稳定和控制无融合生殖的方法

专利名称：稳定和控制无融合生殖的方法
背景技术：
这项发明是关于在开花植物(被子植物)中通过无融合生殖(无融合生殖的种子形成)来固定杂种优势和其它性状。尤其是它提供了“稳定”天然或人工培育的兼性无融合生殖体(能进行有性生殖和无融合生殖的植物)的无融合生殖的方法，使无融合生殖体偶生的有性生殖子代不成为有性回复子，而和其母本一样进行无融合生殖。它还提供了“控制”天然及人工培育的无融合生殖体进行无融合生殖的方法，使这些无融合生殖体呈现专性的无融合生殖、或除诱导成兼性无融合生殖之外的专性生殖、或除诱导成专性无融合生殖之外的兼性无融合生殖。该发明用遗传、细胞遗传学和分子修饰来防止表达无融合生殖的关键座位内的基因重组(无融合生殖的稳定)。该发明还通过控制天然和人工培育的兼性无融合生殖体形成有性起源种子的频率来控制无融合生殖来源的种子百分比(无融合生殖的控制)。
本专利申请中提到的无融合生殖类型能形成无性种子。因此，无融合生殖植物的种子中含有复制了母本植物基因的胚。这些无融合生殖类型包含偶生胚胎和有配子体的无融合生殖(下文称之为无融合生殖)，通常分为无孢子生殖和二倍性孢子生殖。S.E.Asker和L.Jerling，植物无融合生殖(Apomixis in Plants)(CRC Press 1992)(以下简称″Asker& Jerling″)。
通过在大孢子母细胞(MMC)(二倍性孢子形成)或母体珠心细胞(无孢子生殖)中诱导早熟胚囊形成，负责无融合生殖的发育信号常先于大孢子形成。早熟胚胎(常常形成于柱头可接受花粉前)的形成也常常先于受精作用。无融合生殖信号强度的变化允许无融合生殖体中有性生殖的偶然性表达。因此，大多数无融合生殖体中，单一无融合生殖植物将产生一定比例的有性生殖形成的种子。该比例常受环境因素的影响(Asker & Jerling)。在蝶须属型的二倍性孢子形成中，早熟胚囊形成信号产生非常早，完全抑制减数分裂。在蒲公英属型的二倍性孢子形成中，早熟胚囊形成信号出现得稍晚些，因而减数分裂开始后影响MMC的形成。在山柳菊属型的无孢子生殖中，诱导早熟异常胚囊形成信号影响了珠心细胞。受影响的母体珠心细胞经过三轮核内细胞减数分裂，产生8核胚囊。在黍型单倍体单孢子中，只进行两回核内细胞减数分裂，因而只产生4核胚囊。在偶生胚胎中，胚形成于细胞而不是卵细胞，包括珠心细胞，珠被细胞，助细胞和反足细胞(Asker & Jerling.)。
诱导，稳定和控制作物无融合生殖的技术具有革新植物育种的潜力，逐渐成为全球农业综合企业竞争本质所在。采用该方法，育种工作者将利用植物本身的种子一代接一代地“克隆”高品质植物(表现出高度杂种优势，转基因性状等等)。因为天然作物杂种优势的固定导致产量增加，如小麦(15％)和水稻(35％)，农业上将对其进行将大规模的开发，这将使得具有极大商业价值的无性繁殖推广至全球。因为克隆只能通过种子，对发达国家的闲置农田和发展中国家资源贫乏的农民而言，无性繁殖可能成为最有价值的转移生物技术和生产力的优势的植物机制。在21世纪，无融合生殖可能成为植物育种者最有价值的遗传工具之一。于最近召开的关于无融合生殖的会议上得出如下结论“将无融合生殖引入有性生殖的作物中，是一项长期的国际科学的成果。如果无融合生殖具有足够强的适应性，其对农业将产生深远影响(Bellagio无融合生殖讨论会，为什么说无融合生殖对于农业是重要的，1998(The BellagioApomixis Conference，Why is Apomixis Important to Agriculture，1998))(http//billie.harvard.edu/apomixis/apotech.html)。
过去的100年里，提出了四种无融合生殖的遗传模式非同源染色体(远缘杂交)，数量遗传，简单遗传和复合遗传。A.Ernst支持的非同源染色体假说，Bastardierung als Ursache der Apogamie imPflanzenreich(Fischer，Jena 1918)，指出无融合生殖是染色体不同源的一项功能和远缘杂交产生的细胞遗传异常现象之一。根据该理论，无融合生殖不受基因直接控制，而是染色体结构趋异的结果。该假说已不被承认，主要是因为无融合生殖可发生在那些同源染色体的植物中。J.G.Carman，被子植物复制基因的异步表达可以引起无融合生殖，仅双孢担子形成，四孢担子形成和多胚性(Asynchronous Expression ofDuplicate Genes in Angiosperms May Cause Apomixis，Bispory，Tetraspory，and Po1yembryony)，61 Biol.J.Linnean Soc.51-94，1997。
数量模式遗传假设也不被承认。在20世纪中期，它为Muntzing和Powers所支持。Muntzing认为无融合生殖是由少数几个到多个隐性基因的稍许不平衡引起的。Powers认为隐性基因促成无融合生殖的3个主要组分减数分裂失败、无融合生殖的胚囊形成，孤雌生殖(Asker &Jerling)。
在过去的40年里，大多数的从事无融合生殖研究的科学家，包括Bashaw，Nogler，Savidan，Sherwood和Harlan，他们都支持简单遗传假说。该假说认为就是无融合生殖是由一个或两个显性基因来表达的(Asker & Jerling)。这个结论起初看起来是有根据的，因为孟德尔分析反复地产生简单的遗传分离比率例如在有性和无融合生殖植物杂交时总出现无融合生殖的和有性的子代之比为1∶1(Y.Savidan，无融合生殖遗传和培育(ApomixisGenetics and Breeding)，18，植物培育概论(Plant Breed.Rev.)13-86，2000)。然而，尽管经过多年的努力也没有找到、分离出无融合生殖基因。
在20世纪90年代后期，重复基因异步假说或杂交来源的花异步(hybridization-derived floral asynchrony)理论(下文简称HFA理论)因无融合生殖的进化而提出(J.G.Carman，61 Biol.J.Linnean Soc.51-94，1997)。它暗示了复合遗传，是建立在综合生物学各领域的概念基础之上的。根据该假说，无融合生殖遗传模式不是简单遗传，也不是简单的数量模式，至少不是普通意义上的数量遗传。相反，它是综合的，通过相互依存的5个原则序列可以得到很好的解释。前3个原则已发表(J.G.Carman，61 Biol.J.Linnean Soc.51-94，1997)，下文将做简单说明。后两原则包含对本发明而言新颖的未发表概念，本文将做叙述。
首先，无融合生殖是发育上不相连的杂种表型。无融合生殖是从母本生殖表型中分离开来的，它不是中间类型。简单而言，它标有亲本表型A和B。表现表型A或B的植物进行正常有性生殖。利用现代显微镜技术可探测A和B在细胞胚胎学上的表型差异。这种差异不是随时能观测到的，因此在此之前未对其进行描述。
其次，就减数分裂、胚囊形成和胚胎发生相对于胚珠发育的时间而言，亲本表型A和B是截然不同的。
第三，亲本表型A和B自身是数量遗传的。近专性无融合生殖时，某植物的大多数胚珠产生具有无融合生殖功能的胚囊，这种近专性无融合生殖会因为多基因的杂合性而得到表达。在无配系群(agamiccomplexes)中(有性生殖体和无融合生殖体间杂交产生的种群)的许多关键座位存在若干等位基因，也就是说关键座位是多态的。表达近专性无融合生殖的多基因杂合性，涉及因自然选择而保存在自然种群中的趋异等位基因。但是，当某些负责专性无融合生殖较关键的座位因遗传分离处于纯合状态时，常常进行兼性无融合生殖(同种植物常可同时形成有性生殖和无融合生殖的种子)。
J.G.Carman基于HFA理论，已记载了从有性生殖植物繁育成兼性无融合生殖植物的过程(J.G.Carman，产生无融合生殖植物的方法(Methods for Producing Apomictic Plants)，WO98/33374，1998)(这里引作参考)。这些方法用来培育在遗传上可能稳定和可能不稳定的无融合生殖植物。WO98/33374中提供的方法主要用于培育强无融合生殖的植物，即通过识别或者培育(通过育种)在雌性繁殖期适度趋异的亲本系对，使在兼性无融合生殖的杂种子代中尽可能的减少兼性有性子代的形成，以尽可能减少无性杂种中有性种子形成。用该方法培育出的无融合生殖体，只要在收获的种子未受有有性回复种子污染而不能再用于种植之前，可几代或多代地用作无融合生殖杂种系。回复种子是基因分离的结果，他们的存在会降低农艺学价值。这种现象类似于在常规杂种种子培育时用劣等的F2及后代和优良的F1杂种种子进行杂交。结果将生产出劣等的农产品。WO98/33374并未涉及控制和稳定无融合生殖这个方面。因此，无融合生殖体培育出来后就没有对其进行改良的方法。
综上所述，提供方法来推广那些专性的、诱导成兼性之前是专性的、或诱导成专性之前是兼性的无融合生殖系的是非常有利的。通过诱导兼性无性生殖，无融合生殖系将经常规育种策略得到改良，然后回到专性无融合生殖状态，以用于多年田间生产。应理解，本申请(以下进行讨论)的所有这些和其他优点代表了当前技术的主要进步。
本发明的另一目的是为成功改良这些无融合生殖体提供独特的植物育种实践。
本发明的另一目的是提供控制无融合生殖的方法，把经过或未经过植物育种或遗传工程改良的兼性无融合生殖体转变专性无融合生殖体，以确保其基因型和表现型特性的长期持续。
所有这些和其它目的可通过提供人工产生遗传稳定的无融合生殖植物的方法来实现。包括(a)通过种属间或种间杂交专门产生因杂交来源的花异步而表现无融合生殖的二倍体或多倍体植物，如先前WO98/33374中所详细描述；(b)通过染色体加倍或BIII杂交从所述无融合生殖植物产生多倍体衍生系，使负责无融合生殖的重复基因在相反的部分同源(种间)基因组上相互分离开，从而在多倍体衍生系中抑制部分同源基因组间的重组；或(c)通过染色体加倍或BIII杂交从所述无融合生殖植物产生多倍体衍生系，从而使负责无融合生殖的重复基因因节段异源多倍性随品种间趋异的基因组彼此分离开，并通过自交或与类似植物杂交获得有性来源的后代而增加所述无融合生殖节段异源多倍体的生育力，这些后代因为偶然的重组而表现出更强的花粉生育力、未减数胚囊形成、未减数卵细胞生育力或孤雌生殖；或(d)通过突变或其他的植物胁迫产生所述无融合生殖植物的包含一个或多个染色体畸变的衍生系，此染色体畸变可以把负责无融合生殖的重复基因在该衍生系的减数分裂期间与重组分离开；或(e)用以启动子/基因构建体表征的重组DNA转化所述无融合生殖植物，该启动子/基因构建体可导致雌性减数分裂流产。
本发明的另一个优选的实施方案涉及在遗传上稳定自然或人工产生的表现出遗传不稳定性的无融合生殖植物的方法，包括(a)从所述植物，通过染色体加倍或BIII杂交产生多倍体衍生系，从而使负责无融合生殖的重复基因在相反的部分同源(种间)基因组上相互分离开，从而抑制多倍体衍生系中部分同源染色体间的重组；或(b)从所述植物，通过染色体加倍或BIII杂交产生多倍体衍生系，从而使负责无融合生殖的重复基因通过节段异源多倍性彼此分离开，并通过自交或与相似植物杂交获得有性起源的子代，来增加所述无融合生殖节段异源多倍体的生育力，这些子代因为偶然的重组而表现出更强的花粉生育力、未减数胚囊形成、未减数卵细胞生育力、或孤雌生殖；或(c)通过突变或其他的植物胁迫产生包含一个或多个染色体畸变的所述植物的衍生系，该染色体畸变使负责无融合生殖的重复基因在该衍生系的减数分裂期间与重组分离开；或(d)用以启动子/基因构建体表征的重组DNA转化所述植物，该启动子/基因构建体可导致雌性减数分裂流产。
本发明的另一个优选的实施方案涉及遗传改良植物的方法，包括(a)鉴别或人工产生无融合生殖植物，确定所述无融合生殖植物的无融合生殖是否在遗传上稳定；如果无融合生殖植物不稳定，那么使它遗传稳定，从而产生遗传稳定的衍生系；(b)通过植物育种程序或者通过采用转基因构建体的基因遗传工程程序，在遗传上加强所述无融合生殖植物或遗传稳定的衍生系，这两者都是兼性的无融合生殖体，其中所述育种程序是将遗传上不同的有性或无性系与所述无融合生殖植物或遗传上稳定的衍生系杂交；(c)培育或转化所述植物、遗传稳定衍生系或遗传强化的衍生系，使其包含这样的遗传物质，以使得(i)雌性减数分裂中止，导致基本上100％无融合生殖种子形成，但有例外，即在可选择的情况下，表达时能引起减数分裂流产的转基因启动子/基因构建体可诱导性下调，使兼性无融合生殖被表达，在此期间，所述植物可通过植物育种程序而进一步遗传强化；或(ii)发生兼性无融合生殖，除了在表达时引起减数分裂流产的转基因启动子/基因构建体的可诱导性上调，此时导致基本上100％的无融合生殖种子形成，在此期间，无融合生殖杂种种子可被扩增；(d)转化所述植物、遗传稳定化的衍生系或遗传增强的衍生系，使其含有这样的遗传物质，使得(i)出现高频率有性种子形成(＞5％)，除了下列可选的情况，此时表达时能够强化高频率有性胚囊和种子形成的转基因启动子/基因构建体诱导性下调，从而表现出专性到近专性的无融合生殖(＜5％的有性种子形成)，在此期间，无融合生殖的杂种种子可以被扩增；或(ii)出现专性到近专性的无融合生殖(＜5％的有性的种子形成)，除了在转基因启动子/基因构建体诱导性上调时，当表达时，这些基因构建体可导致高频率的有性种子形成率(＞5％)，在此期间，通过植物育种程序，所述植物可以进一步在遗传上强化。
图2显示有性二倍体Antennaria racemosa和A.umbrinella雌蕊中的大孢子母细胞(MMC)和二分体(dyad)阶段。注意种间MMC和二分体阶段株被长度的差异。箭头表示MMC或二分体；线表示株被生长程度(和图3比较)。
图3表示了无融合生殖Antennaria racea的9个二倍体祖先在二分体、2核胚囊、和成熟胚囊期的平均株被和胚株长度(实际长度，左下和右下；成熟株被和胚株长度的百分率，左上和右上)。图8至


图11中的数据描绘了胚株发育期不同植物生态型间的变化。这些天然的生态型来源的变异以前从未表征过，它是天然或人工杂交种中出现的无融合生殖的先决条件。
图4描绘了17个生态上不同的高粱属(Sorghum)当地品种和品种减数分裂持续时间几个测量之一。减数分裂持续时间仅仅是不同生态型起源的品种间/种间变异的几种类型之一。这种变异是在有花植物不同生态型保持的胚珠发育过程中观察到的。图中的棒代表二分体期和胚囊形成开始时之间的持续时间(是内珠被生长的函数)。即短棒和长棒分别代表减数分裂和胚囊形成之间延迟得少和多。
图5表示用三个高粱属杂种亲本系在减数分裂二分体阶段的平均内珠被长度(成熟珠被长度的百分比)测量的大孢子发生(雌性减数分裂)期花芽成熟度。从杂种5和18大约5％的雌蕊中可以观察到无孢子生殖原始细胞和/或增大的多核无性(无孢子)胚囊。这些杂种的亲本大孢子发生期花芽成熟度仅有微小差异。相反，在杂种15中，大约10％的雌蕊形成多核无融合生殖(二倍性孢子(diplosporous))的胚囊、加无孢子原始细胞及胚囊。杂种15％的亲本在大孢子发生期花芽成熟度差异较大。在亲本系中，无融合生殖胚囊形成率很低(＜0.1％)。杂种5、18、15的亲本系分别是“Early Kalo”/“Karad Local”，“Vir-5049″/″Aispuri″(转化的)，和″Westland″/″Agira″。
图6绘制了在有性的蝶须属中的大孢子发生和胚囊发育；人工产生的Antennaria corymbosa(2n＝2x，有性的)×Antennaria racemosa(2n＝2x，有性的)种间无融合生殖杂种中无融合生殖(二倍性孢子)胚囊发育。该杂种大约7％的雌蕊中有二倍性孢子胚囊(diplosporous embryo sac)形成。在其亲本中并未观察到二倍性孢子形成。从图3看出，两亲本系在减数分裂期上并非强烈不同。
图7表示在有性的高粱属中的大孢子发生和胚囊发育；从有性系中人工产生的高粱属杂种中的无融合生殖(无孢子生殖)胚囊发育。该杂种中大约5％的雌蕊中观察到无孢子生殖原始细胞和/或无孢子生殖胚囊形成。在亲本系中并未观察到二倍性孢子形成。从图3可看出产生低频率无孢子生殖胚囊形成的杂种来自于与总花芽发育有关的减数分裂期并非强烈不同的亲本系。
图8表示了人工产生的兼性无融合生殖摩擦草属(Tripsacum)双倍数体(2n＝4x)中的有性大孢子发生和有性及二倍性孢子胚囊发育。该双倍数体源于杂种T.Laxum(2n＝2x，有性的)×T.pilosum(2n＝2x，有性的)。杂种中约有50％的雌蕊出现二倍性孢子胚囊形成。从细胞胚胎学上观察到减数分裂的卵形成单性生殖胚胎(出现中央细胞未受精的球形阶段胚胎)。
图9表示了人工稳定化的专性无融合生殖三物种三倍体摩擦草属杂种中的有性大孢子发生和有性及二倍性孢子胚囊发育。该杂种来源于有性二倍体(T.laxum/T.pilosum//T.zopilotense)。杂种中约有的80％的雌蕊出现二倍性孢子胚囊的形成。其他雌蕊不育。
详细说明在稳定和控制无融合生殖的本方法公开和描述之前，应该理解，该发明不受限于本文公开的特定的构思，程序步骤和材料，因为它们可在一定程度上发生变化。同时必须明了，此处使用的术语仅用于叙述具体实施方案，并非要对其进行限制，因此本发明仅受附加的权利要求书的限制。
在叙述发明背景及其实践时此文引用的出版物和其他的参考材料在这里引作参考。此处讨论的参考文献都是先于本发明之前公开发表的。毋庸质疑，发明人没权力由于更重要的发明而忽视其存在。
这里必须强调指出，除非上下文明确指出，否则说明书和附加权利要求书中用到的单数形式“一个”、“它”全包括其复数指示物。
在解释和要求保护本发明时用到一些术语，根据如下定义使用下面的术语此处用的″含有″、″包括″、″包含″、″特征在于″和语法同义词都是开发式术语，它们不排除额外的，未叙述的成分或方法步骤。″包含″可解释成包括更有限制性的术语″由……组成″和″基本由……组成″。
本文中使用″由……组成″或者其语法同义词时，排除权利要求书中未指明的任何元件，步骤或成分。
本文中使用的″基本由……组成″及其语法同义词则将权利要求的范围限制为指明材料或步骤和那些本质上不影响所要求保护的发明的基本的和新颖的特征。
此文中使用的无融合生殖植物″遗传不稳定″这一术语是指在该植物有性生殖产生的子代中有性种子形成的平均频率超过该无融合生殖植物的那些。
本文中的″稳定″兼性无融合生殖植物是指确保该植物有性生殖产生的子代中有性种子形成的平均频率不超过该无融合生殖植物的那些。
此文中采用的″完全无融合生殖″是指(1)早熟胚囊的形成先于大孢子发生，(2)早熟胚胎形成(embryony)先于受精，(3)通过假受精(中央细胞而非卵细胞受精)或自发(中央细胞未受精)形成胚乳。
无融合生殖的HFA理论的原则4和5如下原则4认为，不存在结构的或核型的杂合性时，接近专性的或兼性的无融合生殖体有性生殖产生的子代通常进行有性生殖，也就是说，它们是有性回复体。在有性配子形成期，如果不存在结构杂合性，负责亲本表型的不同等位基因发生分离。在无融合生殖体内，大孢子发生(雌体减数分裂)过程中，这一现象从很少发生至频繁发生；而在小孢子发生(雄性减数分裂)过程中却常常频繁发生。因此，有性的F2代丧失无融合生殖，与作物标准杂交品种F2代丧失杂种优势类似。这两者都是复合多基因杂种表型。
原则5认为，在结构杂合性存在时，接近专性的或兼性的无融合生殖体有性生殖产生的子代通常要么仿照纯合显性状态进行无融合生殖；要么仿照杂合显性状态既进行有性生殖又进行无融合生殖(接近1∶1的分离比率)。在自然繁殖稳定的无融合生殖体内，结构(核型的)杂合性抑制向有性的高频率分离。结构杂合性包括(但不仅限于)异源多倍性、节段异源多倍性、有性不育或原始多倍性(paleopolyploidy)。结构的杂合性仿照简单遗传负责无融合生殖。
因无融合生殖的多基因杂合性的重组，种内无融合生殖的二倍体杂种的有性子代常很少进行无融合生殖或完全进行有性生殖。通过诱导三倍性或其它奇数多倍体水平可稳定该种内无融合生殖的二倍体杂种。这导致了近专性无融合生殖。在奇数的倍数体水平时，遗传上减数的和重组的功能卵很少产生，且很少被遗传上减数的和重组的功能精子受精，因而其生产大大减少。因此，在奇数多倍体无融合生殖体中，负责无融合生殖的基因组内多基因杂交性很少受到干扰。
异源多倍性(包括不同种的多倍性)通常是限制重组的最方便机制。在异源多倍体中，重组通常只在基因组中而不在基因组间进行。因此，在基因组内是同源而在基因组间是异源的状态下，负责无融合生殖的基因，通过兼性有性生殖而保存下来。
其他细胞遗传机制也能防止在整个基因组或仅基因组的部分之内或之间重组。本申请涉及所有这些机制，包括倒位或易位杂合性和遗传受控的减数分裂驱动机制。
通过偶数(例如四倍体，六倍体等等)或奇数(如三倍体，五倍体等)水平的多倍化可以增加表现出低生育力的种间无融合生殖体的生育力水平。用这种方式产生的无融合生殖多倍体可产生一些有性起源的子代，也就是说，他们常是兼性无融合生殖体。同时，因为无融合生殖必需的多基因杂合性存在于基因组间而不是基因组内，这些有性子代也是兼性无融合生殖体。异源多倍体固定了基因组间的杂合性，使种内偶生的重组不影响趋异的基因组间的座位上等位基因的组成。本发明提出的方法使节段异源多倍化而得到推广。节段异源多倍化可加强花粉生育力，未减数胚囊和卵产生及活力，以及未减数卵的孤雌生殖。HFA理论的发展将HFA理论(所有的五个原则)和进化遗传学原则相结合，本发明人发展了一个关于天然“无配系群”(使有性植物和无融合生殖植物杂交产生的种群)的起源，稳定和分化的新理论。该理论在此给出，并是产生“无性作物”的基础。
根据该理论，在无融合生殖前阶段(
图1)，自然选择沿着纬度和其它生态学的梯度变化而进行，并进化出具有不同的胚珠发育时空分布形式的有性生态型。接着是第二次接触杂交。在这一过程中，更新世在被子植物的进化史上是非常重要的，因为有广泛的植物在这一时期进行迁移，B.Huntley & T.Webb III，植物史(Vegetation History)(KluwerAcademic Publishers 1988)，并发生第二次接触杂交，尤其在中纬度异型冰期生物种遗区区系(refugial floras)中。J.G.Carman，61 Biol.J.Linnean Soc.51-94(1997)。
新的杂种试着表达两个或更多特异趋异的花发育时空形式，它们繁殖成兼性的阶段1的无融合生殖体(
图1)。这些刚出现的无融合生殖体，大多数是二倍体。它们大多数中的无融合生殖都是兼性的和短暂的，也就是说，因为无融合生殖所需的平衡的多座位杂合性被重组干扰，它们通过有性繁殖产生的子代进行专性有性繁殖。因此这些短暂品系在所有的无融合生殖体都被有性子代取代之前，随后的世代含有越来越少的无融合生殖体。在那些形成时已具有或很快获得了稳定机制(如异源多倍体)的无融合生殖体中，这种取代不会发生。大多数稳定无融合生殖的机制都涉及到多倍性，它们全都大大的抑制，有时消除了各种负责无融合生殖的杂合性基因的重组和相关异常繁殖。
稳定的阶段II的无融合生殖体可周期性地与有关系的无融合生殖体及不同生态型的有性亲缘植物进行BII和BIII杂交，产生异型的阶段III的无配系群(
图1)。现在许多阶段III的无融合生殖体通过与有性的和无融合生殖的亲缘植物兼性远交，吸收遗传能力以迁入新的不同生境栖息地。R.J.Bayer，举蝶须属例子说明多倍体无融合生殖联合体(Evolutionof Polyploid Agamic Complexes with Examples from Antennaria(Asteraceae))，132 Opera Bot.53-65(1996)。
稳定负责无融合生殖的基因遗传系统的机制，完善了关于无融合生殖的起源，稳定和遗传的HFA模型。关于无融合生殖，组分机制(下文给出定义)在以前的文献中未给予描述。
根据HFA理论，无融合生殖体的亲本有性表型是多基因间相互适应的结果。A.R.Templeton，相互适应和远交抑制(Coadaptation andOutbreeding Depression)，于M.E.Soule，保护生物学缺乏和多样性科学(Conservation BiologyThe Science of Scarcity andDiversity)105-116(Sinauer Assocs.Inc.，Sunderland，MA 1986)；B.Wallace，再谈相互适应(Coadaptation Revisited)，82 J.Hered.89-95(1991)。无融合生殖体的亲本有性表型，是由独特的等位基因分组编码的，这些等位基因分组能协同作用，以赋予适应特定环境的特定生态型以适合度。任何亲本基因组间(即，兼性的阶段I的无融合生殖体内关键的多座位杂合性间)的显著重组都会导致子代表现出有性特征，或至少大大减少了出现无融合生殖的频率，也即是说，通过有性生殖产生的子代是有性的，或很大程度上是有性的(高度的兼性)。因此，没有经过稳定化，阶段I的无融合生殖体最后都将被仅产生有性子代的有性分离植物所取代。
从阶段I顺利进化到阶段II的绝大多数二倍体无融合生殖体(
图1)，通过异源多倍性或节段异源多倍性获得稳定。稳定出现的比率取决于与亲本遗传系的亲缘程度和第二次接触杂交区的特定条件。在这些区中，一亲本系通常比其他的亲本系数量更多。在这些情况下，优势亲本的花粉更容易进入BIII杂交(未分裂卵的受精)而形成为基因组比为2∶1的三倍体。或者，BIII杂种可从阶段I无融合生殖体的未分裂花粉中形成，实现优势亲本的受精，产生同样基因组比率2∶1。假设三倍体也产生未分裂卵(呈无融合生殖趋势)或花粉，与同样优势二倍体有性亲本的第二轮回交将产生3∶1的基因组比率。这些比率可能在无融合生殖体中非常普遍，它们可解释简单遗传分离比和赋予半合子无融合生殖的连锁群。或者，三倍体可和其他亲本进行BIII杂交中，在这种情况下可发生2∶2的基因组比率。其他多倍体化形式，包括未减数花粉和卵或体细胞加倍，可产生相似效果。
大多数无融合生殖体是远交的多年生植物，也即是说，近亲交配的无融合生殖体和一年生的无融合生殖体非常稀少(Asker & Jerling)。突变假说不能解释这些观测结果。相反，上述的杂交和远交方案依赖于远交和多年性(
图1)。在二倍体杂种、BC1三倍体和BC2四倍体水平，多年性可检验大量的基因重组(在花粉中)。每一个都可提供表现不同程度存活力和兼性的遗传背景和表现高存活力的遗传背景。
远交和多年生是具有高自然杂交率的科的显著特征，Asteraceae，Poaceae，和Rosaceae常排在最前面。N.C.Ellstrand等，自然植株杂种的分布(Distribution of Spontaneous Plant Hybrids)，93美国国家科学院院刊(Proc.Natl Acad.Sci.USA)5090-5093(1996)。这三个科含所有无融合生殖属的75％。J.G.Carman，61 Biol. J.Linnean Soc.51-94(1997)。相反，在杂交率低的植物科中，很少观察到无融合生殖，如芸苔科(Brassicaceae)，Solonaceae，和Apiaceae。同时，尽管突变假说不能解释这些现象，但是总体而言，它们和上面所描述的杂交和回交起源是一致(
图1)。
因为许多无融合生殖体是异源多倍体(Asker & Jerling)，异源多倍性可能是无融合生殖稳定的最常见形式。真正的异源多倍体中重组仅发生在基因组内。因此，对出现高频率(接近专性)无融合生殖体起作用的关键座位，常与基因组间分离和独立分配相隔绝。也就是说，它们在基因组内保持纯合，而在基因组间是杂合的。从兼性无融合生殖的TTT’T’基因组异源多倍体有性生殖产生的子代，保持无融合生殖，但因对无融合生殖不重要的杂合座位的基因组内重组而呈表型变异。这里T和T’是不同的，编码不同的胚珠发育模式。
当TTT T’无融合生殖体进行有性生殖的时候，负责无融合生殖(从大多数有性到几乎专性)的多基因能力(polygenic capacity)常以简单的孟德尔遗传规律进行分离。这是因为它常和非重组的T’单价体(或大的连锁群)共分离。这个单价体含有大多数更关键的不同的等位基因。需要这些等位基因用来表达从低频率到高频率的无融合生殖。许多近专性无融合生殖体必需的基因很可能排列在几条染色体上。因此，在TTTT有性系和TTT T’无融合生殖系进行杂交时，在通常被认为是无融合生殖的分离体中，兼性程度将从＜10％变化到＞90％。Y.Savidan，大黍改良的无融合生殖的遗传学和应用(Genetics and Utilization of Apomixis forthe Improvement of Guineagrass)(Panicum maximum Jacq)，Proc XIVInt.Grassl.Congr.，Lexington，KY，1981，182-184(1983)；S.Lutts等，Male and Femal Sporogenesis and Gametogenesis in ApomicticBrachiaria brizantha，Brachiaria decumbes and F1 Hybrids withSexual Co1chicine Induced Tetraploid Brachiaria ruziziensis，78Euphytica 19-25(1994)。这些无融合生殖体常接近分离种群的50％，也就是分离比常接近是1∶1，这常被误认为是简单遗传的例证。如果一条含有大部分无融合生殖体关键座位的染色体以单价体分配，如在TTTT’基因组群(constellation)中预期的，其传递频率将因形成小卫星而常达不到50％。这就解释了为什么许多分离率显示无融合生殖传递率＜50％。那些支持简单遗传假说的人用随机染色单体分配来解释四倍体遗传中的这种偏差。Y.Savidan，无融合生殖遗传学和产生(ApomixisGeneticsand Breeding)，18植物育种综述(Plant Breed.Rev)13-86(2000)。
在表达无融合生殖的部分同源TTT T’组中，染色体分配的发生好象所有四个染色体都是同源的。在减数分裂期，所有三个同源T染色体都有相同的几率与各自的部分同源染色体T’结合。因此，如果所有四个染色体共有的座位含有相互不同的等位基因，那么四个不同等位基因的所有六对组合都会随机发生，也就是说，染色体组模拟了同源多倍体。
在许多无融合生殖体中，大多数多倍体染色体组遗传行为上表现为同源多倍体组，但至少有一个表现为异源多倍体组。这种染色体行为是节段异源多倍性典型的。G.L.Stebbins，植物变种和进化(Variationand Evolution in Plants)，Columbia University Press，New York 1950；J.Sybenga，染色体配对亲和性和多倍体四价形成存在节段异源多倍体吗(ChromosomePairing Affinity and Quadrivalent Formation inPolyploidsDo Segmental Allopolyploids Exist？)，39基因组(Genome)1176-1184(1996)。该异源多倍体组在基因组间保持了无融合生殖所需的平衡多座位杂合性。
根据HFA理论，节段异源多倍体无融合生殖体是从早期的种间同源多倍体或弱异源多倍体TTT T’或TTT’T’无融合生殖体进化来的。对无融合生殖重要的部分同源染色体组内的重组常常是非适应性的，因为它常导致不育有性分离子。因此，等位基因的重组，染色体畸变或甚至突变，抑制赋予无融合生殖的部分同源组内的重组，导致了该组染色体进一步的异源多倍化(G.L.Stebbins，植物变种和进化(Variation andEvolution in Plants)，Columbia University Press，New York 1950)，这可能是高度适应的，导致这种修饰的积累。同样的，在未强烈参与赋予无融合生殖的部分同源组内重组可能也是高度适应的。这种重组刚开始很少发生，但每增加一次重组，部分同源组内染色体间的相似性增加，也就是说，这些细胞遗传事件通过把不同部分同源染色体的片段并入一个染色体使染色体组同源多倍化。J.Sybenga，39基因组(Genome)1176-1184(1996)。因为这种重组不会产生有性分离子(sexualsegregants)，通过排除原杂种中不良适应的等位基因组合及形成新的适应的等位基因组合，无融合生殖体的生存能力逐渐增加。这个机制可以解释为什么在摩擦草属[D.Grimanelli等，Mapping DiplosporousApomixis in Tetraploid TripsacumOne Gene or Several Genes？，80遗传(Heredity)33-39(1998)，D.Grimanelli等，Non-MendelianTransmission of Apomixis in Maize-Tripsacum Hybrids Caused by aTransmission Ratio Distortion，80遗传(Heredity)40-47(1998)]，Pennisetum[P.Ozias-Akins等，95美国国家科学院院刊(Proc.NatlAcad.Sci.USA)5127-5132(1998)]，Cenchrus[D.Roche，AnApospory-specific Genomic Region is Conserved Between Buffelgrass(Cenchrus ciliaris L.)and Pennisetum squamulatum Fresen，19植物杂志(Plant J.)203-208(1999)]，和Brachiaria[S.C.Pessino等，130 Hereditas1-11(1999)]中的无融合生殖体在基因组上行为象同源多倍体，却不能在赋予无融合生殖的部分同源染色体组或连锁群中经历重组。
J.Sybenga，39基因组(Genome)1176-1184(1996)，曾很有说服力地证明在发源为弱异源多倍体或品种间同源多倍体的多倍体进化早期同源多倍体化消除了节段异源多倍体性。节段异源多倍体无融合生殖体似乎是个特例。所以，有节段异源多倍性的兼性无融合生殖是相互依赖的，并是高度适应性的性状，也就是说，它们在高度成功的成熟无配系群的进化和稳定中功能上相互协作(
图1)。
自然界中存在一些表面上稳定的二倍体无融合生殖体，其中一些可通过近专性有性生殖不孕而得到稳定，从而防止了分离。这些可以通过有性二倍体的种间杂交形成，或通过减数卵孤雌生殖从异源多倍体无融合生殖体形成。例子包括下列植物中的二倍体无融合生殖体委陵菜属(Potentilla)，Muntzing & Muntzing，The Mode of Reproduction ofHybrids Between Sexual and Apomictic Potentilla argentea，1945 Bot.Not.49-71(1945)；香茅属(Hierochloe)，G.Weimarck，Apomixis andSexuality in Hierochloe australis and in Swedish H.odorata onDifferent Polyploid Levels，120 Bot.Not.209-235(1967)；Sorbus，A.Jankun & M.Kovanda，Apomixis at the Diploid Level in Sorbuseximia(Embryological Studies in Sorbus 3)，60 Preslia，Praha193-213(1988)；和拟南芥属(Arabis)，B.A.Roy，The Breeding Systemsof Six Species of Arabis(Brassicaceae)，82 Amer.J.Bot.869-877(1995)。在各种情况下双单倍体基因组都是不同的，很少形成有性配子。
相反，在进行有性可育的二倍体(或弱的双单倍体)无融合生殖体中，在一个到几个有性世代内，发生完全回复为有性生殖。这些不稳定的无融合生殖体或通过有性二倍体的品种间杂交形成，或者通过减数卵的孤雌生殖形成于节段异源多倍体无融合生殖体。注意在下面的例子中，稳定的状态II或状态III的多倍体无融合生殖体可成为不稳定的阶段I的新二倍体(neodiploid)无融合生殖体的亲本(
图1)。在银胶菊属(Parthenium)[D.U.Gerstel & W.M.Mishanec，On the Inheritanceof Apomixis in Parthenium argentatum，115 Bot.Gaz.96-106(1950)，Ranunculus，G.A.Noger，94 Bot.Hel.411-422(1984)]，和可能的菅草属(Themeda)[L.T.Evans & R.B.Knox，Environmental Control ofReproduction in Themeda australs，17 Aust.J.Bot.375-89(1969)]，臂形草属(Brachiaria)[T.N.Naumova等，Apomixis and Sexuality inDiploid and Tetraploid Accessions of Brachiaria decumbens，12 Sex.Plant Reprod.43-52(1999)]，和Sorghum[C.Y.Tang等，Apomixisin Sorghum Lines and Their FlProgenies，141 Bot.Gaz.294-299(1980)；U.R.Murty，Appraisal on the Present Status of Researchon Apomixis in Sorghum，64 Cur.Sci.315-316(1993)]中，发现不稳定的无融合生殖二倍体，后者可通过有性二倍体的杂交而产生。
如果无融合生殖体受单个显性基因控制，则兼性二倍体无融合生殖体经有性生殖产生的所有子代大概有75％(如果是杂合的)或者100％(如果是纯合的)是无融合生殖体，但该分离比率还没有观察到。相反兼性二倍体无融合生殖体通过有性生殖产生的子代是完全有性的或仅仅是弱无融合生殖的。这些观察结果与简单遗传不一致，但与HFA理论完全一致，也就是说，对无融合生殖关键的平衡多座位杂和性的重组常产生有性子代。总之，在二倍体水平上，当少数部分同源基因组进行兼性重组时，无融合生殖性丧失。在多倍体水平上，部分同源性就足以限制兼性重组在相似基因组中进行。这种部分同源性机制保持了杂交基因组的杂合性。在有性生殖体和无融合生殖体杂交中，无融合生殖体为作父本时，它使无融合生殖看起来似乎是简单遗传。
综上所述，那些支持简单遗传假说的人解释在兼性无融合生殖二倍体进行有性生殖产生的子代中100％回复为有性生殖。因为他们认为在单倍体配子中，显性无融合生殖等位基因好似是隐性致死因子。因此，根据该解释，无融合生殖不能从二倍体无融合生殖体的单倍体配子遗传。
除稳定某些二倍体无融合生殖体外，有性不育给多倍体和非整倍体无融合生殖体提供增加的稳定。以下有几个例子(i)蒲公英(Taraxacum)[Asker & Jerling]，Erigeron[D.A.Stratton，Life History VariationWithin Populations of an Asexual Plant，Erigeron annuus(Asteraceae)，78 Amer.J.Bot.723-728(1991)]，泽兰属(Eupatorium)[M.S.Bertasso-Borges & J.R.Coleman，Embryology andCytogenetics of Eupatorium pauciflorum and E.intermedium(Compositae)，21 Genet.Mol.Biol.507-514(1998)]，摩擦草属(Tripsacum)[C.A.Blakey等，Co-segregation of DNA Markers withTripsacum Fertility，42 Maydica 363-369(1997)]，雀稗属(Paspalum)[B.L.Burson & M.A.Hussey，Cytology of Paspalummalacophyllum and its Relationship to P.juergensii and P.Dilatatum，159国际植物科学杂志(Int.J.Plant Sci.)153-159(1998)]，和肉苁蓉属(Cistanche)[B.Pazy，Diploidization Failureand Apomixis in Orobanchaceae，128 Bot.J.Linn.Soc.99-103(1998)]的三倍体无融合生殖体，(ii)野麦属(Elymus)[J.B.Hair，SubsexualReproduction in Agropyron，10遗传(Heredity)129-160(1956)]，补血草属(Limonium)[J.A.Rossello等，a New Endemic Species fromthe Balearic Islands，56 Anales Del Jardin Botanico De Madrid 23-31(1998)]，摩擦草属和蝶须属[J.G.Carman，未出版]的非整倍体无融合生殖体，和(iii)Nothoscordum中不等四倍体(三个同源x＝5基因组加一个部分同源基因组x＝4基因组)无融合生殖体(珠心生胚)[K.Jones，Robertsonian Fusion and Centric Fission in Karyotype Evolution ofHigher Plants，64 Bot.Rev.273-289(1998)]。
根据HFA理论，双孢子状态，四分孢子状态和多胚性也是多基因决定的，异常的和中间发展的(杂种)表型。J.G.Carman，61 Biol.J.Linnean Soc.51-94(1997)。它们象无融合生殖一样，因在大孢子发生，胚囊发育，和/或胚胎形成过程中所涉及基因的基因组间杂合性而发生。然而，与无融合生殖不同的是，许多双孢子，四分孢子和多胚的物种是二倍体，且几乎所有的双孢子和四分孢子物种都是完全有性的。J.G.Carman，61 Biol.J.Linnean Soc.51-94(1997)。因此，在双孢子，四分孢子或兼性多胚性二倍体中，对这些异常起关键作用的多座位杂合性不会因正常的多倍性或有性不育而稳定。这就提出了关于这些杂合性如何产生及如何稳定的问题。
双孢子和四分孢子物种、及许多多胚胎种是古多倍体，它们好象是从发育上不同步的有性的或无融合生殖的多倍体形成来的。J.G.Carman，61 Biol.J.Linnean Soc.51-94(1997)。可能的形成机制包括或上升或下降非整倍性和亲本基因组的结构重组。D.E.Soltis & P.S.Soltis，PolyploidyRecurrent Formation and Genome Evolution，14Trends Eco.Evol.348-352(1999)，两者都可通过二倍体化而获得稳定。没有二倍体化，就会分离成正常的单孢子蓼属(Polygonum)型胚囊形成。二倍体化能把偶尔发生重组的多倍体组部分同源染色体转变成重组上不同的(二倍体化)染色体，其中新辨别的和可能再组织的二倍体对间绝不会发生重组。因此通过二倍体化，对双孢子、四分孢子和多胚性起关键作用的祖先多座位基因组间杂合性将永久稳定。在某些二倍体筷子芥(Arabis)无融合生殖体及可能少数其他无融合生殖体(二倍体或多倍体)中，无融合生殖也可能通过二倍体化而永久稳定。
二倍体化前广泛的非整倍性或总体不平衡的染色体重排的出现，使一些双孢子和四分孢子物种的单孢性(标准)不可能，也使一些无融合生殖体进行有性胚囊发育不可能。然而，植物中完全专性的双孢子担子形成、四分孢子状态和无融合生殖的情况即使可能有，也是罕见的。H.Hjelmqvist，胚囊发育中的变化(Variations in Embryo SacDevelopment)，14 Phytomorphology 186-196(1964)；Asker & Jerling；B.M.Johri等，Comparative Embryology of Angiosperms，Vol.1和2(New YorkSpringer-Verlag 1992)。相反，昆虫、两栖动物和爬行动物的许多不常见的有性和无性生殖系统却是专性的。对植物来说，大多数异常生殖途径很明显地与杂交、多倍性、二倍体化、或其他不寻常的细胞遗传机制相关。E.Suomalainen等，Cytology and Evolution inParthenogenesis(CRC Press，Baca Raton，FL 1987)。因此，这些机制也可作为多基因杂种表型出现，这些表现通过正常的或节段异源多倍性、有性不育、二倍体化或其他阻止对其维持重要的多座位杂合性重组的细胞遗传机制实现稳定。
稳定机制类型不同程度地影响着杂种优势和基因流。例如，TTT’T’形式的异源多倍性瞬时即可稳定无融合生殖，但是，除了突变和罕见的远交，很少存在通过修饰原始相互适应的胚珠发育过程来改进这些无融合生殖体生育力的机制。相反，在节段异源多倍体无融合生殖体中却存在潜在有效的基因组修饰机制。在这些无融合生殖体中，不直接参与表达无融合生殖的部分同源染色体组内常发生重组混合，这可能包括大部分染色体组。这些染色体组内的重组可促进有性花粉的形成，无性卵的发育，未减数卵的孤雌生殖和杂种优势。在该意义上来说，通过自然选择和赋予非无融合生殖的染色体组的同源多倍化，源于品种间同源多倍化或弱种间杂种的无融合生殖体可快速获得赋予高的种子形成率和高的花粉生育力的重组。不利于雌性性化的基因组间重组巩固了排除有性回复子的选择。如双孢子、四分孢子中看到的那样，一些基因组间重组可导致某些胚珠发育过程的加倍和消除。在这方面，无融合生殖可作为繁殖上新的有性种和属(包括属于双孢子、四分孢子、或多胚的一些)进化的跳板。J.G.Carman，61 Biol.J.Linnean Soc.51-94(1997)。相反，严格起源于基因组异源多倍体(TTT’T’或TTT T’)的无融合生殖体，可不确定地保留许多不能很好适应无融合生殖的基因组间杂合性。本发明的方法本发明涉及产生遗传上稳定的无融合生殖植物和在遗传上稳定表现出遗传不稳定的自然或人工产生的无融合生殖植物的方法。也涉及为了植物改良、种子生产和作物生产的目的而控制无融合生殖(兼性(facultativeness))的表达的方法。
可以方便地将本发明的方法分成4类(a)评价基因组同源性、兼性和无融合生殖稳定性；(b)植物育种、双倍体化(amphiploidization)和诱变方法；(c)基因作图和克隆方法；(d)遗传工程方法。评价基因组的同源性、兼性和无融合生殖的稳定性本发明的一个特征是通过产生核型(结构型)杂合性来稳定天然或人工无融合生殖体的无融合生殖。当从有性植物人工产生无融合生殖体时，这可通过选择符合胚珠发育的繁殖进程中趋异要求的种间或品种间(interracial)亲本系来实现，如WO 98/3374中教导的。评价两个有性系(当作杂种对)的核型部分同源性程度的优选方法是常规基因组分析，在分析中产生杂种和测定分裂中期I在花粉母细胞(PMC)中染色体配对的程度。D.R.Dewey，Genomic and Phylogenetic Relationshipsamong North American Perennial Triticeae，见J.E.Estes等，Grasses and GrasslandsSystematics and Ecology(University ofOklahoma Press 1982)。在二倍体杂种水平上，花粉母细胞中同源染色体配对常大大超过二倍体杂种双倍体化过程中观测到的数量。R.R-C.Wang，An assessment of genome analysis based on chromosome pairingin hybrids of perennial Triticeae，32 Genome 179-189(1989)。因此，即使PMCs中仅有有限程度减数染色体配对的二倍体杂种，也可能适于通过产生双倍体建立核型杂合性。
兼性是无融合生殖植物通过有性生殖产生的存活种子百分比的度量。确定该百分比的优选方法是进行子代检验，在该过程中进行子代与母本的比较。现代分子指纹分析技术也是优选的，因为一旦优化系统后它们可靠而且容易使用。O.Leblanc & A.Mazzucato，鉴定和定量分析无融合生殖的筛选方法(Screening Procedures to Identity andQuantify Apomixis)，Y.Savidan & J.Carman，无融合生殖研究进展(Advances in Apomixis Research)(FAO，CIMMYT，ORSTOM，印刷中)。
稳定程度也可通过对第一代子代测试中确定的非正常型进行子代测试来评价。其成员和母本一样进行无融合生殖的子代系谱源于遗传稳定的(核型杂合的)无融合生殖母本；而其成员具有高百分比的有性回复子的子代系谱源于遗传不稳定的无融合生殖体。典型地，人工或天然二倍体无融合生殖体或天然双单倍体无融合生殖体是不稳定的。而人工或天然多倍体无融合生殖体则有可能稳定，也有可能不稳定。植物育种、双倍体化和诱变如标准植物育种教科书[例如Poehlman，Breeding Field Crops(VanNostrand Reinhold 1987)]所述，常规植物育种程序在本发明中用于几个目的。优选的方法是增加已知生产无融合生殖二倍体或多倍体的有性亲本系的基因多样性和配合力。植物育种或遗传工程用于遗传修饰一个植物种或紧密联系的一群植物种中繁殖表型不同的两组已描述亲本系，使得两组已描述亲本系之一中的任何植物与从另一描述亲本系中的任一植物杂交，能产生无融合生殖植物、或通过双倍体化或进一步杂交能变成无融合生殖体的植物。在每一组描述系内，通过常规杂交和育种程序，或通过单交、双杂交或复杂交(multi cross)(远交)程序，可改良亲本系的配合力。
本发明的一个特征是介绍一种新的杂交育种系统，由此可获得人工来源的杂种无融合生殖体。该系统不仅涉及到识别表达良好配合力的有性近交亲本系，而且涉及到在两组描述品系中识别杂种或经多次远交的亲本系，以致当两组描述品系之一中的植物与另一组描述品系中的植物杂交时，可表现良好的配合力。因此，这一新操作体系可产生单交或复杂交杂种，这些杂种或进行无融合生殖，或通过双倍体化或进一步杂交而变成无融合生殖体。使用该方法可产生大量的无融合生殖杂种基因型(从每一次杂交)，而且，每一杂种基因型可通过无融合生殖种子形成而获得增加，用于田间试验和/或栽培品种发放。因此，迅速产生无数的新无融合生殖基因型。这一技术将大大丰富农业植物的多样性，极大的增强了育种者提供适应高产、中产或低产农业区的无融合生殖杂种品种的能力。
本发明的另一特征是拓展了配合力的标准定义，将其常规定义延伸至包含趋异而高度杂合的有性亲本系的繁衍。这些亲本系杂交(或杂交和双倍体化)时可形成具有高杂种优势的无融合生殖植物。通过杂合的(远交)亲本系(有性的或无性的)杂交可获得遗传杂合的无融合生殖子代。分别评价这些子代的农业应用价值，选育发展栽培种。同样的，优选的方法是把兼性无融合生殖植物和遗传趋异的有性或无性系进行杂交，以获得具有强化的农学性状的衍生系。
至于双倍体化，用常规秋水仙碱技术即可实现杂种染色体数的加倍，如J.Torabinejad等，Morphology and Genome Analyses ofInterspecific Hybrids of Elymus scabrus，29基因组(Genome)150-55(1987)。或者，也可使用最近发展的组织培养技术。O.Leblanc等，Chromosome Doubling in Tripsacumthe Production ofArtificial，Sexual Tetraploid Plants，114 Plant Breed.226-30(1995)；Cohen & Yao，In Vitro Chromosome Doubling of NineZantedeschia Cultivars，47 Plant Cell Tiss.Org.Cult.43-49(1996)；Chalak & Legave，Oryzalin Combined with Adventitious Regenerationfor an Efficient Chromosome Doubling of Trihaploid Kiwifruit，16Plant Cell Rep.97-100(1996)。
种间F1S回交常可低频(0.5％至3％)地产生部分双倍体2n+n(BIII)杂种，例如Z.W.Liu等，89 Theor.Appl.Genet.599-605(1994)。如O.Leblanc等所述的那样，如果在杂种中存在无融合生殖趋势(形成未减数卵)，那么该频率将大大增加。O.Leblanc等，ReproductiveBehavior in Maize-Tripsacum Polyhaploid PlantsImplications forthe Transfer of Apomixis into Maize，87 J.Hered.108-111(1996)。因此，为了实现种内和种间杂种的染色体加倍，优选方法是采用使用一个或多个前面列出的秋水仙碱(或其他已知的纺锤体抑制剂)处理方法。同样的，加倍种间杂种染色体的优选方法是与一有性亲本回交，并通过计数根尖细胞中的染色体数来确定部分双倍性(通常为三倍体)。接着与另一亲本回交可获得一个完全双倍体，或与同一亲本回交获得一个部分双倍体(三个基因组来源于一个亲本，一个基因组来源于另一亲本)。双倍体化可在杂交之前进行，也可在杂交后进行。
如公开文献中报道的那样，例如Poehlman，Breeding Field Crops(Van Nostrand Reinhold 1987)，常规变异育种程序用于诱导染色体倒位或易位，使它们离开含无融合生殖所需基因的染色体重组区。优选的方法包括从组织培养物再生染色体重排的植物，S.Jain等，SomaclonalVariation and Induced Mutations in Crop Improvement，Current PlantScience and Biotechnology in Agriculture 32，(Kluwer AcademicPublishers 1998)；经离子辐射后获得染色体重排的植物，P.K.Gupta，Mutation Breeding in Cereals and Legumes，S.M.Jain等，当代农业植物科学和生物技术(Current Plant Science and Biotechnology inAgriculture)32(Kluwer Academic Publishers 1998)。
如果植物不是雌雄异体或自交不亲合的，那么用雄性不育系或去雄程序是必要的。在光周期反应和雌性发育进程上有适当差异的有性品种或品系之间产生杂种。用植物育种教科书中的标准方法来产生种内杂种，如Poehlman，Breeding Field Crops(1987)。如在近来涉及远缘杂交的文献中指出的那样，种间或属间杂种的成功繁殖可能需要用激素对小花进行处理和采用胚胎拯救程序，例如Z.W.Liu等，Hybrids andBackcross Progenies between Wheat(Triticum aestivum L.)andApomictic Australian Wheatgrass)[Elymus rectisetus(Nees in Lehm.)A.Love & Connor]Karyotypic and Genomic Analyses，89 Theor.Appl.Genet.599-605(1994)。通过其中间表型来确认杂种。基因作图与克隆本发明的一个特征涉及通过用反义技术修饰对兼性表达重要的数量性状座位(QTLs)的表达，从而控制兼性。优选的方法开始于通过杂交所述表型产生杂种，在杂种中，对负责无融合生殖的不同有性生殖亲本繁殖表型进行QTL作图。该方法包括建立一个F2作图群体，该群体是由人工兼性F1无融合生殖体的有性来源的F2子代组成的，而F1无融合生殖体是由原始的繁殖趋异的亲本系杂交形成的；并鉴定与每个表型有关的分子标志物，如A.W.Heusden等，Three QTLs from Lycopersiconperuvianum Confer a High Level of Resistance to Clavibactermichiganensis ssp.Michiganensis，99 Theor.Appl.Genet.1068-1074(1999)。用一个大的分离群体将QTLs精细定位到一个给定的染色体上，通过侧翼标志物分离含有该染色体区的酵母人工染色体。然后还分离含有QTL的粘粒克隆，并且通过将其转入突变体，还能识别出互补粘粒。采用该互补粘粒，通过cDNA分离，鉴定QTA转录本，例如，H.Q.Ling等，Map-based Cloning of Chloronerva，a Gene Involved in IronUptake of Higher Plants Encoding Nicotianamine Synthase，96美国国家科学院院刊(Proc.Nat’l Acad.Sci.USA)7098-7103(1999)；E.S.Lagudah等，Map-based Cloning of a Gene Sequence Encodinga Nucleotide-binding Domain and a Leucine-rich Region at the Cre3Nematode Resistance Locus of Wheat，40基因组(Genome)659-665(1997)。另一方面，易于操作的细菌人工染色体(BACs)，可用于基于图谱的克隆。许多作物种已建立了BAC库，如S.S.Woo等，Constructionand Characterization of a Bacterial Artificial Chromosome Libraryof Sorghum bicolor，22核酸研究(Nucleic Acids.Res.)4922-4931(1994)。基因工程该发明的一个特征是通过控制对兼性表达重要的QTL的表达来控制兼性程度。本发明另一个特征是通过控制减数分裂特异性基因的表达来永久(或可逆)地使兼性无融合生殖体变成为专性无融合生殖体。
实现专性无融合生殖的一种优选方法是培育或转化兼性无融合生殖植物，而使该植物包含一种遗传物质，这种物质能使雌性减数分裂流产，结果生成基本上100％的无融合生殖种子。该遗传物质可以是通过育种导入的减数分裂突变体，或在表达时干扰雌性减数分裂的转基因启动子/基因构建体。因此，诱导型下调转基因启动子/基因构建体(其表达时，诱使减数分裂失败)使得出现兼性无融合生殖。或者，可出现兼性无融合生殖，除了在基因启动子/基因构建体的诱导上调期间，引起减数分裂失败而形成几乎100％无融合生殖种子。
启动子/基因构建体可以含有在紧靠雌性减数分裂前或期间表达的启动子组中的启动子和基因构建体，该基因构建体被表达时就会致命地破坏减数分裂，如V.I.Klimyuk & J.D.G.Jones，AtDMCl，theArabidopsis homologue of the yeast DMC1 genecharacterization，transposon-induced allelic variation and meiosis-associatedexpression，11 Plant J.1-14(1997)；PCT/GB97/03546。对雌性性母细胞的发育常产生细胞毒性的该转基因物质可被基因编码的抑制分子控制，而该基因又受可化学诱导的启动子(该启动子可以是雌性性母细胞特异性启动子)控制，以致在此无融合生殖体中雌性生育力可被诱导。该转基因物质可含有选自有义和反义基因的基因，这些基因一旦在减数分裂期间表达，将致命地破坏减数分裂或者对雌性性母细胞产生毒性。进一步而言，在转基因起源的专性无融合生殖体中，恢复低水平雌性性别的方法可涉及到通过可诱导启动子的诱导表达抑制剂。将转基因物质导入宿主植物中可以运用那些本领域专家所熟知的任一有用的技术。
实施例1筛选适于产生稳定的无融合生殖植株的品系本发明的一个特征是提供在给定作物的初级、次级或三级种质库中选择有性系的方法，以便从有性植物或不稳定的兼性无融合生殖植物中产生稳定的兼性无融合生殖植物(其不易形成有性分离子)。在这个实施例中举出的优选方法用于双子叶植物亚纲(Dicotyledonae)植物，即蝶须属的有性生殖物种，和单子叶植物亚纲(Monocotyledonae)植物，即摩擦草属(Tripsacum)和高粱属(Sorghun)的有性生殖物种。预计本领域技术人员能够成功地将这些方法应用到其他的作物中，如水稻、甜菜、苹果、樱桃、马铃薯、大豆和莴苣。
目前优选的筛选合适的有性亲本系的方法是1)从相关文献或田间研究鉴定一特定作物及其近源物种的天然生态型和未改良的当地品种，其在耐阴性、纬度、开花所需的光周期、海拔和湿度喜好上存在差异；2)通过将大孢子发生和胚囊发育的阶段与珠被和总体子房发育的阶段联系起来，在细胞胚胎水平上表征生态和生理上不同的品系；3)表征和统计分析各品系中的细胞胚胎差异；4)选择在生理学(如光周期)、细胞胚胎学、分类学上有差异的品系。一般而言，划分为不同种的植物，也就是说其杂种不育的植物对，应当具有足够的基因组部分同源性，使得一旦在它们之间产生的杂种是双倍体化的，可确保产生核型杂合性。
蝶须属，摩擦草属和高粱属的有性二倍体和多倍体满足为从有性植物中合成遗传稳定的兼性无融合生殖植物而在此处列出的地理、生理、生态、细胞胚胎学和分类学标准。在整个洛基山脉，从加拿大西北领土的北极圈地区到美国墨西哥边境，分布着大量的有性蝶须属，它们总体而言占据很大的范围，单个地常局限于某特定生境。Bayer，132 OperaBotanica 53-65(1996)。可以观察到在这些物种中相对于珠被形成的减数分裂时间存在很大差异(图2和3)。在美洲，从北纬42°到南纬24°分布着大量的有性摩擦草属。它们也集中的占据着大范围的牺息地但同时又各自严格的占有独特生境。Wet等，Systematics of Tripsacumdactyloides(Gramineae)，69 Amer.J.Bot.1251-57(1982)。和在蝶须属中观察到的那样，在这些种中，也能观察到相对于珠被发育的减数分裂时间存在很大的不同(数据未列出)。在大部分的非洲、澳大利亚、南亚大陆上分布着大量高粱属的有性生殖二倍体和多倍体生态形、当地品种和物种，在这些种中也可以观察到相对于珠被发育的减数分裂时间存在很大的不同(图4和5)。从这些数据能选出适于产生稳定的兼性无融合生殖植物的有性生殖系。必须强调的是收集、表征和选择程序都因各单子叶和双子叶植物而有不同。
实施例2产生遗传上稳定的兼性和专性无融合生殖体在实施例1中所用的技术被当作指导原则用于获得三个或更多个有性系，这些有性株系具有相对于珠被发育早的减数分裂/早的配子体发育。同样，该技术被当作指导原则用于获得一个亲源种的三个或更多个有性系，这些有性系有相对于珠被发育晚的减数分裂/晚的配子体发育。每个种类都可以筛选一些品系，使得相对于珠被发育，在一组品系中胚囊形成和其它组品系中分裂前期到早期减数分裂的时间大致相同。用上面描述的常规程序使成对的亲本植物(每一亲本来自两组之一)杂交，产生二倍体。应当理解，品系来源的遗传背景可能会影响无融合生殖的表达。因此，选择或生产含有不同遗传背景和减数分裂时或多或少有差别的另外的品系是必要的。
兼性的无融合生殖体是不稳定的，也就是说它们因兼性有性生殖而产生有性分离子。通过产生人工二倍体Antennaria corymbosa(2x有性的)×A.racemosa(2x有性的)杂种(图6)和人工二倍体高梁属(2x有性的)杂种(图7)，因杂交起源的花异步(floral asynchrony)而产生出这种兼性无融合生殖体。无孢子生殖胚囊以约5％的频率在高梁属杂种5-1×4-1和9-1×1-2中形成。二倍性孢子胚囊，和摩擦草属(图8)中的那些一样，大约以10％的频率出现在高梁属杂种5-2×9-2中。注意，相对于珠被发育的减数分裂时期不同在其子代形成二倍性孢子胚囊的亲本对中是实质性的(图5)。
用上面描述的技术加倍他们的染色体数可以从蝶须属和高梁属物种间F1杂种产生结构上杂合的(稳定的)兼性无融合生殖体。稳定高梁属的种内杂种(上面提到的)需要遗传修饰，这种修饰使得雌性减数分裂或其直接细胞的产生失败。这样不仅稳定了无融合生殖体，而且使它们成为专性的。这可通过以下方法来实现经过标准的杂交程序将减数分裂突变体掺入该系中；经过BIII杂交或双倍体化诱导三倍性，然后与二倍体杂交；或通过上面讨论的方法用对雌性性母细胞有细胞毒性的启动子/基因构建体来转化该二倍体。通过使用上面提到的诱导型启动子，就能产生具有诱导的兼性或专性表达的遗传稳定的无融合生殖体。
二倍体Tripsacum laxum(2x有性的)×T.pilosum(2x有性的)的人工双倍体是稳定的兼性无融合生殖体，具有50％的二倍性孢子胚囊形成率(图8)。将这个植物和T.zopilotense(2x有性的)或T.bravum(2x有性的)杂交可产生稳定的专性无融合生殖体，此无融合生殖体有大约80％的二倍性孢子胚囊形成和20％流产的性母细胞或有性胚囊形成(图9)。
实施例3负责兼性的基因的作图和克隆将无融合生殖植物的花粉授到有性植物上，并评价子代中胚珠的有性或无融合生殖发育，通过此种方法来对无融合生殖体进行遗传分析。在这些研究中共同的是，如果观察到任何无融合生殖发育的胚珠，那么就评价子代为无融合生殖的。例如Y.Savidan，Nature et heredite de1＝apomixie chez Panicum maximumJacq.，PhD thesis，Universite ParisXI，法国(1982)；S.Lutts等，用有性秋水仙素的无融合生殖Brachiaria brizantha，Brachiaria decumbes及F1中雄性和雌性孢子形成及配子发生诱导了四倍体Brachiaria ruziziensis，78 Euphytica19-25(1994)；C.B.Do Valle & J.W.Miles，无融合生殖物种育种(Breeding of apomictic species)，Y.Savidan等，无融合生殖研究进展(Advances in Apomixis Research)(2000)；P.Ozias-Akins等，95美国国家科学院院刊(Proc.Nat’l Acad.Sci.USA)5127-5132(1998)，将植物分入不同的无融合生殖类别，在这些无融合生殖类别中，无融合生殖形成的胚珠所占百分数分别为12，28，17，和7％。这些研究中所作的(无论其是否相同)是鉴定编码至少一定程度有功能无融合生殖所需的最少数量连锁群。在一些情况下，表现无融合生殖的胚珠百分数在子代中观察到间断，M.Dujardin & W.W.Hanna，Apomictic andsexual pearl millet×Pennisetum squamulatum hybrids，74遗传杂志(J.Hered.)277-279(1983)，但在其他情况下表达范围却有点连续(S.Lutts等，78 Euphytica 19-25，1994)。因此可以认为几个主要的、或者是许多次要有数量效果的基因(Y.Savidan，Nature etheredite de 1＝apomixie chez Panicum maximum Jacq.，PhD thesis，Universite Paris XI，法国(1982)；S.Lutts等，78 Euphytica 19-25(1994))影响兼性(无融合生殖表达程度)。
用反义技术，通过修饰QTL(s)的表达来上调或下调兼性是本发明的一个特征。利用上面描述的方法，对负责杂种中无融合生殖的趋异有性亲本繁殖表型进行QTL作图(图2-5)。然后按上面描述的方法对一些重要的QTL(s)精细作图到某一给定的染色体上并进行了鉴定。
实施例4人工产生遗传稳定的具有可诱导专性表达的高度兼性无融合生殖体或遗传上稳定的具有可诱导高度兼性表达的专性无融合生殖体实施例1-3中的技术，作为指导原则，可用来人工得到遗传上稳定的，具诱导性专性表达的高度兼性的无融合生殖体，或遗传上稳定的具诱导性高度兼性表达的专性无融合生殖体。
在本发明中，无融合生殖可比作一个计算机操作系统。这个″生物操作系统″的特征包括以下几个方面(1)在农田里，可以把杂种自己的种子世世代代地纯种克隆杂种；2)在植物育种者的苗圃里，部分的有性生殖用于植物改良，然后转到严格的无融合生殖；3)大量快速繁殖的和遗传多样的栽培种能够适应不同的农业生态位；4)总的遗传多样性的增加能够使作物免受大面积害虫危害；5)生产成本的大量降低，即农民花更少的钱买种子，种子公司花更少的钱开发优势作物品种。
应当理解，本发明也可以用其他具体形式来实现，而不脱离本发明的精神或基本特征，它们都包含在HFA理论的五个原则之中。描述的步骤和材料在任何方面都将被认为是举例说明性的而非限制性的，附带的权利要求书而不是以前的说明书确定本发明的范围。与权利要求书等价的意义和范围内的所有变化都包括在本发明的范围内。
权利要求
1.一种使表现出遗传不稳定性的无融合生殖植物遗传稳定化的方法，包括通过染色体加倍或BIII杂交从所述植物产生多倍体衍生系，使得负责无融合生殖的重复基因在相反的部分同源基因组上彼此分开，以致此多倍体衍生系中部分同源基因组之间的重组被抑制。
2.一种使表现出遗传不稳定性的无融合生殖植物遗传稳定化的方法，包括(a)通过染色体加倍或BIII杂交从所述植物产生多倍体衍生系，以致通过节段异源多倍性使负责无融合生殖的重复基因彼此分开；和(b)通过自交或与相似植物的杂交，获得由于偶然重组而表达更大的花粉生育力、未减数卵生育力、或者孤雌生殖的有性繁衍后代，来提高所述无融合生殖节段异源多倍体的生育力。
3.一种使表现出遗传不稳定性的无融合生殖植物遗传稳定化的方法，包括通过突变或者其他植物胁迫产生所述植物的衍生系，该衍生系包含一个或多个染色体畸变，该染色体畸变使负责无融合生殖的重复基因在该衍生系减数分裂期间与重组分开。
4.一种使表现出遗传不稳定性的无融合生殖植物遗传稳定化的方法，包括用重组DNA转化所述植物，所述重组DNA的特征在于可引起雌性减数分裂流产的启动子/基因构建体。
5.一种遗传上改良植物的方法，包括(a)产生无融合生殖植物，确定所述无融合生殖植物是否是遗传稳定的，如果所述无融合生殖植株是不稳定的，则将其遗传稳定化，产生遗传稳定的衍生系；(b)通过植物育种程序或者通过使用转基因构建体的基因遗传工程程序，遗传上增强所述无融合生殖植物或者遗传稳定的衍生系，它们都是兼性无融合生殖体，其中在所述育种程序中将遗传上不同的有性或无性生殖系与所述无融合生殖植物或遗传上稳定的衍生系杂交；(c)培育或转化所述植物、遗传稳定的衍生系或经遗传强化的衍生系，以包含这样的遗传物质，使得(i)雌性减数分裂流产，导致基本上100％的无融合生殖种子形成，除了以下可选择的情况，此时表达时能引起减数分裂流产的转基因启动子/基因构建体可诱导性下调，使兼性无融合生殖被表达；或(ii)发生兼性无融合生殖，除了表达时能引起减数分裂流产的转基因启动子/基因构建体可诱导性上调期间，此时导致基本上100％的无融合生殖种子形成。
6.一种在无融合生殖植物中控制无融合生殖兼性的方法，包括用相应于所选数量性状座位的反义核酸转化所述无融合生殖植物，使得发生高频率的有性种子形成。
7.一种在兼性无融合生殖植物中控制无融合生殖兼性的方法，包括用相应于所选数量性状座位的反义核酸转化所述兼性无融合生殖植株，使得发生专性到近专性的无融合生殖。
全文摘要
本发明涉及为了产生，改良和经济上利用高产无融合生殖作物而对被子植物的无融合生殖(无性种子生成)进行诱导、稳定和控制。“稳定”无融合生殖指将兼性无融合生殖转变为专性无融合生殖，或者赋予兼性无融合生殖这样的机制，即在兼性有性种子生成期间防止引起无融合生殖的基因的重组，使得从所述兼性无融合生殖体产生的子代遗传无融合生殖所需的等位基因组合。
文档编号A01H1/00GK1391435SQ00816100
公开日2003年1月15日 申请日期2000年10月30日 优先权日1999年10月29日
发明者J·G·卡门 申请人:犹他州大学