Maff在诊断和区分冠心病和冠心病合并糖尿病中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物医药领域，具体涉及MAFF在诊断和区分冠心病和冠心病合并糖尿 病中的应用。
【背景技术】
[0002] 冠心病(coronary heart disease，CHD)在心血管系统疾病中占有重要地位，它是 由冠状动脉发生粥样硬化引起的管腔狭窄或闭塞，导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏 病。被认为是世界上最常见的死亡原因之一，近年来该病在国内的发病率不断上升，成为人 民健康的巨大威胁。糖尿病是冠心病的主要危险因素之一，在糖尿病人群中冠心病的发病 率较高，与单纯冠心病患者相比，其冠状动脉病变多呈弥漫性，多支病变的发生率较高，且 管腔的狭窄程度较重。有报道显示新诊断的糖尿病患者一半己有大血管损伤，提示糖尿病 既是一种血管性疾病，也是一种炎症性疾病。随着糖尿病的患病率的增加，其患病人群中的 青壮年人逐年增长，对社会和家庭的危害更加严重。冠心病合并糖尿病较单纯冠心病发病 率高数倍，并且病情进展迅速，危害更甚。虽然目前已经对冠心病的研究取得较大进展，但 是冠心病合并糖尿病的发病研究较少，二者的发病机制仍有待阐明。临床迫切需要寻找冠 心病、冠心病合并糖尿病的分子诊断标记，进行早预防、早治疗，尤其是对冠心病合并糖尿 病患者，早期诊断将有效提高患者生存率。
[0003] 为解决目前冠心病和冠心病合并糖尿病早期分子诊断标记稀缺的问题，发明人对 2例单纯冠心病患者，6例冠心病合并糖尿病患者及10例健康人对照外周血样本进行高通量 测序，比较冠心病与健康对照、冠心病结合糖尿病与健康对照、冠心病与冠心病合并糖尿病 三组数据，挑选出差异表达基因 MAFF，进一步，通过实验证实了MAFF基因与冠心病和冠心病 合并糖尿病具有很好的相关性，并且可以用来区分这两种疾病，为临床的防治提供参考，进 一步，发明设计了针对MAFF的高效干扰RNA，为后续治疗制剂的研制提供基础。本发明提供 的冠心病和冠心病合并糖尿病辅助诊断靶标具有很好的临床应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供MAFF基因和/或其蛋白抑制剂在制备抗冠心病和/或冠心 病合并糖尿病制剂中的应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因 MAFF，继而通过分子生物学方法验证了MAFF与冠心病和冠心病合并糖尿病的关系:MAFF 与冠心病和冠心病合并糖尿病具有很好的相关性，可用于制备抗冠心病和冠心病合并糖尿 病制剂和/或冠心病和冠心病合并糖尿病诊断制剂，具有重要的临床应用价值。
[0006] 进一步，抗冠心病和/或冠心病合并糖尿病制剂是指可以抑制MAFF基因的表达的 制剂。本领域人员熟知抑制基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种:通过激 活MAFF基因的抑制基因、激活MAFF基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制MAFF 基因表达、激活促进MAFF基因 mRNA降解的mi croRNA、导入促进MAFF基因编码蛋白降解的分 子、抑制促进MAFF基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活MAFF基因的抑制基因、激活抑 制MAFF基因表达的蛋白、导入抑制MAFF基因表达的s iRNA、激活促进MAFFmRNA降解的 m i croRNA、导入促进MAFF蛋白降解的分子、抑制促进MAFF基因表达的因子及蛋白的表达。
[0007] RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA 特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内 某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。s iRNA设计 完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉 淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体 试剂法等途径转染细胞。
[0008] 进一步，所述抑制MAFF基因表达的siRNA靶点序列选自下列序列中的一种和/或几 种：SEQ ID NO.USEQ ID N0.4、SEQ ID N0.7。优选siRNA靶点序列为SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3〇
[0009] 进一步，所述抑制MAFF基因表达的SiRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种： SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9。优选 siRNA序列为SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9。
[0010] 本发明的目的在于提供一种抗冠心病和/或冠心病合并糖尿病制剂，抗冠心病和/ 或冠心病合并糖尿病制剂抑制MAFF基因的表达。进一步，抗冠心病和/或冠心病合并糖尿病 制剂中含有抑制MAFF基因表达的s iRNA。
[0011] 本发明的目的在于提供检测MAFF基因和/或其表达蛋白的制剂在制备冠心病和/ 或冠心病合并糖尿病诊断制剂中的应用。
[0012] 进一步，冠心病和/或冠心病合并糖尿病的诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基 因芯片方法检测外周血中MAFF基因和/或MAFF蛋白的表达。
[0013] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记 跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的 初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。 多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复 性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0014] 基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚 合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶 基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列， 通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针 阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测 技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面:一是高度的灵敏性和准确性;二是快速 简便;三是可同时检测多种疾病。
[0015] 用于荧光定量PCR方法检测冠心病和/或冠心病合并糖尿病中MAFF基因的产品含 有一对特异性扩增MAFF基因的引物;所述的基因芯片包括与MAFF基因的核酸序列杂交的探 针。
[0016] 进一步，冠心病和/或冠心病合并糖尿病的诊断制剂包括用免疫方法检测MAFF蛋 白的表达。优选所述免疫检测方法检测冠心病和冠心病合并糖尿病中MAFF蛋白表达的为 western blot和/或ELISA和/胶体金检测方法。
[0017]酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的ELISA JLISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸 酶(AP)。
[0018] 常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作 载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应 的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金 标记试剂(抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上 后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的 抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集 在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
[0019] 进一步，检测MAFF蛋白的ELI SA法为使用ELI SA检测试剂盒。所述试剂盒中的抗体 可采用市售的MAFF单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括:包被MAFF单克隆抗体的固相载 体