了用于表型耐药检测时的细胞数目、Μ0Ι以及病毒感染时间。铺96孔 板，当细胞汇合度达到80%时，按照每孔细胞数目计算Μ0Ι = 10时所需要的病毒液体积。与 此同时，用DMEM完全培养液配制不同药物浓度的HIV药物，将配置好的药物与病毒混合液， 加入到96孔293A细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示，除了2种药 物(利匹韦林和依曲韦林)大部分药物都显示较高的重复性。结果如表1所示，其中，IC50,能 够使ZsGreen阳性细胞减少50 %的药物浓度;SD，标准差;CV，变异系数。
[0040] 表1十种药物用于表型耐药检测的可重复性
(3.3.4)病人HIV-1毒株耐药相关的突变基因分析 HIV-1感染病人的特征(表2)，病人都是联合应用抗病毒药物，但所有的8名病人CD4细 胞数低于400细胞/mm3,其中5人低于400细胞病毒载量在155~104000copies/ml之 间。为了分析8名患者HIV-1毒株药物相关的突变，扩增了HIV-1的pol区基因，并进行了测 序。基于此次研究涉及到的10种HI V抑制剂的基因型耐药数据，测到8名患者的HI V-1毒株突 变(表3)，这表明所有的HIV-1毒株都存在基因型耐药，但不能预测它们对抗病毒药物的耐 受水平。
[0041 ]表2临床样本的特性
表3 8名患者体内HIV-1毒株药物耐受相关的突变分析 yzt. Tii^r 1=1
> wj'niiyvAt^^r^yvAt^^tni 'nii 滨、硫酸阿巴卡韦和三种非核苷酸类抑制剂奈韦拉平、依曲韦林和利匹韦林及2种蛋白酶抑 制剂奈非那韦和洛匹那韦的基因型药物耐药性在数据库可以查到。
[0042] (3.3.6)病人体内HIV-1毒株的表型耐药分析 8名患者的HIV-1样本用本发明中带有双报告基因的重组慢病毒系统进行表型耐药分 析。野生型的慢病毒作为对照。病毒抑制率（％ ) = ( 1-药物处理组的荧光素酶RLU/对照组的 荧光素酶RLU)X100%。用非线性回归分析每个HIV-1毒株的ICSOAIV-l毒株对每种抑制剂 的表型耐药程度用倍数变化(FC)来表示，即测试株的IC50/野生株的IC50。校正的用于表型 耐药的分类标准:FC〈3为敏感，FC = 3-6为低度耐药，FC = 6.01-10为中度耐药，FC>10为高度 耐药[6,22,23]。表4呈现了6种6冊1'18(0丨(1&11〇8；[116,3七&￥11(1;[116,2丨(10￥11(1;[116,2&1(3；^&13；[116， Emtricitabine，Abacavir Sulfate)，4NNRTIs(Nevirapine，Etravirine，Dapivirine， Rilpivirine)及2种PIs(Nelfinavir and Lopinavir)的表型耐药情况。Zalcitabine(DDC) 和Dapivirine(DPV)两种药物在现有数据库中无基因型耐药情况分析。对10种药物的表型 耐药与基因耐药结果进行分析，表明，大部分一致(表4)。例如，HIV-1毒株0022表型耐药分 析对DDI和D4T两种药物敏感，但是基因型耐药分析显示为中度或高度耐药，毒株0312对ETR 表型耐药分析为高度耐药，但基因型分析为低度耐药。
[0043] 表4HIV-1毒株的基因型和表型耐药分析比较
注:DDI，地达诺新;D4T，司他夫定;AZT，齐多夫定;DDC，扎西他滨;FTC，恩曲他滨;ABC， 硫酸阿巴卡韦；NVP，奈韦拉平;ETR，依曲韦林;DPV，达匹韦林;RPV，利匹韦林;NFV，奈非那 韦;LPV，洛匹那韦。
[0044] (3.4)本发明重组慢病毒在TZM-B细胞中的应用 使用该重组慢病毒体系共转染TZM-B细胞，以评价HIV-1抑制药物是否影响病毒感染和 蛋白生产，齐多夫定(D4T)作为抗病毒药物代表，以优化检测条件。
[0045] (3.4.1 )HIV药物司他夫定敏感性与细胞数目相关实验 铺板96孔板TZM-B细胞，分5组，每组分别为10000、15000、20000、25000、与30000个/孔， 当细胞汇合度达到80 %时，按照每孔细胞数目计算Μ0Ι = 10时所需要的病毒液体积。配制不 同药物浓度的司他夫定，将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中，加入到96孔TZM-B细胞 中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶基因表达情况。结果显示，细胞数目为1.5 X 104 细胞/孔时，药物浓度和焚光素酶的活性相关性最佳。结果如图7中的A图所示。
[0046] (3.4.2汨1￥药物司他夫定敏感性与病毒101相关实验 铺板96孔板TZM-B细胞，每孔20000个细胞，共设置10个实验组，当细胞汇合度达到80 % 时，计数每个实验组孔中的细胞数目，按照每孔细胞数目计算当Μ0Ι分别为2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，并将上述所需病毒液 加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液，加入到96孔TZM-B细胞中。感染60 小时后，检测每孔细胞荧光素酶基因表达活性。结果显示，MOI为10时，药物浓度和荧光素酶 的活性相关性最佳。结果如图7中的B图所示。
[0047] (3.4.3)HIV药物司他夫定敏感性与病毒感染时间相关实验 铺板96孔板TZM-B细胞，分4组，每组20000个/孔，当细胞汇合度达到80 %时，按照每孔 细胞数目计算M0I = 10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，并将上述所 需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液，加入到96孔TZM-B细胞 中。分别于病毒感染36、48、60、72小时后，检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示，感染时间 为60小时时，药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图7中的C图所示。
[0048] (3.4.4)十二种抗病毒药物用于表型耐药检测的可重复性 通过测定12种抗病毒药物IC50的药物浓度来判断表型耐药检测的稳定性和可重复性。 根据上述3个实验，确定了用于表型耐药检测时的细胞数目、Μ0Ι以及病毒感染时间。铺96孔 板，当细胞汇合度达到80%时，按照每孔细胞数目计算Μ0Ι = 10时所需要的病毒液体积。与 此同时，用DMEM完全培养液配制不同药物浓度的HIV药物，将配置好的药物与病毒混合液， 加入到96孔TZM-B细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示，除了2种 药物(利匹韦林和依曲韦林)大部分药物都显示较高的重复性。结果如表5所示，其中，IC50， 能够使ZsGreen阳性细胞减少50 %的药物浓度;SD，标准差;CV，变异系数。
[0049] 表5十种药物用于表型耐药检测的可重复性
(3.4.5)病人体内HIV-1毒株的表型耐药分析 8名患者的HIV-1样本用本发明中带有双报告基因的重组慢病毒系统进行表型耐药分 析。野生型的慢病毒作为对照。病毒抑制率（％ ) = ( 1-药物处理组的荧光素酶RLU/对照组的 荧光素酶RLU)X100%。用非线性回归分析每个HIV-1毒株的ICSOAIV-l毒株对每种抑制剂 的表型耐药程度用倍数变化(FC)来表示，即测试株的IC50/野生株的IC50。校正的用于表型 耐药的分类标准:FC〈3为敏感，FC = 3-6为低度耐药，FC = 6.01-10为中度耐药，FC>10为高度 耐药[6,22,23]。表4呈现了6种6冊1'18(0丨(1&11〇8；[116,3七&￥11(1;[116,2丨(10￥11(1;[116,2&1(3；^&13；[116， Emtricitabine，Abacavir Sulfate)，4NNRTIs(Nevirapine，Etravirine，Dapivirine， Rilpivirine)及2种PIs(Nelfinavir and Lopinavir)的表型耐药情况。Zalcitabine(DDC) 和Dapivirine(DPV)两种药物在现有数据库中无基因型耐药情况分析。对10种药物的表型 耐药与基因耐药结果进行分析，表明，大部分一致(表6)。例如，HIV-1毒株0022表型耐药分 析对DDI和D4T两种药物敏感，但是基因型耐药分析显示为中度或高度耐药，毒株0312对ETR 表型耐药分析为高度耐药，但基因型分析为低度耐药。
[0050] 表6HIV-1毒株的基因型和表型耐药分析比较
[0051 ] (3.5)本发明重组慢病毒在huh7.5细胞中的应用 使用该重组慢病毒体系共转染huh7.5细胞，以评价HIV-1抑制药物是否影响病毒感染 和蛋白生产，齐多夫定(D4T)作为抗病毒药物代表，以优化检测条件。
[0052] (3.5.1 )HIV药物司他夫定敏感性与细胞数目相关实验 铺板96孔板huh7 · 5细胞，分5组，每组分别为10000、15000、20000、25000、与30000个/ 孔，当细胞汇合度达到80 %时，按照每孔细胞数目计算Μ0Ι = 10时所需要的病毒液体积。配 制不同药物浓度的司他夫定，将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中，加入到96孔 huh7.5细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶基因表