本试剂盒中的包被抗体；将实施例2中利用HSP90 α -1抗原表位肤（2)制备的多 克隆抗体（2)作为结合抗体。
[0165] HSP90 α -1体外诊断试剂盒的制备和操作如下：
[0166] 1.各种缓冲液及试剂的配制：
[0167] Α、包被缓冲液；0. 050Μ、ρΗ9. 6的CB (碳酸盐缓冲液）
[016引 化2〔03;16. 0 克
[0169] Na肥03;29. 0 克
[0170] 蒸傭水溶至1000ml
[0171] B、样品 / 洗涂缓冲液；pH7. 2 的 lOXPBS-Tween 20
[017引 胞2册04 · 12&0 ;58 克
[017引 K&P04;4 克
[0174] 化 ciaoo 克
[0175] KC1;4 克
[0176] 蒸傭水溶至1000ml
[0177] 加 Tween 20 ;20ml
[0178] C、酶柄;记物稀释液
[0179] lOXPBS-Tween 20 ：10ml
[0180] FCS (小牛血清）；20ml
[0181] 蒸傭水溶至1000ml
[0182] 酶稳定剂（可购自上海西宝公司）；1克
[0183] 生物防腐剂（可购自上海西宝公司）；1ml
[0184] D、显色剂 A:
[0185] 巧樣酸：35.5克
[0186] 过氧化脈；10克
[0187] 蒸傭水溶至1000ml
[0188] Tween 20 ; 10ml
[0189] 6、显色剂6:
[0190] 巧樣酸：120克
[0191] 邸TA-2化；1 克
[019引 TMB.2肥1:2 克
[0193] 蒸傭水溶至1000ml
[0194] F、终止液；2M H2SO4
[0195] 浓硫酸巧5-98%);22.21111
[0196] 蒸傭水：177. 3ml
[0197] 配时将浓硫酸缓慢滴入蒸傭水中，边加边摇匀。
[019引 2.预包被板的制备：
[0199] 将服P90 α -1单克隆抗体（1)溶于抑=9. 6的0. 05M的碳酸盐缓冲液中，制成预 包被液，在酶标板（可购自深圳金灿华公司）上每孔按0.1 μ g/孔加入100 μ 1，置4°C放置 18-24小时，取出，甩掉包被液，用样品/洗涂缓冲液洗涂，经1 (w/v) % BSA-0. 05M己醇胺封 闭16小时、过夜干燥后装入铅笛袋中抽真空密封，并置于4Γ保存。
[0200] 3.结合抗体化SP90 α -1多克隆抗体（2))和酶联物（辣根过氧化物酶标记的羊抗 兔IgG抗体）（购自北京中杉金桥公司）的稀释比例均由方阵滴定实验确定，辣根过氧化物 酶标记的羊抗兔IgG抗体使用酶标记物稀释液稀释。
[0201] 4.试剂盒的组成：
[0202] 预包被板：48/96孔
[020引服P90 α -1校准品（原料购自上海联硕公司）；7个；7 X 1. 0ml (浓度分别为25ng/ ml、10ng/ml、5ng/ml、2. 5ng/ml、lng/ml、0. 5ng/ml、0. 25ng/ml)
[0204] HSP90 a -1 结合抗体；1 X 10ml (经 1:5000 稀释）
[0205] 酶联物；1 X 10ml (经 1:5000 稀释）
[0206] 浓缩洗涂液（25XPBS-Tween 20) ;lX20ml
[0207] 显色剂 A;1X6. 0ml
[020引 显色剂 B;1X6. 0ml
[0209] 终止液；1 X 6. 0ml
[0210] 5.试剂盒的操作步骤：
[0211] 在预包被板的各孔中分别加入待检血样W及标准品100μ 1/孔，均为双孔，37°C 赔育60分钟，用1 X洗涂缓冲液洗涂5次，拍干。在各孔内加入HSP90 α -1结合抗体100 μ 1/ 孔，37°C赔育30分钟，用IX洗涂缓冲液洗涂5次，拍干。再在各孔内加入酶联物100 μ 1/ 孔，37°C赔育30分钟，用1 X洗涂缓冲液洗涂5次，拍干。加入显色剂Α、Β液，每孔各50 μ 1， 混匀，37°C赔育15分钟。加终止液50 μ 1/孔终止反应，用酶联检测仪（型号RT-6000,可购 自雷杜公司）用双波长（450nm、620nm)检测吸光度。
[0引引 6.结果判定：
[0213] 表1 ;标准品浓度和对应的平均吸光度（0D)值
[0214]
邮1引 W标准品浓度和对应吸光度的对数值绘制标准曲线，标准曲线的R2 = 0. 978。
[0216] 根据标准曲线计算所检测的标本中的服P90 α -1浓度结果。
[0217] 对30例肿瘤病人和81例健康者按上述方式进行血清服Ρ90 α -1检测，肿瘤病人 血清中的服Ρ90 α -1含量明显高于健康对照组，差异有统计学意义（Ρ<〇. 01)，见表2。
[0引引表2 ;两组样本服Ρ90 α -1浓度比较
[0219]
[0220] 由W上数据可知，本发明的试剂盒可有效且特异性地检测血清中的服P90 α -1含 量，从而检测出肿瘤病人和正常人之间的HSP90 α -1含量差异，由此可判断肿瘤的发生。
【主权项】
1. 一种人HSP90 α-1抗原表位肽，其中所述HSP90 α-1抗原表位肽的氨基酸序列为： Tyr-Pr〇-Arg-Asp-Arg-Leu-Asp-Pr〇-Arg-Pr〇-Gly-Ser-Pr〇-Ser-Glu-Ala_Ser 〇2. -种HSP90 α -1抗原，其是通过使权利要求1所述的人HSP90 α -1抗原表位肽与载 体蛋白偶联制备而成的。3. -种人HSP90 α -1抗体，其是由权利要求2所述的HSP90 α -1抗原制备而成的单克 隆抗体或多克隆抗体。4. 根据权利要求3所述的人HSP90 α -1抗体在制备人HSP90 α -1体外诊断试剂盒上的 应用。5. -种人HSP90 α -1体外诊断试剂盒，其包含权利要求3所述的人HSP90 α -1抗体作 为包被抗体或结合抗体。6. 根据权利要求5所述的人HSP90 α -1体外诊断试剂盒，其中所述试剂盒还包含另一 种人HSP90 α -1抗体，并且所述的人HSP90 α -1抗体和所述的另一种人HSP90 α -1抗体中 的一者作为包被抗体，另一者作为结合抗体，其中所述的另一种人HSP90 α -1抗体由包含 如以下序列所示的抗原表位的另一种HSP90 α -1抗原制备而成： Tyr-Arg-Gly-Ile-Asp-Glu-Asp-Asp-Pr〇-Thr-Ala-Asp-Asp-Thr-Ser-Ala-Ala-Val-T hr-Glu〇7. 根据权利要求5或6所述的HSP90 α -1体外诊断试剂盒，其中所述包被抗体为单克 隆抗体。8. 根据权利要求5或6所述的HSP90 α -1体外诊断试剂盒，其中所述结合抗体为多克 隆抗体。9. 根据权利要求5或6所述的HSP90 α -1体外诊断试剂盒，其中所述试剂盒还包含酶 标记的抗抗体。
【专利摘要】本发明涉及人HSP90α-1抗原表位肽、抗原、抗体、应用及试剂盒。本发明的人HSP90α-1抗原表位肽的氨基酸序列为序列表SEQ？IDNO.1所示的序列。本发明的人HSP90α-1抗原由人HSP90α-1抗原表位肽与蛋白载体偶联制得。本发明的人HSP90α-1单克隆抗体或多克隆抗体由本发明的人HSP90α-1抗原制得。本发明的人HSP90α-1单克隆抗体或多克隆抗体用于制备人HSP90α-1体外诊断试剂盒。本发明的人HSP90α-1抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，从而可应用于人HSP90α-1的体外检测。
【IPC分类】G01N33/577, C07K7/08, G01N33/68, C07K16/18
【公开号】CN105669834
【申请号】
【发明人】朱建安
【申请人】深圳市安群生物工程有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2014年11月20日