平邑甜茶无融合生殖MhSERK1基因植物表达载体构建方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了平邑甜茶无融合生殖MhSERK1基因植物表达载体构建方法与应用，本发明所构建的表达载体pBI121-MhSERK1是由MhSERK1基因插入到PGM-T，经XbaI和SmaI双酶切后连接到pBI121的XbaI和SmaI位点得到的重组质粒。该植物表达载体用于植物遗传转化，MhSERK1在CaMV35S启动子的启动下表达，对植物的生殖发育过程产生调控作用，使植物不经过生殖细胞的融合可以正常产生种子，达到无融合生殖的作用。
【专利说明】平邑甜茶无融合生殖MhSERKI基因植物表达载体构建方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及苹果属平邑甜茶无融合生殖基因MhSERKl表达载体和构建方法及应用。
【背景技术】
[0002]无融合生殖是发育生物学领域的重要科学问题。与有性生殖获得的种子相比，无融合生殖后代的遗传背景与母本一致，不发生性状分离，在植物育种中，无融合生殖可以固定杂种优势；对于一些无性繁殖的植物，无融合生殖产生无性种子可以克服无性繁殖的不便，避免长期营养繁殖造成的亲本退化；因此，有关植物生殖机理方面的研究一直是生命科学研究领域的热点之一。
[0003]平邑甜茶(Malushupehensis Rehd.var.pingyiensis Jiang)是蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)湖北海棠(Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.)的一个变种，也是典型的无融合生殖型三倍体植物。主产于山东平邑县蒙山白云岩和恶峪一带，小叶呈红色，似茶叶故称平邑甜茶。平邑甜茶是苹果的优良砧木之一，也是我国特有的植物资源，其耐涝性和耐盐性较强，在生产上具有重要的应用价值，同时平邑甜茶具有高度的无融合生殖能力，与西府海棠、山定子等其它苹果砧木相比，其实生苗整齐一致，个体差异小，遗传稳定，因此，平邑甜茶是无融合生殖型矮化砧木育种的重要母本材料。多年来，平邑甜茶的相关研究主要集中在遗传育种、胚胎发育、抗性等方面的研究，近年来随着分子生物学的发展，在基因的克隆、功能鉴定以及生理功能等方面开展无融合生殖分子机理和遗传机理方面的研究，并通过基因工程方法对其生殖机理和功能进一步加以验证。
[0004]近年来,对植物体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶(Somatic embryogenesisreceptor-like kinases, SERKs)类基因的研究表明:在植物的生长发育过程中，SERK基因及其家族成员在小孢子发育、体胚发生、激素感应、无融合生殖及抗病抗逆反应中都具有一定的功能。课题组在前期研究过程中在平邑甜茶子房中已分离获得MhSERKl基因片段，该序列经NCBI数据库Blast比对，预测为体胚发生类受体蛋白激酶基因(本发明将其命名为MhSERKl)片段，而MhSERKl基因的功能是什么，是否可以使普通植物也具有无融合生殖特性，于是本发明将通过MhSERKl基因植物表达载体构建与遗传转化，希望获得该基因的具体功能，以便能够通过基因工程手段获得更好的品种资源。
[0005]对于苹果属平邑甜茶无融合生殖相关MhSERKl基因，目前还未见其载体构建及其基因功能的报道，而本发明经实验验证，该基因在植物无融合生殖过程中可以使植物不经过两性生殖细胞的融合产生可育的种子，可以为深入研究无融合生殖的遗传机制和分子机
理奠定基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供该苹果属平邑甜茶无融合生殖相关MhSERKl基因的植物表达载体构建方法和应用。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，创制无融合生殖新种质，用于植物品种遗传改良。
[0007]技术方案如下:
[0008]平邑甜茶无融合生殖相关MhSERKl基因，该基因序列为SEQ ID N0.1。
[0009]平邑甜茶无融合生殖相关MhSERKl基因的植物表达载体，由本发明所述的平邑甜茶无融合生殖相关MhSERKl基因与中间植物表达载体PBI121构成。
[0010]平邑甜茶无融合生殖相关MhSERKl基因的植物表达载体pBI 121-MhSERKl的构建方法，包括如下步骤:
[0011]DMhSERKl基因的克隆
[0012]提取平邑甜茶发育时期的子房总RNA，然后反转录获得cDNA第一链；设计引物扩增MhSERKl基因:
[0013]上游引物S1: 5 ’ -GGATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT-3 ’
[0014]下游引物S2:5 ’ -ACTTACCTTGGACCGGATAACT-3 ’
[0015]以反转录获得的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR扩增反应，产物连接到PGM-T载体，转化T0P10感受态细胞，进行序列测定；
[0016]2)植物表达载体pBI 121-MhSERKl的构建
[0017]设计引物以平邑甜茶子房cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在MhSERKl基因的上下游设计一对引物，并分别引入酶切位点XbaI和SmaI序列:
[0018]上游引物MhSERKl-Xba1:5’ -GGTCTAGAATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT-3’
[0019]下游引物MhSERKl-Sma1:5’ -ACCCCGGGTTACCTTGGACCGGATAACTC-3’
[0020]PCR产物连接到PGM-T载体得到重组质粒PGM-T-MhSERKl，转化T0P10感受态细胞；提取阳性质粒PGM-T-MhSERKl和pBI121，并用XbaI和SmaI双酶切后，连接，转化，筛选并测序验证，植物表达载体pBI 121-MhSERKl构建成功。
[0021]3)MhSERKl的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化，创制植物新品种。方法如下:
[0022]农杆菌菌株EHA105感受态细胞制备，具体步骤如下:
[0023](I)将冻存的农杆菌EHA105菌液在含有50mg.L—1利福平(Rif)的YEP (pH=7.0)固体培养基上涂板培养，28 °C倒置培养48h。
[0024](2)待培养基上长出菌斑，挑取农杆菌EHA105单菌落接种于含有50mg.T1Rif的YEP (pH=7.0)液体培养基中，28°C，200rpm.mirT1 振荡培养过夜(16_20h)。
[0025](3)取上述菌液按1:50比例接种于50mL含有50mg.T1Rif的YEP (pH=7.0)液体培养基中，28°C，150rpm.mirT1振荡培养。
[0026](4)当震荡培养液体0D600达到0.5左右时，用1.5mL离心管取1.5mL摇好的菌液，冰上冷却 IOmin, 5000rpm.mirf1 离心 5min。
[0027](5)弃上清液，收集菌体，加入等体积冰预冷的25mM CaCl2溶液重悬沉淀，冰上放置 20min 至 4°C 离心机 5000rpm.mirT1 离心 5min。
[0028](6)弃上清液，每管加入50 μ L预冷的25mM CaCl2溶液重悬沉淀，冰上放置20min后使用。剩余的感受态细胞在液氮中速冻后于_80°C超低温冰箱中保存。
[0029]冻融法转化大肠杆菌，具体操作如下:[0030]取质粒DNAlO μ L加入30-100 μ L农杆菌感受态细胞ΕΗΑ105，用枪尖轻轻吹打均匀混合，放于冰盒冰浴5min ;转入液氮冷冻lmin，将离心管迅速置于37°C水浴5min，再迅速冰浴2min，然后将其加入800 μ L YEP (ρΗ=7.0)液体培养基，28°C，160rpm.mirT1震荡培养4_6h,离心后剩约100 μ L菌液涂布于含50mg.L-1Rif和50mg.L-1Kan的YEP (pH=7.0)固体培养基(胰蛋白胨lg，酵母浸粉lg，NaCI0.5g，琼脂粉1.5g，融解于IOOmL无菌水中，经高温高压灭菌凝固，下同)中，28 °C倒置培养48h，出现菌斑。
[0031]烟草叶片浸染；
[0032]PCR 鉴定。
[0033]本发明提供平邑甜茶无融合生殖相关MhSERKl基因在普通植物中的应用。
[0034]本发明的有益效果:
[0035]I)本发明提供的平邑甜茶MhSERKl是一个新的无融合生殖基因，该基因可使普通植物具有无融合生殖特性。
[0036]2)本发明构建的MhSERKl基因植物表达载体首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创制无融合生殖新品种，提高无融合生殖能力，可进行植物品种改良。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1:为MhSERKl琼脂糖凝胶电泳分析；
[0038]图2:pGM-MhSERKl 质粒 XbaI 和 SmaI 双酶切；
[0039]M:200bp DNAmark·er ;泳道1-4:平邑甜茶；泳泳道5_8:pBI121表达载体
[0040]图3:pBI121-MhSERKl 表达载体 XbaI 和 SmaI 双酶切检测图:M:lkb DNAmarker ；泳道1-4:平邑甜茶；
[0041]图4:植物表达载体pBI121-MhSERKl构建方法示意图；
[0042]图5:转基因烟草植株与对照植株比较；
[0043]图6 =PCR鉴定烟草转基因植株MhSERKl基因表达；
[0044]M:100bp Marker ;泳道:1清水，2未转化对照植株，3质粒阳性对照；A:4_10是MhSERKl转化烟草植株；
【具体实施方式】
[0045]植物表达载体pBI121_MhSERKl的构建
[0046]实施例1:平邑甜茶无融合生殖MhSERKl基因的克隆:
[0047]1、总RNA的提取及反转录成cDNA:
[0048](I)总RNA的提取使用TIANGEN生化科技公司的RNApr印pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)获得，具体操作见试剂盒说明书。
[0049](2)反转录cDNA的合成利用宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScript?RTreagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒将 RNA 反转录为cDNA，作为PCR模板备用。
[0050]2.利用Primer Primer5.0软件分析设计引物扩增MhSERKl ;
[0051]上游引物MhSERKl-F:5’ -GGATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT-3’
[0052]下游引物MhSERKl-R:5’ -ACTTACCTTGGACCGGATAACT-3’[0053]以提取的平邑甜茶子房cDNA为模板，进行PCR反应。
[0054]反应体系:25 μ L体系，取I μ L cDNA加入Taq DNA聚合酶0.25 μ L，10XPCRBuffer2.5μ L, dNTPs (2.5mmol.L-1) 2.0 μ L，正反向引物各 1 μ L，最后用水补足到25μ L ;反应程序:95°C 5min ；94°C 40s, 60 °C 40s, 72 °C 2min，35 个循环；72°C 延伸 IOmin ；PCR扩增产物经浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳发现特异条带，用AXYGEN凝胶回收试剂盒回收纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa)将回收产物连接至pGM_T载体，然后转化大肠杆菌感受态细胞T0P10 (TIANGEN生化科技公司购买)，经PCR筛选，进行序列测定；
[0055]实施例2:植物表达载体pBI 121-MhSERKl的构建
[0056]1主要试剂:质粒提取试剂盒购自TIANGEN生化科技有限公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶XbaI和SmaI购自大连宝生物工程有限公司；含质粒pBI121的菌种由沈阳农业大学园艺学院提供。
[0057]2重组植物表达载体pBI 121-MhSERKl的构建
[0058]2.1引物设计:根据目的基因MhSERKl核苷酸序列设计上下游引物，分别引入XbaI(TCTAGA)和SmaI (CCCGGG)酶切位点，引物为:
[0059]上游引物MhSERKl-Xba1:5’ -GGTCTAGAATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT-3’
[0060]下游引物MhSERKl-Sma1:5’ -ACCCCGGGTTACCTTGGACCGGATAACTC-3’
[0061]2.2PCR扩增:以实验例I中的cDNA第一链为模板，引物MhSERKl-XbaI和MhSERKl-SmaI 做 PCR 扩增:体系为 25 μ L:取 I μ L cDNA 加入 Taq DNA 聚合酶 0.25 μ L,10XPCR Buffer2.5 μ L, dNTPs (2.5mmol.L-1) 2.0 μ L，正反向引物各 I μ L，最后用无菌水补足到 25 μ L ;反应程序:95°C 5min ；94°C 40s, 60°C 40s, 72°C 2min，35 个循环；72°C 延伸IOmin ；
[0062]2.3电泳:将2.2扩增的PCR产物经1%浓度的琼脂糖凝胶电泳发现特异条带，与预期结果相符。
[0063]2.4将2.2中PCR产物电泳后用DNA纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至PGM-T载体得到重组载体PGM-T-MhSERKl，然后转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒，XbaI和SmaI双酶切的MhSERKl片段与XbaI和SmaI双酶切的pBI121连接，转化，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证。
[0064]2.5将2.4含重组载体PGM-T-MhSERKl的阳性菌液进行培养，并采取普通质粒提取试剂盒的方法提取菌液中的重组质粒PGM-T-MhSERKl ;将实验室提供的含有植物表达质粒PBI121的菌种扩大培养，用同样的方法提取质粒PBI121，将提取的PGM-T-MhSERKl质粒和pBI121质粒分别用XbaI和SmaI限制性内切酶双酶切，酶切后琼脂糖凝胶电泳检测条带，并切下PGM-T-MhSERKl质粒的小片段和pBI121质粒的大片段，利用胶回收试剂盒回收。用T4DNA连接酶连接小片段和大片段(连接体系为:小片段2.7 μ L，大片段7 μ L，T4DNA连接酶I μ L，10 X Bufferl.5 μ L，ddH20不足至15 μ L)过夜连接，然后利用热激法转化大肠杆菌T0P10 ；PCR筛选阳性克隆，再进行测序验证，得到序列完全正确的重组表达载体pBI 121-MhSERKl及含该重组表达载体的大肠杆菌。
[0065]2.6pBI121-MhSERKl重组质粒转化农杆菌:从2.6中含pBI121_MhSERKl载体的菌株中提取重组质粒，用冷激法转化农杆菌EHA105，转化方法为:①去1(^1^质粒0嫩，加入30-100 μ L农杆菌感受态细胞ΕΗΑ105，充分混匀，冰浴5min，转入液氮冷冻Imin ;②迅速转入37°C水浴5min后，加入800 μ LYEP液体培养基(称取胰蛋白胨lg，酵母浸粉lg，NaCI0.5g,融解于IOOmL无菌水中，经高温高压灭菌备用；下同)?’③28°C, 150rpm预培养4_5h，然后涂布于含有Kan (50mg(50mg f1)的YEP平板，28°C培养48h后可出
现菌落；④挑取菌体做PCR鉴定，确定正确后保存于_70°C，即为植物遗传转化的工程菌株。
[0066]实施例3:植物表达载体pBI 121-MhSERKl的遗传转化
[0067]I)农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化
[0068]农杆菌菌株EHA105感受态制备，具体步骤为:
[0069](I)将冻存的农杆菌EHA105菌液在含有50mg.L—1利福平(Rif)的YEP (pH=7.0)固体培养基(同上)上涂板培养，28 °C倒置培养48h。
[0070](2)待培养基上长出菌斑，挑取农杆菌EHA105单菌落接种于含有50mg.L4Rif的YEP (pH=7.0)液体培养基中，28°C，200rpm.mirT1 振荡培养过夜(16_20h)。
[0071](3)用移液枪根据上述菌液的浓度确定确定吸取体积比，一般为1:50的体积比接种于50mL含有50mg.L^1Rif的ΥΕΡ(ρΗ=7.0)液体培养基中，28°C，150rpm.mirT1振荡培养。
[0072](4)当震荡培养液体0D600达到0.5时，用1.5mL离心管取1.5mL摇好的菌液，冰上冷却 IOmin, 5000rpm.mirT1 离心 5min。
[0073](5)弃上清液，收集菌体，加入1.5mL的冰预冷的25mM CaCl2溶液重悬沉淀，冰上放置 20min 至 4°C 离心机 5000rpm.mirT1 离心 5min。
[0074](6)弃上清液，每管加入50 μ L预冷的25mM CaCl2溶液重悬沉淀，冰上放置20min后使用。剩余的感受态细胞在液氮中速冻后于_80°C超低温冰箱中保存。
[0075]冻融法转化大肠杆菌，具体操作如下:
[0076]取质粒DNAlO μ L加入30-100 μ L农杆菌感受态细胞EHA105 (实施例3中I)所制备的E HAIO 5感受态细胞)，用枪尖轻轻吹打均匀混合，放于冰盒冰浴5 m i η ;转入液氮冷冻Imin，将离心管迅速置于37°C水浴5min，再迅速冰浴2min，然后将其加入800 μ LYEP (ρΗ=7.0)液体培养基(同上)，28°C，160rpm.mirT1震荡培养4_6h，离心后剩约100 μ L菌液涂布于含50mg.L4Rif和50mg.T1Kan的ΥΕΡ(ρΗ=7.0)固体培养基中，28°C倒置培养48h，出现菌斑。挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于普通烟草叶片的遗传转化。
[0077]2)普通烟草叶片侵染
[0078]①将继代15-20d的普通烟草组培苗取出，剪取烟草新萌发的幼嫩叶片，去除叶脉，剪成0.5X0.5cm叶片置于悬浮培养液中侵染备用；
[0079]②将实施例2步骤2.6中制备好的已转化含有重组质粒的pBI 121-MhSERKl的农杆菌EHA105菌液扩大培养，放入含有IOmLYEP液体培养基(含有50mg.L^Kan+SOmg.T1Rif)的离心管中，28°C，150-200rpm/min摇菌15_20h，按照菌液浓度进行稀释，加入IOmL的含有50mg_ L-1Kan的YEP液体培养基(同上)中，28°C，150-200rpm振荡培养4_6h，至菌液浓度OD=0.4-0.6.[0080]③将悬浮液中的叶片放入农杆菌菌液中进行浸染8-10min，用灭菌的滤纸将多余的菌液吸净，将叶片置于培养基(MS+6-BA1.0mg. '+ΝΑΑΟ.lmg.L—1)上共培养3d ；
[0081]④共培养3d后，将浸染的烟草叶片用悬浮液进行清洗，然后用无菌滤纸吸干多余农杆菌菌液，再置于筛选培养基(MS+6-BA1.0mg.L_1+NAA0.lmg.L^+KanlOOmg.L^+CefSOOmg. 1)上，黑暗条件下进行筛选培养；(MS培养基是常用的公知的培养基)[0082]⑤I个月后，在浸染的叶片上长出愈伤组织，当叶片边缘出现抗性芽后，再将抗性芽转移到新的增殖培养基(MS+Kanl00mg.L^+CefSOOmg.L-1)中进行增殖培养，至得到TO代转化植株。
[0083]实施例4:植物表达载体pBI 121-MhSERKl的遗传转化烟草抗性植株的基因功能验证
[0084]待抗性苗长至5~7片叶时，选用基因组提取试剂盒提取抗性烟草植株叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板，做PCR检测验证是否为转基因烟草，反应体系为25 μ L:体系为上下游引物(MhSERKl-XbaI 和 MhSERKl-SmaI)各 I μ L,ExTaq2.5 μ L, dNTP (2.5mol/L)2 μ L，DNA 模板 I μ L，ddH20 补足至 25 μ L。PCR 反应程序为:95°C 5min，94°C 40s, 58°C 40s,72°C 2min，30个循环；72°C延伸lOmin。PCR结束后，用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测为阳性。
[0085]将该MhSERKl基因转入普通烟草植物受体系统后，当根系长至5_7条时，进行炼苗3-5天，然后将抗性苗移栽到土中，用塑料薄膜覆盖以保湿，放入大棚中遮阴培育。
[0086]经过2-3月培育TO代转化抗性株系后，烟草植株逐渐产生花蕾，在花蕾即将开放前将一部分烟草抗性植株采取去雄处理；未转化烟草对照植株采取去雄处理；
[0087]经过一段时间生长发育后对处理植株进行观察发现:采取去雄处理的烟草抗性植株可以正常结种子，而对照未转化烟草植株经过去雄处理后未能结种子。
[0088]通过上述实验说明MhSERKl基因是无融合生殖相关基因，验证了该基因无融合生殖功能，即不通过两性生殖细胞的结合可以正常产生种子。
[0089]综上所述，本发明构建了含有无融合生殖相关MhSERKl基因编码的植物表达载体pBI121-MhSERKl，其中MhSERKl基因为首次报道。所构建的载体可导入植物中，可用于研究植物的无融合生殖分子机理。
[0090]以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
【权利要求】
1.苹果属平邑甜茶无融合生殖相关MhSERKl基因植物表达载体，其特征在于是由平邑甜茶无融合生殖相关MhSERKl基因与植物表达载体PBI121构成。
2.根据权利要求1所述的苹果属平邑甜茶无融合生殖相关MhSERKl基因的植物表达载体，其特征在于所述的植物表达载体为XbaI和SmaI双酶切MhSERKl后插入到表达载体PBI121质粒进行重组反应得到。
3.如权利要求2所述的平邑甜茶无融合生殖相关MhSERKl基因植物表达载体的构建方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)平邑甜茶无融合生殖MhSERKl基因的克隆 提取平邑甜茶发育时期的子房总RNA，然后反转录获得cDNA第一链；设计引物扩增MhSERKl 基因:
上游引物 S1: 5 ’ -GGATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT-3，
下游引物 S2:5 ’ -ACTTACCTTGGACCGGATAACT-3， 以反转录获得的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR扩增反应，产物连接到PGM-T载体，转化TOPlO感受态细胞，进行序列测定； 2)植物表达载体pBI121-MhSERKl的构建 设计引物以平邑甜茶子房cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在MhSERKl的上下游分别引入酶切位点XbaI和SmaI序列:
上游引物 MhSERKl-Xba·1:5’ -GGTCTAGAATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT-3’
下游引物 MhSERKl-Sma1:5’ -ACCCCGGGTTACCTTGGACCGGATAACTC-3’ PCR产物连接到PGM-T载体得到重组质粒PGM-T-MhSERKl，转化T0P10感受态细胞；提取质粒PGM-T-MhSERKl和pBI121，并用XbaI和SmaI双酶切后连接，转化，筛选并测序验证，植物表达载体pBI 121-MhSERKl构建成功。
4.如权利要求1所述的苹果属平邑甜茶无融合生殖相关MhSERKl基因植物表达载体，其特征是在植物无融合生殖发育特性中的应用。
【文档编号】C12N15/66GK103849646SQ201310641283
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】张丽杰, 董文轩, 王玉霞, 孙晓梅, 祁庆钦 申请人:沈阳农业大学