制备:将上述酶解液采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分(MP60-1)，得到超滤酶解液，将超滤酶解液依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得抗氧化肽。
[0024]①离子交换树脂层析:将MP60-1溶于双蒸水配成浓度为50mg/mL的溶液，经过DEAE-52离子交换树脂层析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速为0.6 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟自由基清除能力，选择抗氧化能力最强组分冻干，即为离子交换层析酶解物MP60-3(图1);
②凝胶柱层析:将MP60-3溶于双蒸水配成浓度为50mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于280 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟自由基清除能力，选择抗氧化能力最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物MP60-3-1 (图2);
③RP-HPLC纯化:将MP60-3-1用双蒸水配成80?100yg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化(RP-HPLC条件为:进样量 15 yL;色谱柱Zorbax SB- Cis(250 mmX4.6 mm,5 μπι);流动相:水-乙腈梯度洗脱(O?32min乙腈浓度由O匀速升至50%);洗脱速度0.8 mL/min;紫外检测波长280 nm)，根据对DPPH自由基和羟自由基的清除活性得I个高活性抗氧化肽DCPE-B(图3)。
[0025]④结构检测:收集DPPH自由基和羟自由基清除活性最高的抗氧化肽DCPE-B，经RP-HPLC检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVM)，ES1-MS测定分子量为905.00 Da([M+H]+ 906.68 Da)(图4)。
[0026]将制得的灰星鲨软骨蛋白抗氧化肽Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met(GEREANVM)进行自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验，实验结果表明:Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met (GEREANVMW^PPH 自由基(EC50 2.76 mg/mL)、羟基自由基(EC50
0.22 mg/mL)、ABTS自由基(EC50 0.08 mg/mL)和超氧阴离子自由基(ECso 0.13 mg/mL)有良好的清除作用；同时，GI y-G I u-Ar g-G I u-A I a-Asn-Va 1-Me t (GEREANVM)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用(图5)。
[0027]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.灰星鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)灰星鲨软骨总蛋白粗提物的制备:称取灰星鲨软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的灰星鲨软骨浸于4?6倍体积的1.0 mol/L盐酸胍溶液中，于4 °C下揽摔抽提36?48 h;提取液在4 °C下以4000?6000 r/min离心15?25min，弃残渣收集上清液;上清液继续在4 °C、10000?12000 r/min离心15?25 min，取上清液用0.22 Mi微孔滤膜过滤除去不溶性杂质;将滤液装入分子截留量为8 000的透析袋中，用pH值为7.6的Tris-HCl缓冲液于4 °C下透析24?48 h，透析袋内溶液即为灰星鲨软骨总蛋白粗提物； 2)灰星鲨软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备:取灰星鲨软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在-20 °C下静置4?6 h后，于4 °C、10000?12000 r/min高速离心20 min，取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得灰星鲨软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，即为60%丙酮分级沉淀蛋白； 3)灰星鲨软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解:取灰星鲨软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比Ig: 3?5 mL溶于Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH 7.5?8.5)，按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0?3.0%加入胰蛋白酶(1.9X104 U/g)，于40 °C酶解3?5 h，然后于90 °C、10min灭酶活，酶解液于4 °C、10000?12000 r/min离心15?25 min，弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液； 4)灰星鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备:将上述酶解液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，冻干，得超滤酶解物;将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得抗氧化肽； 其中，所述步骤I)中的盐酸胍溶液含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH值为7?8 ；所述步骤3)中的Tris-HCl缓冲液为0.05mol/L，pH值为7.5?8.5;胰蛋白酶为1.9 X 14 U/g O2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤I)中的灰星鲨为灰星鲨即Mustelus griseus 03.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为: 离子交换树脂层析:将上述超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为45?55 mg/mL的溶液，经过DEAE-52离子交换树脂层析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速为0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为离子交换层析酶解物； 凝胶柱层析:将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为45?55 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G_15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物； 反相高效液相色谱纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80?100 yg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱纯化进行纯化，根据对DPPH自由基和羟基自由基的清除活性得I个高活性抗氧化肽Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met，ES1-MS测定分子量为905.00 Da。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述反相高效液相色谱条件为:进样量10?15 yL;色谱柱是规格为250 mmX4.6 mm,5 μπι的Zorbax SB- C18;流动相为水-乙腈梯度洗脱，O?32min乙腈浓度由O匀速升至50%;洗脱速度0.6-1.0 mL/min;紫外检测波长280nmD5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所制备的抗氧化肽Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met为八肽化合物，ES1-MS测定分子量为905.00 Da。
【专利摘要】本发明公开了一种灰星鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，本发明以灰星鲨软骨为原料，通过总蛋白提取、丙酮分级沉淀、胰蛋白酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Gly-Glu-Arg-Glu-Ala-Asn-Val-Met，ESI-MS测定分子量为905.00？Da；制备的高活性抗氧化肽具有较强的自由基清除活性和良好的脂质过氧化抑制作用，可以作为药品、保健食品或食品添加剂等进行开发。
【IPC分类】C07K1/20, C07K7/06, C07K1/18, C07K1/30, C12P21/06, C07K1/36, C07K1/34, A61P39/06, C07K1/16
【公开号】CN105648007
【申请号】
【发明人】王斌, 王晓丽, 赵玉勤, 孙坤来
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2015年12月31日