，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
[0020] 进一步，检测MAFF蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的 MAFF单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗 滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗MAFF单克隆 抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0021 ] 本发明的目的在于提供检测MAFF基因和/或MAFF蛋白的制剂在区别冠心病和冠心 病合并糖尿病中的应用。
[0022] 进一步，检测MAFF基因的制剂用荧光定量PCR方法、基因芯片方法检测MAFF基因 和/或MAFF蛋白的表达。
[0023]用于荧光定量PCR方法的制剂中含有一对特异性扩增MAFF基因的引物;基因芯片 方法的制剂中包括与MAFF基因的核酸序列杂交的探针。
[0024]进一步，检测MAFF蛋白的制剂用免疫方法检测MAFF蛋白的表达。优选所述免疫检 测方法为we s t ern b 1 〇 t和/或EL ISA和/胶体金检测方法。
[0025] 本发明的目的在于提供一种检测冠心病和/或冠心病合并糖尿病的荧光定量PCR 试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基因 MAFF，采用特异的上游引物和下游引物，上游引 物序列为SEQ ID N0.12,下游引物序列为SEQ ID N0.13。
[0026] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵 敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0027] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括:特异性引物、内参引物、焚光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 12， 下游引物序列为SEQIDN0.13。所述内参引物为β-aCtin内参引物，上游引物序列为SEQID NO. 14,下游引物序列为SEQ ID NO. 15。
[0028]所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
[0029]本发明目的是提供了一种冠心病和/或冠心病合并糖尿病检测试剂盒，所述的检 测试剂盒检测MAFF蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0030] 本发明目的是提供了一种检测冠心病和冠心病合并糖尿病的基因芯片，所述的基 因芯片包括与MAFF基因的核酸序列杂交的探针。
【附图说明】
[0031] 图1是MAFF基因在冠心病、冠心病合并糖尿病外周血及健康人外周血中相对表达 量图
[0032] 图2是RNA干扰后各组MAFF mRNA相对表达水平图
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0034]实施例1样品采集与提取
[0035] 病例组(共10人，2例单纯冠心病患者，6例冠心病合并糖尿病患者，临床信息详见 表1，及对照组(共10人)要求空腹至少12h，于次日清晨7:00-8:00室温下，抽取10ml静脉血 于乙二胺四乙酸（EDTA)抗凝管，提取外周血单个核细胞PBMCs，加入lml Trizol试剂 (Invitrogen公司），充分混匀，-80°C保存标本，以用于RNA提取。所有的血样和病理结果应 真实可靠，研究经伦理委员会批准，患者知情同意。
[0036]表1病例组患者临床信息
[0037]
[0038] 提取患者和健康对照组外周血单个核细胞（PBMCs)中总RNA，要求：RNA纯度： 0D260/280 g 1 · 8，28S/18S g 1; RNA完整性：RIN值g 7 · 0。方法：RNA浓度和纯度检测方法： NanoDrop2000;RNA完整性检测方法:Agilent 2100(RNA 6000 Nano kit)、琼脂糖凝胶电泳 (琼脂糖凝胶浓度：1 %琼脂糖胶；电压:5V/cm;时间：20min)。
[0039]实施例2高通量测序及分析
[0040] mRNA文库构建:真核生物mRNA 3'末端具有ployA尾的结构，利用带有Oligo(dT)的 磁珠富集mRNA，高温片段化后，以其为模板，合成cDNA。经过磁珠纯化、末端修复、3 '末端加 碱基A、加测序接头后，进行PCR扩增，构建mRNA文库。根据RNA样本检测结果，对2例单纯冠心 病患者(GX)以及6例冠心病合并糖尿病患者(GX_TN)与正常对照组进行mRNA文库构建。
[0041 ] 测序:运用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量测序技术对mRNA进行测序，通 过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据的处理，得到最终数据。
[0042] 表达数据分析:通过对冠心病组和正常对照组测序结果的分析，筛选到488个差异 表达基因（P〈〇. 05)，其中400个基因上调，88个基因下调。通过对冠心病合并糖尿病组和正 常对照组测序结果的分析，筛选到439个差异表达基因（P〈0.05)，其中370个基因上调，69个 基因下调。通过对冠心病和冠心病组合并糖尿病组测序结果的分析，筛选到388个差异表达 基因（P〈0.05)。基于高通量转录组测序结果，我们通过比较单纯冠心病组VS正常对照组、冠 心病合并糖尿病组VS正常对照组、冠心病组VS冠心病合并糖尿病足，三组比较中同时出现 的差异表达基因50个，综合比较选取后备基于MAFF进行后期验证。
[0043] 实施例3冠心病、冠心病合并糖尿病患者、健康人外周血中MAFF基因的表达
[0044] -、材料和方法
[0045] 1、材料
[0046] 收集65例冠心病患者外周血、52例冠心病合并糖尿病患者外周血及44例健康人外 周血，对其进行分组及编号。
[0047] 2、方法
[0048] 2.1外周血总RNA的提取
[0049] 采用TRIzo膽Reagent进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行。
[0050] RNA质量判定标准:RNA样本的0D260/0D280值为1.8-2.2之间；总8祖电泳图谱有清 晰的28S、18S条带;70°C水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。 [0051 ] 2.2逆转录合成〇0嫩
[0052]米用Superscript?III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号 18080-044)进 行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
[0053] 使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lyg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μ1 反应体系，每个样品取lyg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：
[0054] 5X逆转录缓冲液5yl，10mmol/l dNTP 1.25yl，0.1mmol/l DTT 2·5μ1，30μπιπιο1/1 OligodT 2μ1，20〇υ/μ1 MMLV 1·25μ1，模板RNA lyg，加入灭菌水至总体系25以1。42°(：孵育 1 小时，72 °C 10分钟，短暂离心。cDNA保存放-20°C冰箱备用。
[0055] 2.3Real-Time PCR
[0056] 2.3.1仪器及分析方法
[0057]用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-Δ ACT法进行数据的相对定量分析。
[0058] 2.3.2引物设计
[0059] 采用在线引物设计软件，模板序列为NM_012323,引物设计后由invitrogen公司合 成。具体引物序列如下：
[0060] MAFF引物序列：
[0061] 5，-AGAAGGCAGAGGTTGTAG-3，（SEQ ID N0.12)
[0062] 5，-ATAACTCGCTTGCTGTAAG-3，（SEQ ID N0.13)
[0063] 扩增长度147bp。
[0064] Actin引物序列：
[0065] 5'-TAATCTTCGCCTTAATACT-3'（SEQ ID N0.14)
[0066] 5，-CCTTCATACATCTCAAGT-3，（SEQ ID N0.15)
[0067] 扩增长度103bp。
[0068] 操作过程如下：
[0069] 用Power