脯氨酸蓄积能力高的稻科植物及其生产方法

专利名称：脯氨酸蓄积能力高的稻科植物及其生产方法
技术领域：
本发明涉及脯氨酸蓄积能力高、耐盐性、耐干燥性、耐冷性都很高的稻科植物及其生产方法。
人们已知在包括盐生植物在内的几种植物中，植物如果受到高盐胁迫和干燥胁迫，细胞内就会蓄积脯氨酸(氨基酸的一种)。蓄积的脯氨酸能够调节植物细胞内的渗透压和抑制由于胁迫造成的功能蛋白质的变性。植物内的脯氨酸是在Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和Δ1-吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)两个酶的催化下由谷氨酸合成的。而脯氨酸在脯氨酸脱氢酶(ProDH)和Δ1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(P5CDH)两个酶的催化下可分解为谷氨酸。
上述植物如果受到高盐胁迫或干燥胁迫等水胁迫(难吸收水的状态)，P5CR活性及其基因表达水平都升高，P5CS被激活，但P5CR活性及其基因表达仍处于一定的低水平。另外代谢体系的基因表达和酶活性也变成了被抑制的状态。可是一旦水胁迫被解除，合成体系的基因表达和酶活性被抑制，ProDH基因表达被快速诱导，酶活性也提高，蓄积在细胞内的脯氨酸也快速代谢为谷氨酸。
从以上代谢过程可以认为水胁迫时脯氨酸合成中P5CS成了限速酶，而水胁迫解除后的脯氨酸代谢中ProDH成了限速酶(Yoshiba等，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)381095-1102(1997))。

发明内容
随着地球环境的恶化，干燥和半干燥造成的盐类土壤的增加以及由于人口增加造成的食物供应不足状况越来越严重。所以耐高盐胁迫、干燥胁迫以及低温胁迫(难吸收水状态)的作物的育种在解决世界的粮食问题中起着重要的作用，现在从各个方面在进行研究，有希望取得成果。
本发明的目的在于着眼于植物脯氨酸合成和分解代谢过程中的限速酶Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和脯氨酸脱氢酶(ProDH)的重要性，通过基因重组技术对这些酶基因的表达进行控制，提供脯氨酸蓄积能力高，因而耐盐性、耐干燥性、耐冷性都提高的稻科植物及其生产方法。
可以通过导入脯氨酸合成体系中的P5CS基因使其表达过量，或是导入分解代谢体系中的ProDH基因的反义(带有反向碱基序列)基因来抑制脯氨酸的分解，或是同时导入P5CS基因和ProDH基因，一方面抑制了脯氨酸的分解，而另一方面又促进脯氨酸合成等手段使得水稻和稻科植物的细胞内蓄积高浓度的脯氨酸。
本发明通过蓄积高浓度的脯氨酸，可以在分子水平上对具有耐盐性、耐干燥性或耐冷性的水稻和稻科植物进行育种(分子育种)。
到目前为止有关通过促进合成或抑制分解来提高作为抗渗透溶质的脯氨酸浓度还没有报道。本发明的发明人着眼于P5CS基因和ProDH基因的重要性，为了解决以前没有解决的新的技术课题，对容易进行基因导入的水稻品种的选定、提高愈伤组织形成速度、水稻用基因导入载体的构建等各个方面进行了研究，开发出新的技术，直至完成本发明。
在本发明中提供了分别或联合导入来自水稻或Arabidopsis thaliana的脯氨酸的合成基因、脯氨酸分解基因的反义基因，然后进行转化的稻科植物及其生产方法。
在本发明的稻科植物中导入了编码脯氨酸合成酶的基因、或是导入了脯氨酸分解酶的反义基因、或是同时导入了这两个基因。通过这样构建，可以培养出耐盐性、耐干燥性和耐冷性都提高的稻科植物。另外，从本发明的稻科植物收获的成熟种子，特别是水稻种子历经数代仍具有保持高的脯氨酸蓄积能力的特点。
本发明虽然是以水稻或稻科食物作为对象，但只要是属于稻科植物并没有特别限定。属于稻科的植物有水稻、玉米、小麦、大麦、黑麦、矮草、谷子和稗子等。本发明特别优选适合于水稻。


图1A-
图1D表示重组了脯氨酸合成体系酶P5CS基因和脯氨酸分解代谢酶ProDH基因及其反义基因的水稻用载体。
图2表示通过基因操作导入了
图1A-
图1D给出的载体的水稻没有表现出胁迫的脯氨酸蓄积量。
图3表示重组了图2给出的与脯氨酸相关基因的基因重组水稻的耐盐性。
具体实施例方式
在本发明的实施例的稻科植物中，导入了来自水稻或Arabidopsisthaliana的脯氨酸(抗渗透溶质)的合成基因、脯氨酸分解基因的反义基因中的任一个或将两者都导入后进行转化。
向本发明实施例的稻科植物导入一种基因的例子有(1)含有序列号1记载的序列(碱基序列和氨基酸序列)的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因、(2)含有序列号2记载的序列(碱基序列和氨基酸序列)的Arabidopsis thaliana P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因、(3)含有序列号3记载的序列(碱基序列和氨基酸序列)的Arabidopsisthaliana ProDH(脯氨酸脱氢酶)基因的反义(带有反向碱基序列)基因。
向本发明实施例的稻科植物导入两种基因的例子有(1)含有序列号1记载的序列的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因或含有序列号2记载的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因与含有序列号3记载的序列的Arabidopsis thaliana ProDH(脯氨酸脱氢酶)基因的反义(带有反向碱基序列)基因的两种基因。(2)含有序列号1记载的序列的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因或含有序列号2记载的序列的Arabidopsis thaliana P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因与含有序列号3记载的序列的Arabidopsisthaliana ProDH(脯氨酸脱氢酶)基因的反义(带有反向碱基序列)基因一前一后地(串联)连接的两种基因。
在本发明实施例使用的载体中插入了含有序列号1记载的序列的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因、含有序列号2记载的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因、含有序列号3记载的序列的Arabidopsis thaliana ProDH(脯氨酸脱氢酶)基因的反义(带有反向碱基序列)基因中的任一个基因，或是插入了水稻或Arabidopsis thalianaP5CS基因与上述的反义基因一前一后地连接的两个基因。
本发明实施例的稻科植物可以通过以下的任一操作获得。(1)将上述载体导入来自稻科植物的愈伤组织，使该愈伤组织增殖后从愈伤组织再分化植物体。(2)将上述载体导入来自稻科植物的原生质体，从使该原生质体增殖后的集群中使植物体再分化。(3)与通过基因操作导入上述载体后获得的稻科植物进行杂交。
作为本发明实施例的稻科植物的生产方法有诸如以下的一些例子。(1)利用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将上述载体导入来自稻科植物的愈伤组织，使该愈伤组织增殖后，使植物体再分化。(2)通过电穿孔将上述载体导入取自稻科植物的原生质体，从使该原生质体增殖后的集群中使植物体再分化。(3)与通过基因操作导入上述载体后获得的稻科植物进行杂交。
在这些生产方法中提供了脯氨酸蓄积能力高而且耐盐性、耐干燥性和耐冷性提高的稻科植物的生产方法。
另外，从本发明实施例的稻科植物收获的成熟种子，特别是水稻种子历经数代仍保持高的脯氨酸蓄积能力。
以下通过以水稻为例按照步骤详细说明实现本发明实施例的稻科植物及其生产方法的例子。不用说以下说明的步骤无论是原来步骤还是变更过的步骤也都适用于水稻以外的稻科植物。
(基因的克隆)最开始是从水稻幼苗提取mRNA，利用该mRNA合成cDNA。将该cDNA与由质粒或嗜菌体构建的载体连接，导入宿主微生物(E.coli)中，制备重组DNA。导入该重组DNA的转化体通过使用Arabidopsis thalianaP5CS基因作为探针的蚀斑杂化技术进行筛选。由于水稻以及Arabidopsisthaliana P5CS基因的序列已有报道(Yoshiba等人，植物学(Plant.J).(1995)7751-760、Igarashi等人，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)(1997)33857-865)，以这些序列作为基础设计引物，然后利用PCR进行筛选，筛选出目的转化体。从得到的转化体分离出目的质粒，如果需要，可以用限制性内切酶切，然后通过对质粒载体亚克隆使其克隆。Arabidopsis thaliana P5CS基因也用与水稻克隆化同样的方法进行克隆。但是，提取mRNA的样品可以是从通常环境下培育的，但最好是实施高盐胁迫(浸在250mM NaCl溶液中)或干燥胁迫处理的样品。因为这样操作可以诱导对高盐胁迫或干燥胁迫应答的P5CS基因(Yoshiba等人，植物(Plant.J).(1995)7751-760、Igarashi等人，PlantMol.Biol.(1997)33857-865、Yoshiba等人，细胞生理学(Plant CellPhysiol.)(1997)381095-1102)。
另外Arabidopsis thaliana ProDH基因(序列已经由Kiyosue等人报道过植物细胞(Plant Cell)(1996)81323-1335)也可以利用上述方法进行克隆。但是提取mRNA的样品最好是用给予干燥胁迫(大约处理10小时)后，然后再浸入水中吸收水的样品或者是浸入脯氨酸溶液吸收脯氨酸的样品等。这样做是由于ProDH基因受到水胁迫期间其表达受到抑制，而通过高浓度的脯氨酸又可诱导该基因的表达(Kiyosue等人Plant Cell)(1996)81323-1335、Yoshiba等人，植物细胞生理学(PlantCell Physiol.)(1997)381095-1102)。
如果使用以上样品，P5CS基因和ProDH基因不仅可以从水稻或Arabidopsis thaliana分离出，也可以从其他稻科植物中分离出来。
(基因导入载体的构建)克隆的各个P5CS基因和ProDH基因用适当的限制性内切酶从质粒中切出，然后如
图1A-
图1D所示的那样连接在将pBI载体改进的水稻用载体花椰菜花叶病毒的35S启动子的后面。在
图1A-
图1D中，RB代表右边界，35Spro代表花椰菜花叶病毒的启动子、P5CS代表水稻或Arabidopsisthaliana的脯氨酸合成体系的酶基因、ProDH代表Arabidopsis thaliana的脯氨酸分解代谢体系的酶基因、Noster代表胭脂碱合成酶基因的终止子、HTP代表潮霉素抗性基因、LB代表左边界。而箭头表示基因的有意义方向。
在
图1A-
图1D中，
图1A表示构建的载体图，载体中的序列依次为RB-35SPro-P5CS-Noster-35SPro-HTP-Noster-LB。
图1B与上述A相比，RB-35SPro-P5CS-Noster-35Spro-HTP-Noster-LB的次序与
图1A的构建相同，但基因P5CS序列为反义序列。
图1C替换了上述
图1A构建的基因P5CS，基因ProDH换成反义序列，构建成的载体中基因的次序为RB-35SPro-35SProDH(反义)-Noster-35Spro-HTP-Noster-LB。
图1D是在上述A的构建中基因ProDH为反义序列、而将上述C给出的构建一前一后地连接，构建的载体为RB-35SPro-P5CS-Noster-35SPro-ProDH(反义)-Noster-35SPro-HTP-Noster-LB。
众所周知35S启动子是强力启动子，是无论在哪种组织中都能稳定诱导基因表达的启动子。而插入基因的方向对于P5CS是有义方向，而对于ProDH是反义方向连接。
连接了基因的载体利用电穿孔技术导入根癌土壤杆菌EHA101菌中。导入各个构建载体(
图1A-
图1D)的根癌土壤杆菌通过含有细菌培养用胨(10g/l)、细菌培养用酵母提取物(10g/l)、氯化钠(5g/l)、1M氯化镁(2ml/l)、潮霉素B(50mg/l)的YEP培养基于28℃下培养，使其增殖。用导入了构建载体(
图1A-
图1D)的根癌土壤杆菌感染水稻愈伤组织进行基因导入。构建载体D是按照将两个基因(P5CS基因和ProDH基因)一前一后地连接之后同时导入那样设计的，而如果将构建载体A和C混合共感染也可获得与构建载体D感染同样的效果。
另外，虽然在各个构建载体中都连接了HPT(潮霉素)基因，但由于它是用来作为解析导入基因的效果的基础研究用，为的是更有效地选择转化的细胞和植物体，所以在实际的盐害地或干燥地栽培时不必插入它。
(基因导入用水稻愈伤组织的诱导)成熟的水稻种子剥去壳之后，放置于70％乙醇10分钟，3％次氯酸钠1小时进行杀菌。杀菌后，用灭菌水将种子洗3次，然后放置在含有1g/l的酪蛋白氨基酸、30g/l的蔗糖、2mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸、2g/l脱乙酰吉兰糖胶的pH5.8的N6培养基(2N6培养基)上，于28℃在黑暗条件下培养3～5周。
(向水稻愈伤组织导入基因)上述诱导的直径为1～3mm的水稻愈伤组织载置于2N6培养基，于28℃在黑暗条件下培养3～4日。通过这样培养可以提高愈伤组织细胞的分裂活性。通过将培养的愈伤组织与在YEP培养基中增殖的导入了各个构建载体的根癌土壤杆菌液(菌浓度OD660nm测定值为0.1)混合使其感染进行基因导入。然后愈伤组织于25℃在黑暗条件下培养3天。培养后，用1mg/4ml浓度的头孢噻肟水溶液将附着在愈伤组织表面上多余的菌洗几次进行杀菌，用灭菌的一次性纸巾等擦过后，放置在含有250mg/l的头孢噻肟、10mg/l的潮霉素B的2N6培养基(一次选择培养基)上，于28℃在黑暗条件下培养1周。
(转化愈伤组织的选择和植物体的再分化)将在含有头孢噻肟培养基中培养的愈伤组织置于含有30mg/l的潮霉素B的培养基(二次选择培养基)中，于28℃在黑暗条件下培养3周。然后将愈伤组织移到含有30g/l蔗糖、30g/l山梨糖醇、酪蛋白氨基酸2g/l、MES缓冲液11g/l、萘乙酸(NAA)2mg/l、kinetin 1mg/l、头孢噻肟250mg/l、潮霉素B 30mg/l、脱乙酰吉兰糖胶4g/l的pH5.8的MS培养基(再分化诱导培养基)，于28℃在亮处培养3周。导入了基因的愈伤组织形成绿色斑点，从该斑点分化出芽和根。将分化的愈伤组织再移到含有蔗糖30g/l蔗糖、头孢噻肟250mg/l、潮霉素B 30mg/l、琼脂8g/l的去除了植物激素的pH5.8的MS培养基(植物体形成培养基)中，通过于28℃在亮处培养数周使植物体培育得更大些。
(转化水稻植物体的培育和种子形成)再分化的水稻于培养皿内培育到高度大约4～5cm后移入加入了育苗用土壤的花盆中，在照度大约为2万流明的人工气象培育箱内于28℃的温度条件下一直培育到从第4个叶长到第5个叶为止。将幼苗移到加了含有适量肥料的黑土的盆中，于温室内培育到种子成熟。再分化的当代的植物体是T0代，从该植物体收获的种子培育为T1代，一直培育到T2～T3代。在实际农田栽培时，要对各代多次进行各种安全性评价实验，确认安全之后再推向市场。
(从转化水稻提取脯氨酸和浓度测定)脯氨酸从T2代或T3代的转化水稻幼苗(第4叶展开后的幼苗)的叶提取。将在人工气象培育箱中培育的水稻幼苗的叶用剪刀等剪成大约200mg大小的片，然后在研钵内加入液氮研磨到成粉末状为止。粉末样品加入纯水再用匀浆器研磨粉碎。粉碎了的样品于97℃加热6分钟后进行冰冷，然后于4℃，17000G条件下离心10分钟，分离出上清。向得到的上清中加入氯乙酸(最终浓度为5％)混合，离心10分钟(4℃，17000G)，使蛋白质沉淀。作为抗渗透溶质的脯氨酸包含在离心后的上清中，其浓度可以通过高效液相色谱(HPLC)测定。脯氨酸的定性定量首先要通过HPLC测定浓度一定的各种氨基酸的标准样品，以他们的保留时间作为基础进行换算，来定量实际的基因重组水稻叶所含有的脯氨酸的量。
图2表示的是导入各种基因的重组水稻没有给予胁迫时的脯氨酸含量。图中左侧空白部位为没有重组与脯氨酸相关的基因的对照，而右侧5个涂黑的条块图分别表示插入了与脯氨酸相关的基因的基因重组水稻的各个体系。可以看出脯氨酸的量由于导入的基因的种类不同而不同。
左数第2列是反义导入水稻P5CS基因(OsP5CS)(
图1B)的水稻几乎没有蓄积脯氨酸。左数第3列是有义导入Arabidopsis thaliana P5CS基因(AtP5CS)(
图1A)的水稻，与对照相比，能看出脯氨酸蓄积量在增加。同样左数第4列和第5列反义导入Arabidopsis thaliana ProDH基因(AtProDH)的水稻(
图1C)和有义导入水稻P5CS基因(OsP5CS)(
图1A)的水稻，分别与对照相比，能看出脯氨酸蓄积量在增加。与此相对应，右端的有义导入水稻P5CS基因(OsP5CS)、反义导入Arabidopsisthaliana ProDH基因(AtProDH)的水稻与上述导入一种基因的水稻相比，可以确认蓄积的脯氨酸量要高得多(最高的比对照高100倍以上)。而且可以看出就有义导入基因的水稻来说，在脯氨酸蓄积方面导入OsP5CS(左数第5列)要比导入AtP5CS(左数第3列)效果稍微好些。
(耐盐性试验和基因重组水稻的耐盐性的提高)图3表示的是使用图2右侧4列给出的几个可确认有脯氨酸蓄积的基因重组水稻体系，于250mM浓度(大约是海水盐浓度的一半)进行耐盐性实验的结果。空白部分为没有插入与脯氨酸相关的基因的对照，涂黑的部分代表基因重组水稻。耐盐性实验按照以众所周知的存活率为指标的实验方法(特开平09-266726号，发明的名称植物耐盐性的简易评价方法)进行。没有导入与脯氨酸相关的基因的对照在盐处理3天后都枯死了，而与此相反，蓄积脯氨酸的重组水稻在盐处理的第3天存活率为95％，即使处理5天存活率仍高达65％。由此看出，通过利用基因重组提高水稻蓄积脯氨酸的能力可以使耐盐性提高。
因此，利用本发明培育的稻科作物进一步进行安全性评价等详细解析，使之品种化，将来有可能在盐类集积的土壤或沙化土壤中栽培，有望提高粮食生产。另外，对于应付处于发展中国家出现的人口增加也带来了很大的希望。
利用本发明可以培育成使脯氨酸蓄积能力提高的基因重组稻科植物。另外，由于利用本方法培育的稻科植物的脯氨酸蓄积量提高，所以提高植物的耐盐性成为可能。
序列表<110>Hitachi，LTD.
RIKEN日本农业科学国际研究中心生物技术高级研究所(BRAIN)<120>通过脯氨酸和它的产物的浓度蓄积研究发明的转基因水稻植物及其耐环境胁迫的家族。<130>NT01P0353<160>3<210>1<211>2549<212>DNA<213>Oryza sativa L.<220><221>CDS<222>99..2249<300><301>Yumiko Igarashi，Yoshu Yoshiba，YukikaSanada，Kazuko Yamaguchi-Shinozaki，Keishiro Wada，Kazuo Shinozaki<302>Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因的特征以及该基因表达和在Oryza sativa L中耐盐性之间的关系。<303>植物分子生物学<304>33<306>857-865<307>1996-12-03<308>D49714<309>1995-03-16<400>1gcggctgcgg cggcaaggcg gcgagacgtg ggagagggat ttacaggtag agggagaggg 60tggaggagga gaggctgagg ctaggaagcg gtttcgcc atg gcg agc gtc gac ccg 116Met Ala Ser Val Asp Pro1 5tcc cgg agc ttc gtg agg gac gtg aag cgc gtc atc atc aag gtg ggc 164Ser Arg Ser Phe Val Arg Asp Val Lys Arg Val Ile Ile Lys Val Gly10 15 20act gca gtt gtc tcc aga caa gat gga aga ttg gct ttg ggc agg gtt 212Thr Ala Val Val Ser Arg Gln Asp Gly Arg Leu Ala Leu Gly Arg Val25 30 35gga gct ctg tgc gag cag gtt aag gaa ctg aac tct tta gga tac gaa 260Gly Ala Leu Cys Glu Gln Val Lys Glu Leu Asn Ser Leu Gly Tyr Glu40 45 50gtg att ttg 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2277Tyr Thr His Gln Asp Ile Pro Ile Gln Ala710 715gtgtttgtgt atttggttga gacttgagga gagacacaga ggaggatggg cttttttgtt 2337tcctctctgc ttagtactca tatcctatca ttattattat tactactact tattattgaa 2397accctcgctt atgtagtggt tttgatttag ggttaggatt gcaccaaaaa taagatccac 2457tttaccactt agtcttgctc ataagtacga tgaagaacat ttaattagct tctcttcttg 2517tcattgtaag ctacctacac atttctgatc tttatcaaga tactactact tttc2571<210>3<211>1833<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<220><221>CDS<222>113...1612<301>Tomohiro Kiyasue，Yoshu Yoshiba，KazukoYamaguchi-Shinozaki，Kazuo Shinozaki<302>Title编码线粒体脯氨酸脱氢酶的核基因，参与Arabidopsis中脯氨酸代谢的酶，该酶受脯氨酸的正调节，受脱水的负调节。<303>The Plant Cell<304>8<306>1323-1335<307>1996-05-27<308>D83025<309>1995-12-25<400>3agcgtttaga aaaaaacagc gataaaaccg aaacatcaag caaacaaaaa aaaaagagaa 60gagaaattat ttttttttgt tttcgttttc aaaaacaaaa tctttgaatt tt atg gca 118Met Ala1acc cgt ctt ctc cga aca aac ttt atc cgg cga tct tac cgt tta ccc166Thr Arg Leu Leu Arg Thr Asn Phe Ile Arg Arg Ser Tyr Arg Leu Pro
5 10 15gct ttt agc ccg gtg ggt cct ccc acc gtg act gct tcc acc gcc gtc214Ala Phe Ser Pro Val Gly Pro Pro Thr Val Thr Ala Ser Thr Ala Val20 25 30gtc ccg gag att ctc tcc ttt gga caa caa gca ccg gaa cca cct ctt262Val Pro Glu Ile Leu Ser Phe Gly Gln Gln Ala Pro Glu Pro Pro Leu35 40 45 50cac cac cca aaa ccc acc gag caa tct cac gat ggt ctc gat ctc tcc310His His Pro Lys Pro Thr Glu Gln Ser His Asp Gly Leu Asp Leu Ser55 60 65gat caa gcc cgt ctt ttc tcc tct atc cca ace tct gat ctc ctc cgt358Asp Gln Ala Arg Leu Phe Ser Ser Ile Pro Thr Ser Asp Leu Leu Arg70 75 80tcc acc gcc gtg ttg cat gcg gcg gcg ata ggt cct atg gtc gac cta406Ser Thr Ala Val Leu His Ala Ala Ala Ile Gly Pro Met Val Asp Leu85 90 95ggg acg tgg gtc atg agc tct aaa ctt atg gac gct tcg gtg acg cgt454Gly Thr Trp Val Met Ser Ser Lys Leu Met Asp Ala Ser Val Thr Arg100 105 110ggc atg gtt tta ggg ctt gtg aaa agt acg ttt tat gac cat ttt tgc502Gly Met Val Leu Gly Leu Val Lys Ser Thr Phe Tyr Asp His Phe Cys115 120 125 130gcc ggt gaa gat gcc gac gca gcc get gag cgc gtg aga agc gtt tat550Ala Gly Glu Asp Ala Asp Ala Ala Ala Glu Arg Val Arg Ser Val Tyr135 140 145gaa gct act ggt ctt aaa ggg atg ctt gtc tat ggc gtc gaa cac gcc598Glu Ala Thr Gly Leu Lys Gly Met Leu Val Tyr Gly Val Glu His Ala150 155 160gat gac gct gta tct tgt gat gat aac atg caa caa ttc att cga acc646Asp Asp Ala Val Ser Cys Asp Asp Asn Met Gln Gln Phe Ile Arg Thr165 170 175att gaa gct gcc aaa tct tta cea aca tct cac ttt agc tca gtg gtt694Ile Glu Ala Ala Lys Ser Leu Pro Thr Ser His Phe Ser Ser Val Val180 185 190gtg aag ata act gcc att tgt cca att agt ctt ctg aaa cga gtg agc742Val Lys Ile Thr Ala Ile Cys Pro Ile Ser Leu Leu Lys Arg Val Ser195 200 205 210gat ctg ctg cgg tgg gaa tac aaa agt ccg aac ttc aaa ctc tca tgg790Asp Leu Leu Arg Trp Glu Tyr Lys Ser Pro Asn Phe Lys Leu Ser Trp215 220 225aag ctc aaa tcg ttt ccg gtt ttc tcc gaa tcg agt cct ctc tac cac838Lys Leu Lys Ser Phe Pro Val Phe Ser Glu Ser Ser Pro Leu Tyr His
230 235 240aca aac tca gaa ccg gaa ccg tta acc gcg gaa gaa gaa agg gag ctc886Thr Asn Ser Glu Pro Glu Pro Leu Thr Ala Glu Glu Glu Arg Glu Leu245 250 255gaa gca gct cat gga agg att caa gaa atc tgt agg aaa tgc caa gag934Glu Ala Ala His Gly Arg Ile Gln Glu Ile Cys Arg Lys Cys Gln Glu260 265 270tcc aat gta cca ttg ttg att gat gcg gaa gac aca atc ctc caa ccc982Ser Asn Val Pro Leu Leu Ile Asp Ala Glu Asp Thr Ile Leu Gln Pro275 280 285 290gcg atc gat tac atg gct tat tca tcg gcg atc atg ttc aat gct gac1030Ala Ile Asp Tyr Met Ala Tyr Ser Ser Ala Ile Met Phe Asn Ala Asp295 300 305aaa gac cga cca atc gtt tac aac acg att cag gcg tac ttg aga gac1078Lys Asp Arg Pro Ile Val Tyr Asn Thr Ile Gln Ala Tyr Leu Arg Asp310 315 320gcc ggt gag aga ctg cat ttg gca gta caa aat gct gag aaa gag aat1126Ala Gly Glu Arg Leu His Leu Ala Val Gln Asn Ala Glu Lys Glu Asn325 330 335gtt cct atg ggg ttc aag ttg gtg aga ggg gct tac atg tct agc gaa1174Val Pro Met Gly Phe Lys Leu Val Arg Gly Ala Tyr Met Ser Ser Glu
340 345 350cgt agc ttg gcg gat tcc ctg ggt tgc aag tcg cca gtc cac gac aca1222Arg Ser Leu Ala Asp Ser Leu Gly Cys Lys Ser Pro Val His Asp Thr355 360 365 370att cag gat act cac tct tgt tac aat gat tgt atg aca ttc ctg atg1270Ile Gln Asp Thr His Ser Cys Tyr Asn Asp Cys Met Thr Phe Leu Met375 380 385gag aaa gca tca aac ggt tct ggt ttc ggt gtc gtt ctc gca aca cat1318Glu Lys Ala Ser Asn Gly Ser Gly Phe Gly Val Val Leu Ala Thr His390 395 400aac gct gat tcg ggg aga ctt gcg tcg agg aaa gcg agt gac ctc ggg1366Asn Ala Asp Ser Gly Arg Leu Ala Ser Arg Lys Ala Ser Asp Leu Gly405 410 415atc gat aaa cag aac ggg aag ata gag ttt gca cag cta tat ggt atg1414Ile Asp Lys Gln Asn Gly Lys Ile Glu Phe Ala Gln Leu Tyr Gly Met420 425 430tca gat gca ttg tcc ttc ggg tta aag aga gca ggg ttc aat gtt agc1462Ser Asp Ala Leu Ser Phe Gly Leu Lys Arg Ala Gly Phe Asn Val Ser435 440 445 450aag tac atg ccg ttt gga ccc gtc gca acc gct ata ccg tat ctt ctc1510Lys Tyr Met Pro Phe Gly Pro Val Ala Thr Ala Ile Pro Tyr Leu Leu
455 460 465cga cgc gct tat gag aac cgg gga atg atg gcc acc gga gct cat gac1558Arg Arg Ala Tyr Glu Asn Arg Gly Met Met Ala Thr Gly Ala His Asp470 475 480cgt caa ctc atg agg atg gaa ctt aag agg aga tta atc gcc ggg att1606Arg Gln Leu Met Arg Met Glu Leu Lys Arg Arg Leu Ile Ala Gly Ile485 490 495gcg taaagagaga gtatggagcc attaaatgaa attgggaaat gtagatgaat 1659Alaaaatttcttc tatgtagttt aagaaattga aaacaaaaaa ttataatata agaaatggag 1719taggtaagaa catttcctgt ggctaaatat ttttcatgag ggactatgtt tttactatca 1779atatatcatt cacaaatgta tattcacctt atcaataaaa atgcttttta cttt183权利要求
1.稻科植物，其特征是，导入了含有序列号1记载的序列的水稻P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因。
2.稻科植物，其特征是，导入了含有序列号2记载的序列的Arabidopsisthaliana P5CS(Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶)基因。
3.稻科植物，其特征是导入了含有序列号3记载的序列的Arabidopsisthaliana ProDH(脯氨酸脱氢酶)基因的反义(带有反向碱基序列)基因。
4.稻科植物，其特征是，导入了含有序列号1记载的序列的水稻P5CS基因或含有序列号2记载的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因与含有序列号3记载的序列的Arabidopsis thaliana ProDH基因的反义基因。
5.稻科植物，其特征是，将含有序列号1记载的序列的水稻P5CS基因或含有序列号2记载的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因与含有序列号3记载的序列的Arabidopsis thaliana ProDH基因的反义基因一前一后地连接后导入。
6.载体，其特征是，插入了含有序列号1记载的序列的水稻P5CS基因、含有序列号2记载的序列的Arabidopsis thaliana P5CS基因、含有序列号3记载的序列的Arabidopsis thaliana ProDH基因的反义基因中的任一个基因，或是将水稻或Arabidopsis thaliana P5CS基因与上述的Arabidopsis thaliana ProDH基因的反义基因一前一后地连接后插入。
7.稻科植物，其特征是将权利要求6记载的载体导入来自稻科植物的愈伤组织，使该愈伤组织增殖后从愈伤组织再分化植物体培育的。
8.稻科植物，其特征是将权利要求6记载的载体导入来自稻科植物的原生质体，从使该原生质体增殖后的集群中使植物体再分化培育的。
9.稻科植物，其特征是与通过基因操作将权利要求6记载的载体导入后获得的稻科植物进行杂交得到的，导入了将权利要求6记载的载体。
10.权利要求1至9中任一项记载的稻科植物，是水稻。
11.稻科植物的种子，其特征是从权利要求1至9中任一项记载的稻科植物收获的。
12.稻科植物的种子，其特征是权利要求1至9中任一项记载的稻科植物是水稻，种子是从上述水稻收获的。
13.稻科植物的生产方法，其特征是利用根癌土壤杆菌将权利要求6记载的载体导入来自稻科植物的愈伤组织，使该愈伤组织增殖后，从上述的愈伤组织使植物体再分化。
14.稻科植物的生产方法，其特征是通过电穿孔将权利要求6记载的载体导入取自稻科植物的原生质体，从使该原生质体增殖后的集群中使植物体再分化。
15.稻科植物的生产方法，其特征是与通过基因操作将权利要求6记载的载体导入后获得的稻科植物进行杂交，导入了权利要求6记载的载体。
全文摘要
为了获得通过提高脯氨酸蓄积能力来提高耐盐性水平的转化稻科植物，利用基因操作技术将水稻P5CS(Δ1－吡咯啉－5－羧酸合成酶)基因或Arabidopsis thaliana P5CS基因与Arabidopsis thaliana ProDH基因(脯氨酸脱氢酶)的反义(带有反向碱基序列)基因导入到稻科植物中。
文档编号A01H5/00GK1390939SQ0114407
公开日2003年1月15日 申请日期2001年12月28日 优先权日2001年6月8日
发明者吉羽洋周, 篠崎和子, 篠崎一雄 申请人:株式会社日立制作所, 独立行政法人国际农林水产业研究中心, 理化学研究所, 生物系特定产业技术研究推进机构