SYB.R?.Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实 验操作按产品说明书进行。
[0070] 反应体系：2 X miX 1 ΟμL;浓度为1 OuM的上游引物和下游引物各0.5μ 1;模板2μ 1;加 入灭菌蒸馏水补平至25μ1。
[0071] 扩增程序为：95°10min，（95°C15sec，59°C60sec)X35 个循环。
[0072] 样品Real-Time PCR检测：
[0073]将各样品cDNA 10倍稀释后取2μ1作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进 行扩增。同时在60-95 °C进行溶解曲线分析。
[0074] 二、实验结果
[0075]实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效 率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高;样本扩增产物溶 解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增;根据qRT-PCR的相对定量公式，比 较MAFF基因在冠心病和冠心病合并糖尿病患者外周血和健康人外周血中的表达水平。
[0076] 结果显示(具体见图1):MAFF在冠心病、冠心病合并糖尿病患者外周血中的表达水 平明显高于健康人外周血中的表达水平，分别为健康对照的约12.5倍和约5.5倍，以上结果 验证了高通量转录组表达数据的整合分析MAFF在冠心病和冠心病合并糖尿病患者外周血 中高表达的结果。此外，MAFF在冠心病患者组和冠心病合并糖尿病患者组两组间表达差异 明显，前者约为后者的2.3倍，显示MAFF是一个能有效区分冠心病、冠心病合并糖尿病的分 子标记基因。
[0077] 实施例4 RNAi抑制MAFF基因表达
[0078] 一、材料
[0079] siRNA构建与合成
[0080] 根据MAFF基因在GenBank(NCBI Reference Sequence :NM_012323)中序列设计相 应的siRNA。设计后送往合成公司合成。
[0081 ] siRNA的设计与合成：
[0082] 根据目的mRNA序列，设计3条RNA干扰靶序列及阴性对照(表2)。
[0083] 表2 siRNA转录模板序列 [0084]
[0085] 二、实验方法
[0086] (一)RNA干扰技术抑制HEK293细胞中MAFF基因的表达
[0087] 1、细胞分组及瞬时转染
[0088] (1)细胞分组
[0089] C组：空白对照组；C1组：转染非特异性的siRNA组；SI，S2，S3组：转染特异性的 siRNA 组。
[0090] (2)转染
[0091 ]按照Lipofectamine?2000Transfection Reagent提供的步骤进行。
[0092] ①转染前24h，取对数生长期的细胞用胰酶消化并计数，用DMEM培养基调整细胞浓 度为1 X 105/ml，取2ml接种于六孔板，放置于37 °C，5 % C02培养箱中培养，在细胞达80 %融合 时用于转染。在转染前用不含血清的DMEM培养基培养3-4h。
[0093] ②配制转染液体：
[0094] A液：250ul无血清培养基稀释4. OugDNA，温和混匀；
[0095] B液：250ul无血清培养基稀释10ul Lipofectamine，温和混勾，室温放置5min;
[0096] ③转染:A液与B液混合在一起，室温保温20min，直接将复合物加入到每孔中，摇动 培养板，轻轻混匀。在C02培养箱中37 °C保温24-48h，6h后换液，加入含血清的培养基。
[0097] 2、应用Real-time PCR方法检测转染前后MAFF基因表达的变化
[0098]①标准曲线的构建:选取在50mL培养瓶中正常培养的HEK293细胞1瓶，提取RNA，测 定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于104-10°copies/ul的DNA模板，分别加入MAFF引物和内参照actin引物，配制25ul反应体系，使用 Real-time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到MAFF和act in的标准曲线。
[0099]②Real-time PCR方法检测转染前后MAFF基因表达的变化:提取各组细胞的RNA， 测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进行MAFF和actin的Real-time PCR反应，实验重复三次。
[0100]③对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
[0101]三、实验结果
[0102] 应用Real-time PCR方法构建MAFF和actin的标准曲线，相关系数分别为0.9897， 0.9914，线性关系良好，符合要求。用双标准曲线的方法比较各组MAFF基因的表达。空白对 照组、非特异性转染组基因的表达基本相似，差异无统计学意义。MAFF- SiRNAl、MAFF-siRNA2、MAFF-siRNA3三组转染后均有抑制MAFF基因表达的作用，MAFF-siRNAl和MAFF-siRNA2的作用更明显，抑制效率达79%和73%，而1^??-8丨1?嫩2的抑制作用为38%，与空白 对照组、非特异性转染组相比，差异有统计学意义，P〈〇.〇5(图2)。
[0103]发明采用高通量测序筛选出冠心病、冠心病合并糖尿病致病相关基因 MAFF，结合 分子细胞生物学实验验证，证实了MAFF与冠心病、冠心病合并糖尿病病具有很好的相关性。 本发明为冠心病和冠心病合并糖尿病临床诊疗提供了新的靶标，具有很好的临床应用前 景。
【主权项】
1. MAFF基因和/或MAFF蛋白抑制剂在制备抗冠心病和/或冠心病合并糖尿病制剂中的 应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抗冠心病和/或冠心病合并糖尿病制剂可 以采用下述方法中的一种和/或几种抑制MAFF基因的表达:通过激活MAFF基因的抑制基因、 激活抑制MAFF基因表达的蛋白、导入抑制MAFF基因表达的siRNA、激活促进MAFF mRNA降解 的m i croRNA、导入促进MAFF蛋白降解的分子、抑制促进MAFF基因表达的因子及蛋白的表达。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抑制MAFF基因表达的s iRNA靶点序列选自 下列序列中的一种和/或几种：SEQ ID NO.USEQ ID N0.4、SEQ ID勵.7，优选8丨1?熟靶点序 列为SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3。4. 检测MAFF基因和/或其表达蛋白的制剂在制备冠心病和/或冠心病合并糖尿病诊断 制剂中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，诊断制剂检测外周血中MAFF基因和/或 MAFF蛋白的表达。6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，冠心病和/或冠心病合并糖尿病的诊断制 剂采用荧光定量PCR方法或基因芯片方法检测MAFF基因的表达，优选的，荧光定量PCR方法 的诊断试剂含有一对特异性扩增MAFF基因的引物;基因芯片方法的诊断制剂含有与MAFF基 因的核酸序列杂交的探针。7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，冠心病和/或冠心病合并糖尿病的诊断制 剂包括用免疫方法检测MAFF蛋白的表达，优选的，免疫方法检测MAFF蛋白表达的为ELISA检 测试剂盒和/胶体金检测试剂盒。8. 检测MAFF基因和/或MAFF蛋白的制剂在区别冠心病和冠心病合并糖尿病中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，检测MAFF基因的制剂用荧光定量PCR方法、 基因芯片方法检测MAFF基因和/或MAFF蛋白的表达。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR方法检测MAFF基因采用特异 的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 12,下游引物序列为SEQ ID NO. 13。
【专利摘要】本发明涉及MAFF在诊断和区分冠心病和冠心病合并糖尿病中的应用。基于高通量测序的方法对冠心病、冠心病合并糖尿病患者及健康人外周血进行测序，比较冠心病与健康对照、冠心病结合糖尿病与健康对照、冠心病与冠心病合并糖尿病三组数据，挑选出差异表达基因MAFF，进而通过实验验证MAFF基因与冠心病和冠心病合并糖尿病的相关性。本发明提供的MAFF基因不仅能作为冠心病、冠心病合并糖尿病的诊断靶点，还可以用来区分这两种疾病，具有很好的临床应用价值。
【IPC分类】G01N33/68, C12Q1/68
【公开号】CN105648093
【申请号】
【发明人】宫蕊
【申请人】宫蕊
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月16日