霉素(2g/ml)形成转化株2周后，转化细胞即成为稳定的细胞系。
[0043]无限增值的骨髓源性巨噬细胞制备方法参见Palleroni等1991 ；zhou等2008。
[0044]poly 1:C、poly dA: dT 和 siRNA 转染:
poly 1:C与poly dA: dT在六孔板转染，脂质体2000溶解于改良型DMEM培养基5分钟，2g poly 1:C或2g poly dA: dT溶解于改良型DMEM培养基，将以上脂质体2000溶液以及poly 1:C或poly dA: dT溶液混合，室温培养15分钟，随后，混合液加入含有1.6ml新鲜培养基的细胞中。酶联免疫吸附法中的转染试剂(polyplus制备公司)用做小干扰RNA的转染。根据厂家说明，将1nM对照组小干扰RNA或所示小干扰RNA转染J2骨髓源性巨噬细胞中。
[0045]统计方法:病毒滴度曲线使用对数秩检验进行比较。对于其他数据的统计显著性，通过 2 tailed unpaired t test, 2-tailed Mann-ffhitney U test 确定 PFU 数据，视情况使用1-way ANOVA corrected多重比较法。P取值小于等于0.05，则被认为在统计学上是显著的。所有计算均使用GraphPad Software Inc.的Windows的Prism软件程序。PFU数据中的横条为各例的平均值，各图中的误差条表示结构方程模型(SEM)和重复数据。
[0046]实施例1
RXR的表达调控着宿主易感性的水泡型口炎病毒的感染:
我们以往的基因研究已经确立了一种新型的干扰素调节因子3依赖性但干扰素非依赖性的机制来下调RXR的表达(Chow等2006)。通过不同类型的病毒感染来确定RXR的表达水平，骨髓来源的巨噬细胞被水泡型口炎病毒感染。结果表明，感染以上病毒后引起RXR的表达下调(如图1A所示XRXR基因的抑制并不是由于感染后细胞状态改变引起，因为L32控制基因没有变化(数据未显示)。给予RNA病毒类似物poly I:C和DNA病毒类似物polydA:dT，可以激活细胞内病毒，也显著抑制在骨髓巨噬细胞中RXR的表达。(如图1B所示)更重要的是，它证实了这种抑制是宿主反应抗病毒刺激产生而不是病毒直接抑制宿主基因产生的。为了确定RXR在宿主的免疫反应在病毒感染过程中是否起到作用，可以持续稳定的表达人类RXR，逆转录病毒感染产生pBABE控制载体。(如图1C所示)水泡型口炎病毒在人类RXR中感染引起过度表达的Raw264.7细胞系比对照组的细胞病毒载量更多。这个结果在不同的群体之间以及单细胞克隆持续表达人类RXR之间是一致的(数据未显示)。这些数据表明RXR的过度表达增加宿主细胞对病毒感染的易感性。
[0047]为了进一步明确RXR在宿主抗病毒感染中的作用，野生型RXR和缺乏F9胚胎癌细胞给予注射水泡型口炎病毒，通过噬菌斑测定RXR缺乏感染后细胞明显比野生型细胞对水泡型口炎病毒更具有抵抗性。(如图1E和IF所示)为了确定这种差异是否为RXR依赖性，RXR缺乏F9细胞通过逆转录病毒的感染重新建立人类RXR以及pBABE控制载体。给予三种不同的人类RXR注射水泡型口炎病毒比给予RXR缺乏F9细胞系重塑pBABE控制产生更高的病毒滴度。(如图1G-1H所示)这些结果表明RXR的缺乏降低了水泡型口炎病毒感染的宿主易感性。
[0048]综上所述，在RXR过度表达的细胞给予更多病毒感染以及RXR缺乏细胞给予较少的病毒感染，说明RXR表达水平可能调控水泡型口炎病毒感染的宿主易感性。
[0049]实施例2
RXR激动剂及其拮抗剂调节水泡型口炎病毒注射的巨噬细胞的宿主防御功能:
配体与RXR相结合可以激活其下游通路，且充分激活。为了探讨RXR配体激活是否能影响病毒感染，RAW264.7细胞给予RXR特异性激动剂Ig268和AGN194204进行过夜预处理，之后感染水泡型口炎病毒。通过菌斑实验分析，实验结果与RXR过度表达的实验结果相一致，配体激活组的RXR给予两种刺激剂之后显著增强其水泡型口炎病毒感染水平。(如图7A所示)与此相似的是，给予9-顺式维甲酸(RXR新型配体)治疗，也可以增加RAW264.7细胞系对水泡型口炎病毒感染的易感性，并且呈剂量依赖效应(维甲酸剂量范围16nM-20nM)(如图2B和7B所示)，相反，当给予特异性RXR拮抗剂HX531后，(如图2C所示)RAW264.7细胞系出现了对水泡型口炎病毒感染的抵抗增加。感染后我们采用GFP，是考虑到可以通过荧光显微镜来观察感染后细胞的形态。显然，与给予DMSO的对照组相比，给予维甲酸处理的细胞VSV感染更多、给予HX531处理的细胞VSV感染较少。(如图2C所示)F9细胞系，给予AGN194204后增加野生型细胞对病毒的易感性，对RXR缺乏的细胞没有影响，这一结果说明配体反应是RXR特异性的(如图2D所示)。为了进一步确定这一特异性配体反应，RXR缺乏F9细胞重新再造给予人类RXR，并选择单克隆细胞备用。给予AGN194204后，三种单克隆细胞中，RXR缺乏的细胞系通过人类RXR的再造，对病毒感染变得更具易感性。(如图2E所示)为了研究RXR是否可以调节VSV蛋白表达，人类RXR过度表达RAW264.7细胞给予9-顺式维甲酸和HX531，然后给予其中包含VSV-G荧光素酶受体无法复制的VSV假病毒感染。(Aguilar等2006)。HX531降低VSV荧光素酶受体活化，而9顺式维甲酸增加其活化。(如图2F所示)因为假病毒没有复制能力，受体表达增加意味着RXR激活病毒蛋白表达的活化。为了分别阐述这一数据，RAW264.7细胞预先给予DMSO处理，野生型VSV给予9顺式维甲酸处理，收集其产物，免疫印迹实验对VSV-G蛋白定量。VSV-G蛋白水平在人RXR过度表达的RAW 264.7细胞中比对照组细胞中表达要高。给予9顺式维甲酸细胞组VSV-G蛋白水平显著上升。(如图2G所示)基因组的复制是病毒成功复制的另一个关键过程。为了检验RXR激活是否影响VSV基因组的复制，VSV感染的RAW264.7细胞经过9顺式维甲酸预处理提取其RNA，负链基因组RNA(VRNA)通过qPCR定量(Simon等2007)RAW264.7细胞给予9顺式维甲酸后其VRNA在感染后两小时内上升，差异在4小时候更加明显，这些结果表明RXR激活可以提高病毒基因组RNA产生以及病毒蛋白的产生。尽管这两种过程不是直接相关的，数据表明RXR可能影响病毒周期多种进程。考虑到RXR通过形成同二聚体或异二聚体来调节其靶基因，我们通过激动剂与不同的RXR潜在同伴结合，其中包括VDR、LXR、PPAR- a、PPAR-β 以及 RAR (类视黄醇受体)(Lefebvre 等 2010 ；Roszer 等 2013)。我们发现只有配体刺激RAR可以促进VSV感染，这也暗示RAR与RXR形成异二聚体，是它的潜在同伴。
[0050]实施例3 配体激活RXR抑制多种抗病毒基因的表达:
为了研究RXR是如何减弱宿主免疫反应并有利于病毒感染，本发明发明人对给予RXR激动剂预先处理组以及巨噬细胞Poly 1:C转染组进行了基因芯片检测。结果表明9顺式维甲酸可以抑制多种Poly 1:C诱导基因，其中包括I型干扰素基因(例如IFN1、IFN2、IFN4、IFN5)Isgl5、Ifit3以及Gbp3(如图3A)考虑到I型干扰素以及其下游的干扰素刺激基因ISGs在抗病毒感染中对宿主的免疫反应发挥着重要的作用，RXR介导的对这些抗病毒基因的抑制可能是宿主对病毒感染的易感性引起的。为了验证基因数据以及证明RXR通过抑制抗病毒基因有利于病毒感染这一假说，本发明发明人给与RAW264.7细胞RXR激动剂预处理，或者给予其拮抗剂过夜处理，接着通过Poly I:C转染来模拟病毒感染刺激细胞。在转染后2小时，通过给予9顺式维甲酸，配体激活RXR对主要抗病毒基因IFNl以及Isgl5显著抑制(如图3B所示)。通过抗病毒的刺激，次要干扰素诱导基因例如Gbp-1，0as2，IRF7以及Isg20在该组表达水平也有所降低。(如图3C所示)给予RXR拮抗剂HX531，一部分但不是全部抗病毒的表达显著增加。(如图3B和3C所示)有趣的是，9顺式维甲酸以及HX531处理后给以调整部分基因的基础表达，这说明RXR的活化在正常生理状态下可能会抑制抗病毒基因激活(如图3B和3C所示)在J2病毒持续存在的骨髓巨噬细胞中，我们发现9顺式维甲酸抑制干扰素I以及干扰素4的表达，然而Poly I:C转染的巨噬细胞中，HX531对干扰素的表达增加。(如图9所示)。病毒感染可以直接触发主要抗病毒基因(例如干扰素l、Isgl5)的表达，产生干扰素，并通过自分泌/旁分泌放大抗病毒效应。(Sadler和Williams2008)。为了验证RXR是否可以抑制主要抗病毒基因的产生从而抑制干扰素非依赖性下游通路信号，I型干扰素受体缺乏的骨髓源性巨噬细胞(IFNar-/-)给予9顺式维甲酸以及HX531处理后，Poly1:C激活。在干扰素受体缺乏的骨髓源性巨噬细胞里，基因分析显示9顺式维甲酸处理组显著下调Poly 1:C产生IFNl和Isgl5的表达。(如图3D所示)而0as2、Gbpl、I rf7以及Isg20没有显著。(数据未显示)。这说明其诱导方式为干扰素依赖型。这些结果表明给予Poly 1:C刺激或，RXR的活化调节一组特定的包括干扰素在内的主要基因的表达。
[0051]实施例4
RXR通过靶向调节下游RIG-1以及TLR3信号通