扩增鸭IFNa-1 inker-IFN γ 结果；泳道2:阴性对照。
[0039] 图2为western blot检测其表达的结果图；其中，泳道Μ:低分子量蛋白marker;泳 道1: pET32a-IFNa表达产物；泳道2: pET32a-IFN γ 表达产物；泳道3: pET32a-IFNa/IFN γ 表 达产物。
[0040] 图3为SDS-PAGE检测其表达的结果图；其中，泳道Μ:低分子量蛋白marker;泳道1: pET32a空载体表达沉淀；泳道2: pET32a空载体表达上清；泳道3: pET32a-IFNa表达沉淀；泳 道4: pET32a-IFNa表达上清；泳道5: pET32a-IFN γ表达沉淀；泳道6 : pET32a-IFN γ表达上 清;泳道7: pET32a-IFNa/IFN γ表达沉淀;泳道8: pET32a-IFNa/IFN γ表达上清。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0042] 实施例1串联表达鸭α、γ干扰素基因的原核表达质粒的构建
[0043] 1.引物的设计与合成
[0044] 根据Genbank中提供的鸭IFN-a的基因序列（GenBank no.KJ874343)和IFN-γ的基 因序列（GenBank no · KF746069)，分别设计2对引物IFNa-Fl、IFNa-Rl和IFN γ-FI、IFN γ-R1，用于扩增去除信号肽后的鸭IFN-a和IFN- γ基因，并分别在2对引物的上游和下游加入 BamH I和Hind ΙΠ 酶切位点。同时，设计用于S0E-PCR的引物IFNa-R2和IFN γ -F2,其中，IFN a-R2中含有部分linker序列，IFNy_F2中含有部分与IFNa-R2互补的linker序列。引物序列 如下：
[0045]去除信号肽后IFN-a的扩增引物：
[0046] IFNa-Fl：CGGGATCC TTCTCCTGCAGCCCCCTGCG；
[0047] IFNa-Rl：CCCAAGCTTTTAGCGCATGGTGCGGGTGA；
[0048] IFNa-R2：
[0049] CTCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCGCGCATGGTGCGGGTG;去除信号肽后IFN- γ 的扩增引物：
[0050] IFN γ-FI：CGGGATCC TCTGGAAGTGCTTTATTTCT；
[0051] IFN γ-F2：
[0052] TCTGGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGTCTGGAAGTGCTTTATTTCT；
[0053] IFN γ-R1:CCCAAGCTTTTAACATCTGCATCTCTTTGGA。
[0054] 2.鸭α、γ干扰素基因的扩增
[0055] 从鸭外周血淋巴细胞中抽提RNA，经反转录后，得到扩增鸭α、γ干扰素基因的cDNA 模板，以此cDNA为模板，分别用上述IFNa-Fl、IFNa-Rl和IFN γ -FI、IFN γ -R1引物，扩增出所 需鸭α、γ干扰素目的基因，PCR反应体系为50yL，其中Ex Taq酶lyL，4XdNTP mix 4yL， ddH20 41.5yL，上、下游引物各lyL，cDNAl. 5yL。反应参数为：预变性94°C4min，然后进行35 个循环，循环反应条件为941€3〇8、55 1€358、721€21^11，最后72°(：延伸1〇1^11。？0?产物进行 1.0 %琼脂糖凝胶电泳观察，可见约492kb和435kb的扩增条带，大小与预期的结果相符。
[0056] 3.S0E-PCR扩增鸭IFNa-linker-IFNy 基因
[0057] 该过程主要包含3个PCR反应，第一个PCR:以IFNa-Fl和IFNa-R2为引物扩增出含有 部分1 inker序列的IFN-a，以IFN γ -F2和IFN γ -R1为引物扩增出含有部分1 inker序列的 IFN-γ并分别进行胶回收(反应体系及方法如上1.2所述）；第二个PCR:以第一个PCR扩增出 的基因为模板，不加引物，进行10-15个PCR反应，其它反应条件不变;第三个PCR反应，以第 二个PCR产物为模板，用引物IFNa-Fl和IFN γ -R1扩增出融合基因 IFNa-1 inker-IFN γ，反应 体系及方法同上。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳观察，结果如图1所示，可见约1029kb 的扩增条带，大小与预期结果相符。
[0058] 4.鸭IFNa-linker-IFNy 基因克隆至pMD-19T Vector
[0059] 将扩增得到的鸭IFNa-1 inker-IFN γ基因用Omega公司胶回收试剂盒进行回收，然 后将回收的目的基因连接到PMD-19T载体上，连接反应体系为：Ligation SolutionI5yL、 PMD-19T Vector 0.5yL、PCR纯化产物4.5yL，16°C连接过夜，将连接产物转化至DH5a感受态 细菌，接种于氨苄青霉素抗性的LB平板上，37°C过夜培养。挑选菌落于氨苄青霉素抗性的LB 培养液中继续培养6h，用菌液PCR方法筛选出阳性克隆。菌液PCR反应体系为rTaq 10yL， ddH20 8.4yL，上、下游引物各0.2yL，菌液1.2yL。反应参数为:预变性94°C4min，然后进行35 个循环，循环反应条件为94 1€3〇8、551€358、721€21^11，最后72°(：延伸1〇1^11。？0?产物进行 1.0%琼脂糖凝胶电泳观察，选取部分阳性样品测序鉴定，将测序结果正确的菌液扩大培 养，获取阳性质粒pMD-19T