144] Taq DNA Polymerase：Thermo；lU/ul
[0145] T4DNA Ligase：Thermo；5U/ul〇
[0146] 2.方法与步骤
[0147] 2.1.反应体系的配制 DNase. Test Probe 工作液（l_molM ) 0 5ul 10 x反应缓冲液 l__ul
[0148] 样品 lul DNase free ddHaO add to lOul
[0149] 将以上除样品外的组分混合均匀，95°C加热3min，然后65°C~25°C，每30秒下降5 °C，使探针退火。取白色8联PCR管，放置于96孔板上，每孔加入反应液9ul，然后加入样品。以 无 DNase的ddH20代替样品为阴性对照组，每个反应设2个重复。反应体系配制完成后，将放 有8联管的96孔板放置于离心机吊舱中稍离心lmin，使反应液沉淀于管底。
[0150] 2.2.荧光定量PCR仪上孵育及读取荧光
[0151] 打开BioRed C1000Q-PCR仪，放入8联管，关上盖子。荧光通道选"CY3"，37°C孵育 lh，每隔30秒读取一次荧光值(RFU)。反应完成后，去除基线，导出RFU数据表。以时间为横坐 标，RFU为纵坐标作带连线的XY散点图，，以RFU值高于阴性对照组1.1倍为阳性判断标准。
[0152] 3.结果
[0153] 图6表明，SEQ ID勵.7对3种具有0嫩外切活性的酶(1(1611〇￥、？111^〇11、了39)均检出 DNase活性，而没有DNA外切活性的酶(T4DNALigase)则未检测DNase活性。
[0154] 实施例7:对E.coli菌体裂解上清液中DNase活性的定量测定
[0155] 1.试剂合成及配制
[0156] 1.1 .DNase test Probe
[0157] 探针为SEQ ID N0.7
[0158] 1 · 2DNase Test Probe溶液的配制
[0159] 配制方法同实施例二
[0160] 1.3.反应缓冲液
[0161] 配制方法同实施例2
[0162] 1.4.DNase I标准品：（TAKARA)，浓度5U/ul〇
[0163] 2.方法与步骤
[0164] 2.1.DNase I浓度标准曲线溶液的配制
[0165] 按下表配制一系列不同浓度的DNase I标准溶液
[0166]
[0167] 2.2.样品准备：
[0168] 取lml经37°C过夜培养的E.coli菌液，12000rpm离心lmin，去上清液。加入裂解缓 冲液（50mM Tris、50mM NaCl、5 %甘油、pH8.0) 150ul，震荡重悬沉淀，然后用超声波细胞破 碎仪裂解菌体。裂解后产物12000rpm离心10min，取上清液，用裂解缓冲液稀释10倍备用。
[0169] 2.3.反应体系的配制 DNase Test Probe 工作液（lOpmol/ul) 0 5ul 1〇χ反应缓冲液 ?ι?
[0170] DNase标准溶液或样品液 Μ DNase free ddH2Q add to lOul
[0171] 将以上除样品外的组分混合均匀，95°C加热3min，然后65°C~25°C，每30秒下降5 °C，使探针退火。取白色8联PCR管，放置于96孔板上，每孔加入反应液9ul，然后加入样品。以 无 DNase的ddH20代替样品为阴性对照组，每个反应设2个重复。反应体系配制完成后，将放 有8联管的96孔板放置于离心机吊舱中稍离心lmin，使反应液沉淀于管底。
[0172] 2.4.荧光定量PCR仪上孵育及读取荧光
[0173] 打开BioRed C1000Q-PCR仪，放入8联管，关上盖子。荧光通道选"CY3"，37°C孵育 lh，每隔30秒读取一次荧光值(RFU)。反应完成后，去除基线，导出RFU数据表。
[0174] 3 结果
[0175] 以DNase I浓度为横坐标，37°C反应lh后的RFU为纵坐标作XY散点图，然后对各点 作线性回归，得回归方程。将样品的RFU值代入回归方程中，即可计算出样品中DNase的活性 浓度。
[0176] 图7表明，10倍稀释样品液与SEQ ID N0.7反应后的RFU值= 1687,代入以上标准方 程，DNase活性=0.058U/ul。样品原液中DNase活性为0.58U/ul。
[0177] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0178] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种DNA探针，其特征在于，其包含有一个茎环结构，且2个末端或内部分别连接有能 量供体基团和能量受体基团，能量供体基团和能量受体基团之间能进行能量转移，所述DNA 探针的碱基长度为15-50个核苷酸，且包含一个能被DNase切割的位点，被降解后的探针的 能量供体基团和能量受体基团在不同的探针片段上； 所述茎环结构中，其茎结构包括分别位于探针两端的5~15bp的回文互补序列，其环结 构包括长度为5~20nt的核苷酸序列，探针退火后形成茎环结构，两个回文互补部分Tm值大 于 35°C。2. 根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述茎环结构中，其茎结构包括至少一 个T，其环结构包括至少一个1个A、1个C、1个T和1个G。3. 根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述能量供体基团为荧光基团，所述能 量受体基团为其对应的荧光淬灭基团。4. 根据权利要求3所述的DNA探针，其特征在于，所述荧光基团和荧光淬灭基团选自 FAM、TAMRA、HEX、CY染料、BQH、Dab cy 1。5. 根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针选自如SEQ IDNO. 1-SEQ IDNO. 8所示中的至少一条。6. 根据权利要求1-5任一项所述的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针至少包括一个具 脱氧核糖核酸酶抗性和/或提高酶解特异性的修饰的核糖核苷酸。7. 根据权利要求6所述的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针的末端的核糖核苷酸为硫 代磷酸核糖核苷酸。8. -种脱氧核糖核酸酶的检测试剂盒，其特征在于，包括有权利要求1-7任一项所述的 DNA探针。9. 一种脱氧核糖核酸酶的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 1) 制备如权利要求1-7任一项所述DNA探针作为底物； 2) 将待检测样本与步骤1)中所述底物接触； 3. PCR荧光定量检测，检测步骤2)接触反应后的底物的荧光强度。10. 根据权利要求9所述的脱氧核糖核酸酶的检测方法，其特征在于，其步骤还包括在 PCR荧光定量检测之前在反应体系中加入缓冲液，所述缓冲液成分包括0.01~5M NaCl， 0.01 ~5M KCl，50mM~1M Tris-HCl，10~100mM MgCh，缓冲液的pH值6.5~9.0。
【专利摘要】本发明提供一种检测脱氧核糖核酸酶活性的DNA探针、试剂盒和方法，采用发夹状DNA探针为脱氧核糖核酸酶的底物，探针的两端或内部分别标记上荧光基团及对应的荧光淬灭基团。当探针结构完整时，荧光基团与淬灭基团位于同一个DNA分子上，荧光基团被激发的荧光被淬灭基团吸收，荧光基团不发出荧光；而当探针被脱氧核糖核酸酶降解后，荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团能正常发出荧光。采用实时定量PCR仪检测反应体系中发出的荧光强度，即可判断反应体系中是否存在脱氧核糖核酸酶。本方法可广泛用于生物制品中脱氧核糖核酸酶残留的质量检测，或用于脱氧核糖核酸酶定量测定。
【IPC分类】C12Q1/34, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105648062
【申请号】
【发明人】张必良, 刘霭珊, 曹亮, 克雷格·梅洛
【申请人】广州市锐博生物科技有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月3日