一种转移质粒及其构建方法和重组慢病毒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及及医学分子生物学领域，具体涉及了一种转移质粒及其构建方法和重 组慢病毒。
【背景技术】
[0002] 过去的数十年中，多种HIV-ι抑制药物已批准入市，用于HIV感染病人的治疗。基于 HIV-1逆转录酶和（或）蛋白酶的两种或多种抑制剂联合应用的高效抗逆转录病毒疗法 (HAART)，被公认为是治疗HIV感染病人最有效方法之一。它不仅能够提高HIV感染病人的生 活质量也能降低HIV的感染风险。尽管HAART能够抑制病毒的复制和降低HIV感染的风险，但 不能清除HIV-1感染者体内的病毒。因此，抗逆转录病毒疗法会因药物选择性压力下新现的 耐药毒株而大打折扣。因此，很有必要监测耐药毒株并对临床精准抗病毒治疗提供指导。
[0003] 目前，对于HIV-1药物耐药性检测主要有基因型和表型耐药两种检测类型。基因型 耐药检测是通过序列分析，能检出HIV-1靶基因中特定耐药相关的基因突变，因其操作简 便，成本低廉，及在线的评估系统的应用，较表型耐药检测常用。但是，基因型检测不能用于 解释不常见的突变或几种突变型的混合突变。表型耐药检测，能够在体外测定HIV-1抑制剂 作用下的病毒产量或酶活性，能够直接测定每种抑制剂的耐药水平，而无需知晓HIV-1毒株 的基因突变。因此，表型耐药检测对于HIV-1感染的病人，特别是为已经多次治疗的病人提 供精准的药物指导是很有意义的。通常情况下，表型耐药检测是分离和培养临床毒株。但 是，这些检测需要采集献血者新鲜的外周血单个核细胞，这将耗时耗力。最近，有一些检测 基于重组病毒的单环感染，或用感染性粒子进行多轮感染。尽管这些检测用于表型耐药分 析有巨大的应用前景，但是，由于采用高通量定量萤火虫萤光素酶表达系统，成本还是很高 昂，再就是可能存在着生物安全问题。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述现有技术的不足，本发明提供了 一种转移质粒，其报告基因 Luciferase与ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV启动子控制报告基因 Luciferase与ZsGreen的表达，使得HIV-1抑制剂的抗病毒效果能够简易地通过在倒置荧光 显微镜下观察到或通过测定荧光素酶活性而获得，将P〇l区导入后，多种细胞用具有此转移 质粒的重组慢病毒均可进行耐药性检测，通用性强。本发明还提供了一种转移质粒的构建 方法及重组慢病毒。
[0005] 本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现： 本发明的发明思路基于以下考虑。第一，在艾滋病人临床治疗工作中，表型耐药检测能 为患者个体化治疗提供参考。但是表型耐药检测是分离和培养临床毒株。但是，以往的检测 方法存在耗时耗力或是成本高昂，及生物安全性的问题。基于此，发明人开发了一种具有新 的转移质粒的重组慢病毒，它具有简易操作性、较好的生物安全性及通用性。
[0006] -种转移质粒，其结构如图1所示。
[0007] 一种转移质粒的构建方法，包括以下步骤:使用BamH I和Κρη I双酶切PMD2.G质 粒，回收酶切产物，收取119bp CMV片段;将pHAGE-EFla-IRES-ZsGreen质粒用BamH I和Κρη I进行双酶切，回收4736bp pHAGE-IRES-ZsGreen片段；将回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA连接酶进行连接，连接成功后，提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒；使用Ncol和Xbal双酶切PGL3_Promoter Vector，回收 1906bp Luciferase片 段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒用Ncol和Xbal双酶切，回收4855bp的片段，将该片段和 Luciferase片段用T4DNA连接酶进行连接;连接成功后，提取的质粒即为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen〇
[0008] 一种重组慢病毒，是包装质粒、包膜质粒和所述的转移质粒共转染293FT细胞或 293T细胞后得到的包装体;其中，所述包装质粒为psPAX2m-p 〇l质粒。
[0009] 进一步地，所述p s PAX 2m-p ο 1质粒结构如图3所示。
[00?0] 进一步地，所述psPAX2m-pol质粒序列如SEQIDNo.6所示。
[0011 ] 进一步地，所述pSPAX2m_pol质粒的构建方法，包括以下步骤： (1 )psPAX2载体重建:利用长引物法突变psPAX2载体的酶切位点Agel，获得psPAX2-l载 体;利用定点突变试剂盒突变PSPAX2-1载体的酶切位点Apal，获得psPAX2-2载体;Dpnl酶切 psPAX2-2载体，酶切产物转化XL 10-G0LD感受态细胞，质粒提取，Apal酶切该质粒，挑取酶 切产物鉴定测序，获得psPAX2m载体，其序列如SEQIDN 0.4所示； (2)psPAX2m-p〇l质粒构建:利用PCR扩增pol片段，其序列如SEQ ID Νο·5所示；用Apal 和Agel酶切扩增后的pol片段回收并插入psPAX2m载体，得到psPAX2m-pol质粒，其序列如 SEQIDNo.6**。
[0012] 进一步地，所述psPAX2-l载体的序列如SEQIDNo.2所示。
[0013] 进一步地，所述psPAX2-2载体的序列如SEQ ID No.3所示。
[0014] 进一步地，所述psPAX2m载体的序列如SEQIDNo.4所示。
[0015]进一步地，所述长引物法突变psPAX2载体所用的引物为Agel-F和Agel-R，其中， AgeI-F：CGAAGAGCTC ATCAGAACAG TCAGACTCAT CAAGCTTCTC TATC； AgeI-R：CTGCTAGCTA TAGTTCTAGA GGTATCGGTT GTTTCGAGCT TATAG； 模板为 psPAX2，PCR 条件:94 °C 预变性 4min，94 °C 变性 20s、55 °C 退火 20s、72 °C 延伸 lmin， 循环35次，最后72°C延伸5min; 所述利用定点突变试剂盒突变PsPAX2-1载体所用的引物为M-ApaI-F和M-ApaI-R;其 中， M-ApaI-F：GCC TTG AGG GGC CTC CGG GGA CGG CCC TTT GTG CGG GG M-ApaI-R：CCC CGC ACA AAG GGG CCG TCC CGG AGC CCC CTC AAG GC； 模板为 psPAX2-l，PCR 条件:95°C 预变性 2min，95°C 变性 30sec，55°C 退火 lmin，68°C 延伸 10min，循环18次。
[0016] 本发明具有如下有益效果：该转移质粒的报告基因 Luciferase与ZsGreen位于 pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV启动子控制报告基因 达，使得HIV-1抑制剂的抗病毒效果能够简易地通过在倒置荧光显微镜下观察到或通过测 定荧光素酶活性而获得;将P〇l区导入后，多种细胞用具有此转移质粒的重组慢病毒均可进 行耐药性检测，通用性强。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明中转移质粒的结构图； 图2为本发明中转移质粒的构建方法示意图； 图3为本发明中包装质粒的结构图； 图4为本发明中荧光显微镜下质粒共转染情况;其中：左边一列为载体突变前，病毒感 染293A细胞荧光百分比；右边一列为载体突变后，病毒感染293A细胞荧光百分比，其中， A与D表示原始病毒液感染293A细胞荧光百分比； B与E表示原始病毒液稀释10倍后感染293A细胞荧光百分比； C与F表示原始病毒液稀释100倍后感染293A细胞荧光百分比 结果:从各个梯度百分比可以看出，载体改造后，对病毒的浓度和感染性无影响； 图5中A~C分别为使用本发明重组慢病毒共转染293A细胞，抗HIV药物司他夫定敏感性 与细胞数目、病毒Μ0Ι及病毒感染时间相关实验结果； 图6为本发明中重组慢病毒活性滴度情况； 图7中A~C分别为使用本发明重组慢病毒共转染TZM-B细胞，抗HIV药物齐多夫定(D4T) 敏感性与细胞数目、病毒Μ0Ι及病毒感染时间相关实验结果； 图8中A~C分别为使用本发明重组慢病毒共转染huh7.5细胞，抗HIV药物齐多夫定 (D4T)敏感性与细胞数目、病毒Μ0Ι及病毒感染时间相关实验结果。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明。
[0019] 本发明一种重组慢病毒系统是利用下述方法构建的，步骤为： (1)转移质粒的构建 本发明的转移质粒具有双报告基因荧光素酶Luciferase与ZsGreen，其具体结构如图1 所示。Luciferase与ZsGreen为各自独立表达的蛋白，而非融合蛋白。
[0020]如图2所示，该转移质粒的构建方法如下： (1.1) 使用BamH I和Κρη I双酶切pMD2.G质粒，回收酶切产物，收取119bp CMV片段； (1.2) 将pHAGE-EFla-IRES-ZsGreen质粒用BamH I和Κρη I进行双酶切，回收4736bp pH