述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本 发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0031] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售 产品。
[0032]除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语"和/或"包括一个或多个相关的所列 项目的任意的和所有的组合。
[0033]本发明脱氧核糖核酸酶的检测方法步骤为：1)制备DNA探针，2)将样本与底物DNA 探针接触，3)荧光定量PCR仪检测步骤1)接触反应后的荧光强度。优选步骤还包括步骤4)， 将荧光强度转化为酶含量。转化方法包括标准曲线法，即通过建立荧光强度与与DNase含量 之间的标准曲线关系，从荧光强度值获得酶含量的绝对值。DNA探针为两端或内部分别标记 荧光基团及其淬灭基团的具有发夹结构(或茎环结构）的寡聚核苷酸底物。在DNase作用下， 探针底物被切开，荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。在步骤2)之前，样本可经过其他处 理，包括离心、过滤、稀释、浓缩、透析、试剂的加入、干扰物的灭活，或其他物理处理或化学 处理方式。
[0034]本发明所述检测方法的应用可至少包括以下三方面：一、直接测试样本中是否存 在DNase酶;二、直接或间接定量酶的含量或相对含量。间接定量酶活包括:应用本发明方法 对含有已知酶含量的系列样本进行测试，并绘制标准曲线;根据待测样本相对酶含量水平 在曲线上的位置，即可获得该样本的绝对酶含量;三、样本间的酶含量较:可以比较两个或 多个样本间的酶含量水平高低，例如一个对照样本和待测样本。
[0035]所述DNA探针至少包含一个能被DNase切割的位点，即裂解位点，该裂解位点可以 是任何发生DNase酶裂解反应的位点，可以存在于底物分子核苷酸临近残基间或核苷酸分 子与荧光基团或淬灭基团之间。底物分子被至少裂解为两个分离的片段，荧光基团和淬灭 基团在不同的片段上，在有荧光基团基团或淬灭基团的裂解片段中，核苷酸数可以为零。
[0036] 本发明的待检样本被怀疑具有脱氧核糖核酸酶，其脱氧核糖核酸酶含量可为零或 低于对照。本发明的样本可源自任何来源，包括液体(不限于溶液、悬浮液、乳浊液或它们的 组合等)及溶于液体介质的固体、半固体、胶状体或其组合。样本优选生物制品、试剂、实验 室用水、表面环境(如实验台，容器、仪器表面等）的擦拭物等。上述液体也可为生理流体，如 血液、唾液、尿液、滑液、脑脊髓液、脓液、汗液、分泌液、乳汁等。样品可源自身体特定部位， 如皮肤、头皮、指甲、伤口等。样本还包括细胞、细胞裂解物、组织、活组织切片、器官等或它 们的组合等。
[0037] 酶解反应的缓冲液可包括一价无机盐和/或二价无机盐离子化合物，一价无机盐 离子化合物优选NaCl和/或KC1，其中NaCl可提供合适的离子强度环境。二价无机盐离子化 合物优选1 8(：12、0&(：12，、111(：1 2或其组合<&(：12尤其适用于检测耐热脱氧核糖核酸酶的活 性。缓冲液的pH值可由Tris盐来调节，pH值优选6.5~9.0。任何有利于检测酶含量，如检测 的准确性、精确性、或灵敏度，的辅因子都是可以加入的。
[0038] 本发明的荧光基团或淬灭基团不会消弱或增强酶与底物的反应，也不会影响酶解 反应的动力学参数。
[0039] DNase优选Exonuclease I和DNase 1〇
[0040] 在一种实施方式中，所述DNA探针至少包含一个修饰的核糖核苷酸;修饰的核糖核 苷酸优选具有核酸酶抗性和/或提高特异性的修饰的核糖核苷酸。其中，所述修饰方式为磷 酸骨架基团、核糖基团或碱基基团中的至少一种或组合修饰;优选磷酸骨架基团的硫代磷 酸修饰，其中，被修饰的核苷酸位于DNA探针的5'端和/或3'端。
[0041] 根据本发明的一种实施方式，所述能量供体基团和所述能量受体基团位于DNA探 针的两端(5'端或3'端），也可位于DNA探针内部，只要二者之间存在能被DNase切割的键;根 据本发明的一种实施方式，其中，所述能量供体基团为荧光基团，所述能量受体基团为荧光 淬灭基团。荧光基团和荧光淬灭基团选自？41^六11^、册乂、0￥染料、8〇!1、0 &1^71。荧光分子可 通过合适的方式与包括有裂解位点的裂解区连接。连接可以是直接的共价键，也可以是通 过连接器连接。连接器是能够介导检测区域(寡聚核苷酸)和报告基团（荧光基团或淬灭基 团)之间连接的任何分子。
[0042]实施例1:探针的制备
[0043] 1序列设计
[0044] 设计原则如下，可参见图1。
[0045] 1)两端带有5~15bp的回文互补序列(带下划线部分）
[0046] 2)中间是5~20nt的DNA序列（环区）
[0047] 3)探针退火后可形成发夹结构，两个回文互补部分Tm值大于35°C;其茎结构包括 至少一个T，其环结构包括至少一个1个A、1个C、1个T和1个G
[0048] 4)两端带有荧光基团及其对应的淬灭基团。荧光基团及其淬灭基团可修饰于序列 的两端或者序列中的任一 DNA碱基。
[0049] SEQID.N0.1-8(附图中为SEQ 1-SEQ 8)序列如下。
[0050]
[0052] 2探针合成
[0053] 委托上海捷瑞生物科技有限公司合成以上序列，高压液相色谱纯化，纯度高于 90%，制成冻干粉，-20°C保存。
[0054] 实施例2
[0055] 1.试剂合成及配制
[0056] 1.1.DNase test Probe
[0057] 探针为实施例一中合成的8条探针。
[0058] 1,2.DNase Test Probe溶液的配制
[0059] 储液配制（100pmol/ul):每管DNase Test probe干粉加入灭菌Mini-Q水至终浓度 为 100pmol/ul，-20°C 避光保存
[0060] 工作液配制（10pmol/ul):取无 DNase 1.5ml管，加入90ul ddH2〇及 10ul DNase Probe储液，混合均匀，-20 °C避光保存。
[0061 ] 1.3.反应缓冲液
[0062] 配方：500mM NaCl，200mM KCl，500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH8.0
[0063] 按以上配方用超纯水配制成10X反应缓冲液，高温高压灭菌，_20°C保存。
[0064] 1.4.DNase I阳性样品
[0065] DNase I(TAKARA)，浓度5U/ul。用IX反应缓冲液稀释至O.OlU/ul。
[0066] 2.方法与步骤
[0067] 2.1.反应体系的配制 DNase Test Probe 工作液（！0pmol/ul) 0 5ul
[0068] 1〇χ反应缓冲液 lul DNase I (O.OlU/ul) lul
[0069] DNase free ddHiO add to lOul
[0070] 将以上除DNase I外的组分混合均匀，95°C加热3min，然后65°C~25°C，每30秒下 降5°C，使探针退火。取白色8联PCR管，放置于96孔板上，每孔加入反应液9ul，然后加入lul DNase I (0.01U/ul)。以无 DNase的ddH20代替样品为阴性对照组，每个反应设2个重复。反应 体系配制完成后，将放有8联管的96孔板放置于离心机吊舱中稍离心lmin，使反应液沉淀于 管底。
[0071] 2.2.荧光定量PCR仪上孵育及读取荧光
[0072] 打开BioRed C1000Q-PCR仪，放入8联管，关上盖子。荧光通道选"HEX" "CY5" "CY3"， 37°C孵育lh，每隔30秒读取一次荧光值(RFU)。反应完成后，去除基线，导出RFU数据表。以时 间为横坐标，RFU为纵坐标作带连线的XY散点图。对比不同探针在相同反应时间下的反应速 率及反应平衡后的荧光强度。
[0073]