专利名称：生物杀伤保护系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用季铵抗生剂的抗生系统，和利用该系统消毒的方法。
背景技术：
季铵化合物是一类熟知的抗生剂。在这些中，单体季铵化合物比最近开发的聚合季铵化合物更有效抗菌，并且成本更低廉。虽然不是所有的季铵化合物具有抗生性，或彼此具有相同程度的抗生剂性质，抗生性和化学结构之间的关联是文献中报道的广泛调查的主体。本领域技术人员不难辨别用作抗生剂和不用作抗生剂的季铵化合物。本文中使用缩写(quat.抗生剂)来指生物杀伤活性的季铵化合物。
季铵抗生剂，例如苯扎氯铵，主要优点在于它们是广谱、低成本、用于一般消毒的抗生剂。季铵抗生剂显示的主要缺点之一是在蛋白质和某些离子(例如硬水中发现的那些)存在下，它们立即失活。虽然该失活的确切机制尚未被很好的理解，但是广泛接受与季铵抗生剂的阳离子位点与蛋白质的阴离子位点复合/结合有关的理论是失活的一个原因。虽然已知聚合季铵化合物在相同程度上没有这些缺点，但是它们与单体季铵抗生剂相比明显效力低而且成本更高。因此有利的是提供一种系统，它能在蛋白质和其它灭活剂的存在下增强季铵抗生剂，尤其是简单的单体季铵抗生剂的效力。
由于季铵抗生剂如此容易的被蛋白质灭活，它们通常不适合用作涂在将被蛋白质材料污染的表面，例如食物制备的表面、食物制备器械、厨房墙壁、部分和地板等，或医院的工作和其它表面、牙科或医疗实践、或消毒医疗器械、随身用品或装备等的消毒剂。另外，季铵抗生剂不能与酶(它是蛋白质)联合杀伤生物，因为它们被蛋白质灭活，还因为它们立即灭活酶。
抗生剂生物杀伤效力的便利量度是其最小抑制浓度(“MIC”)。MIC是在特定时间段，例如24小时内在培养物中成功防止细菌生长的抗生剂最小浓度的量度。
生物杀伤效力的另一种量度是在预定时间后，计算用预定浓度的抗生剂处理的标准培养物的杀伤速率。在澳大利亚，抗生剂根据TGA指定的后一种试验评级，顺序是按照下降的效力，例如B级“医院不洁”、A级“医院清洁”、C级“家用/商业”。附一份“TGA消毒试验”的拷贝。TGA试验指定为TGO 54。其它国家也有类似的试验和分类系统。“Bailey&Scott‘Diagnostic Microbiology’第八版，1990，177页”显示了MIC试验的细节。本文所引用的MIC试验进行24小时以上。
以足够有效的浓度溶于水，被TGA分类为例如A级消毒剂(“医院级，清洁”)的季铵抗生剂在存在仅1％蛋白质的情况下效力将至少减少10倍。换言之，活性抗生剂的浓度必须增加约10倍，才能在存在所述1％蛋白质的情况下达到在不存在蛋白时，该抗生剂能实现的完全杀死细菌的效果。
提出了直链和聚合的季铵化合物用于洗衣店消毒剂，但不是由于其抗菌性质，而是由于其状态控制性质；纤维软化益处或作为阳离子表面活性剂。用作软化剂或表面活性剂的季铵化合物既不是天然的也不是有效的抗生剂，其生物杀伤活性也不被制剂或水中的离子灭活，在洗衣店去污剂中使用基本上完全没有任何生物杀伤效力。
液体洗碗盘组合物使用季铵化合物作为阳离子去污剂，联合非离子去污剂来帮助除去油/脂。一些组合物含有低浓度(例如0.001％)的季铵盐，可帮助防止在打开的容器中长期储藏的去污剂组合物中长出任何细菌。
消毒被蛋白质污染的表面目前包括至少2-步的过程步骤1.物理机械除去蛋白质性污染物步骤2.消毒预清洁的表面通常这还跟随第3步步骤3.漂洗残余的消毒剂。单体季铵抗生剂的主要优点是它们其中的一些在低浓度下使用时，甚至在食物接触的表面上也不需要洗去。
在蛋白质的存在下，需要有效和经济的表面消毒。特别需要提供一步方法和组合物，用于富含酶的清洁和消毒蛋白质污染的表面。
本文中现有技术的任何讨论不是为了表示本领域一般公知的技术的状态。
本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或至少提供一种有用的替代品。
本发明的至少一些优选例的目的是提供一种季铵抗生剂，它尽管在蛋白质存在下仍维持24小时有效。
这些优选例中至少一些的另一个目的是提供一种液体浓缩的季铵抗生剂，它可轻易的用水稀释，得到工作溶液，该溶液尽管在蛋白质的存在下仍能维持至少24小时的生物杀伤效力，它在本发明的优选形式下仍能有效清洁。
优选例的另一个目的是提供一种基本保护季铵抗生剂被蛋白质灭活的方法，和使用该方法的组合物。
本发明一些高度优选例的还有一个目的是提供一种组合物，它含有季铵抗生剂，并且在充分浓度的蛋白质的存在下，比相同季铵抗生剂在水中相同浓度的简单溶液，在同样浓度的蛋白质存在下具有更小的MIC。蛋白质的“充分浓度”意味着相当于占稀释溶液重量的2wt％水溶性胰蛋白胨粉末(0XOID产品号L42)的蛋白质含量。等价的蛋白质含量定义为1升水16g可溶性蛋白质，即每次如“NitrogenCompounds.Methods for analysis of musts and wines”，pp172-195；oughC.S.；Amerine，M.A.(1988)，New yorkWiley-Interscience中所述分析的，一升水不少于0.54g氨基氮。应理解在存在少于2wt％胰蛋白胨(或其等价蛋白质)存在下应预期效力改进，并且由于一些原因，在高于2wt％胰蛋白胨(或其等价蛋白质)存在下可维持满意的效力。
发明简述根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种储藏稳定的液体消毒剂浓缩组合物，它含有至少1％重量的季铵抗生剂，并能用20份水比1份浓缩液稀释，产生稀释溶液，该稀释溶液在达2％胰蛋白胨(或其蛋白质等价物)存在的情况下，24小时后的MIC比相同浓度的蛋白质存在下，相同浓度的相同季铵抗生剂在水中的简单溶液的MIC要小。
在本发明的优选例中，当根据TGA 054试验在蛋白质污染物存在下测试时，在稀释的溶液中需要实现完全杀死铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeroginosa)的消毒剂的最小量与相同消毒剂的简单溶液相比，减少了至少25％。
“储藏稳定的”是指组合物在密封容器中18-25℃储藏12个月后仍保留至少50％的生物杀伤效力。本发明的优选例在这些条件下维持98％以上的生物杀伤效力。
本发明的浓缩液可用作工作稀释液，其中它至少以20∶1(即20份水对1份浓缩液)稀释，得到工作溶液。在本发明的一些实施例中，它可以以更大程度稀释，例如100∶1或1000∶1或更大。然而本文中使用20∶1的稀释度，为了限定。20∶1的工作稀释度比含有相同浓度的相同季铵抗生剂在水中的相应简单溶液构成的对照具有更大的抗生剂效力。另外，该浓缩液的工作稀释不仅在充分量(例如稀释溶液的2％wt)的蛋白质存在下维持保持抗生剂活性，而且惊人的显示比对照明显更大的效力。惊人的是，季铵抗生剂实现的保护水平是储藏稳定的组合物可以含有酶形式的蛋白质。在本发明的优选例中，浓缩液还含有一种或多种酶，同时仍维持浓缩液的储藏稳定性和稀释使用时的酶活性，以及在使用中还具有改善的抗生剂效力。
在该说明书中MIC是在24小时后确定的。优选本发明组合物的MIC小于对应的对照组合物的MIC的75％，更有效小于50％。
根据本发明的第二个方面，提供了一种适合在稀释后使用的储藏稳定的液体消毒剂浓缩液，用于在蛋白质存在下消毒，所述浓缩液含有至少1％wt的季铵抗生剂和选自“酶稳定剂”、“酶稳定系统”、“微胶粒形成改变剂和抑制剂”，及其组合的活性保护剂。
本发明的组合物含有“活性保护剂”，它防止季铵抗生剂的生物效力的丧失。在优选例中“活性保护剂”含有硼化合物，更优选是硼化合物联合二-(丙二醇)甲醚(“DPM”)或其类似物。先前使用硼化合物来保护酶避免不可逆变性，但未用于在蛋白质存在下保护季铵抗生剂的活性。已知DPM用于改变微胶粒形成。相信“活性保护剂”能够相等的利用(1)一种或多种其它组合物，选自已知在液态水溶液中稳定酶的那些组合物，包括酶稳定组合物和系统，(2)所选的“微胶粒抑制剂”，和(1)和(2)的混合物。在本发明的高度优选例中，“活性保护剂”是一种“酶稳定剂”，更优选是合适浓度的硼阴离子。理想的是，它们在多元醇中溶剂化，并可以与酶稳定性增效剂或辅助剂混合。优选“微胶粒抑制剂”包括已知改变和抑制微胶粒形成的物质，并可以选自C1-C6烷醇、C1-C6二醇、C2-C24烷二醇醚、烷二醇烷基醚及其混合物。高度优选的微胶粒抑制剂是二-(丙二醇)甲醚(“DPM”)。
已发现在酶稳定剂中加入DPM协同增强赋予季铵抗生剂的活性保护，而不决定性的损害(如存在)酶活性。
高度优选季铵抗生剂是芳基季铵化合物，优选苯扎卤铵。
熟知酶在储藏中，在其它酶的存在下，和/或在拮抗性离子，例如阴离子表面活性剂、季铵盐化合物和去垢“组分”的存在下变性。开发了许多酶稳定系统，在酶配制领域中是熟知的。“酶稳定系统”的一个例子是硼化合物(例如硼酸)，它过去被单独使用或与所选的其它辅助剂和/或增效剂(例如多官能氨基化合物、抗氧化剂等)一起使用，在储藏和许多产品中保护蛋白水解酶和其它酶。已建立了理论，即硼和钙的酶稳定系统形成分子内键，它与酶分子的活性位点有效交联或固定，从而将其维持在活性的空间构形。酶稳定剂迄今尚未用于保护季铵抗生剂的生物杀伤活性。本发明基于该惊人的发现，即在蛋白质存在下至少一些酶稳定系统有效保护高浓度的季铵抗生剂的生物杀伤活性，并在稀释后释放生物杀伤活性。
根据本发明，优选“活性保护剂”的比例，例如硼对季铵抗生剂的比例，使给定水平的蛋白质存在下，季铵抗生剂的MIC最小化。应理解本发明可用于混合季铵抗生剂和一种或多种酶的组合物。除季铵抗生剂外还存在一种酶，而需要维持酶的酶活性和季铵抗生剂的生物杀伤活性的情况下，则所需的“活性保护剂”的量将比仅需要保护酶更大，并需要足够稳定酶并保护季铵抗生剂的生物杀伤活性。另外，由于预计组合物将与外部的蛋白质负荷(除了酶)接触，则“活性保护剂”浓度将需要更大。
本发明人发现硼惊人的以某种途径保护季铵抗生剂不被蛋白质灭活，其程度是抗生剂的MIC在蛋白质的存在下不增加。在本发明的优选例中，MIC急剧下降，例如，尽管仅存在占溶液重量2％的蛋白质，下降超过一半。这使得能够配制各式各样的新颖有用的组合物，它们在现有技术的效果将显著下降或完全无效的情况下，仍然保持作为消毒剂或抗菌剂的作用。本发明还实现了制备具有更低浓度的季铵抗生剂和更低成本的储藏稳定性液态生物杀伤有效的组合物。
不受理论的限制，本发明人推测聚硼酸离子与阳离子季铵抗生剂结合，从而保护季铵抗生剂不与蛋白质结合。当制剂稀释后，聚合的离子变得不稳定，并释放季铵抗生剂用于消毒。另外，可能季铵抗生剂的生物杀伤活性与灭活细胞膜的蛋白质密切相关，而硼与无活性的蛋白质的带电基团结合，并防止季铵盐在变性无活性的蛋白质上造成浪费。在任何情况下，由于酶与季铵抗生剂结构上非常不一样，而且季铵抗生剂杀伤细菌的整个机制也不确定，因此先前不能预测任何酶稳定剂将有效维持季铵抗生剂(一种酶拮抗剂)的生物杀伤活性。维持季铵抗生剂的活性的机制可能与稳定酶的机制不同。
下文更详细讨论了“活性保护剂”。
根据第三个方面，本发明提供了一种根据第一个方面的组合物，它还含有非离子表面活性剂。
优选非离子表面活性剂是一种表面活性剂或其组合，选自乙氧基化物或丙氧基化物，和它们的嵌段共聚物。
本发明的第四个方面提供了根据上述任何一个方面的组合物，它还含有一种或多种稳定化的酶，其中工作稀释度的抗生剂的MIC不由于还与占稀释的溶液达2wt％的蛋白质等价物混合而减少。
本发明的组合物可用作，例如但不限于用于消毒的表面喷雾或处理，用于清洁医疗/牙科器械和设备，用于掺入布料和海绵等的杀菌清洁制剂，和用于消费品，例如洗碗碟去污剂、家用清洁剂、洗发水、消毒洗衣组合物等。本发明的高度优选例提供了一种经济上有效的清洁和消毒组合物，它含有酶，在浓缩或稀释形式储藏都是稳定的，并且在稀释后在蛋白质存在下仍维持抗生性。
本发明的第五个方面提供了一种在蛋白质存在下生物杀伤有效的消毒剂工作溶液，该溶液含有至少0.5％重量的季铵抗生剂，能用20份水对1份浓缩液稀释，产生稀释的溶液，该稀释溶液在达2％胰蛋白胨(或其蛋白质等价物)存在的情况下，24小时后的MIC比相同浓度的蛋白质存在下，相同浓度的相同季铵抗生剂在水中的简单溶液的MIC要小。
根据第六个方面，本发明提供了一种在蛋白质存在下生物杀伤有效的消毒剂工作溶液，含有至少0.5％wt的季铵抗生剂和选自“酶稳定剂”、“酶稳定系统”、“微胶粒形成改变剂和抑制剂”，及其组合的活性保护剂。
根据第七个方面，本发明提供了一种保护季铵抗生剂不失活的方法，包括步骤将季铵抗生剂与选自酶稳定剂和微胶粒去稳定剂或其组合的“活性保护剂”混合。
根据其它方面，本发明提供了一种保护或改善浓缩溶液中和其工作稀释度下季铵抗生剂在蛋白质存在下的效力的方法，以及清洁蛋白质污染的表面的方法。
进行发明的最佳模式现在更具体的仅用一些实施例举例描述本发明。
实施例1是一种组合物，它是一种储藏稳定的浓缩液，但使用时用水稀释成200∶1-1000∶1(即200或1000份/wt水比1份/wt浓缩液)。稀释的(200∶1)的溶液有效作为表面清洁剂，并在表面上留下消毒剂，它防止在涂用后至少24小时的细菌生长。如果表面用占稀释溶液重量例如2wt％胰蛋白胨或2wt％酵母预处理它也有效。
实施例1
注1Terric GN9是购自ORICA的乙氧化壬基苯酚，是非离子表面活性剂。
制备四硼酸钠在80℃溶于/悬浮于甘油。季铵抗生剂和Terric GN9(非离子消毒剂)与DPM混合，pH用例如乙酸调解到pH7.2-7.3。然后将硼酸/甘油溶液与季铵抗生剂混合。
比较性结果制备了实施例1的制剂和各种含有实施例1成分的亚组的组合物，20∶1稀释并如表1A部分所示进行MIC试验。用还含有如B、C和D部分中列出的各种蛋白质的组合物重复试验。在下面的表1中，用Bailey和Scott DiagnosticMicrobiology，第8版，1990，p.177中所述的测试方法，利用一种对QUAT最具抗性的铜绿假单胞菌ATCC号15442，测量MIC。在表1中“quat.”是苄基二甲基氯化铵季铵抗生剂的缩写。
表1
*表明对照(quat根据现有技术，A单独，B、C、D和蛋白质)表1的A部分比较了各种季铵抗生剂组合物在不存在硼和存在硼(即根据本发明)但没有蛋白质的情况下的MIC。在各种情况下可与对照-“quat”(无硼)比较。
表1A部分显示了Terric GN9如预期的灭活的季铵抗生剂。出乎意料的，DPM增强季铵盐的活性，甚至在存在GN9的情况下，而在与本发明的硼组合的各情况下，与不存在硼和与对照的组合比较，产生生物杀伤效力的显著改进。
表1B部分显示蛋白质(2wt％胰蛋白胨)存在下和硼不存在下，季铵抗生剂的充分失活。失活的程度由于DPM而降低，甚至在非离子表面活性剂GN9的存在下。然而，在各情况中蛋白质存在下加入硼阴离子，至少减少了1/2的MIC。本发明含有硼的组合物具有比对照的含有胰蛋白胨，不含其它添加剂的季铵抗生剂具有低得多的MIC。DPM出乎意料的增强了该作用。
表1的C部分显示了天然蛋白质在发面酵母中的混合物的结果，表1的D部分显示了第三种蛋白质-蛋白裂解性酶枯草杆菌蛋白酶的结果。值得注意的是当DPM与硼混合时，与缺少硼或DPM的组合物相比，总是进一步提高季铵抗生剂(MIC减少)的效力(即DPM与硼的结合协同改进硼的活性保护)。另外该协同作用不论GN9的灭活作用都存在。
实施例2显示了本发明的一个优选例。实施例2的组合物是浓缩液，将以1份/wt比200份/wt水的比例稀释。组合物将用作手术器械的预浸液。
将硼砂和热水和甘油预混合，加到A中，调解pH，使混合物冷却到30℃，然后缓慢加入预混合的成分D。然后加入与苯扎氯铵80％预混合的水。
季铵抗生剂用氯化烷基苄基二甲基铵(也称为苯扎氯铵)作为高度优选的季铵抗生剂示范说明了本发明。然而本领域技术人员将认识到可以使用其它单体季铵盐抗微生物化合物。
优选季铵盐抗微生物化合物选自具有通式 其中R′、R″、R_、R″″是烷基，可以相同或不同，取代或未取代、分支或不分支、环化或不环化。X是任何阴离子，但优选是卤素，更优选是氯或溴。
高度优选的抗微生物化合物是一长链、三短链、四烷基铵化合物，二长链、二短链的四烷基铵化合物及其混合物，其中“长”链意味着约C6-C30烷基，而“短”链意味着C1-C5烷基，优选C1-C3，或苄基，或C1-C3烷基苄基。例子包括一烷基三甲基铵盐，例如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、一烷基二甲基苄基化合物或二烷基苄基化合物。可使用季铵抗生剂，例如葡糖酸洗必太。
本发明所用的最高度优选的化合物具有至少一个苄基，它可以是取代的苄基。例子包括C8-C22二甲基苄基氯化铵、C8-C22二甲基乙基苄基氯化铵和二C6-C20烷基二甲基氯化铵。掺入季铵盐化合物是为了其广谱(革兰氏阳性和革兰氏阴性)抗菌性质，因此必须在不存在蛋白质或其它灭活剂的情况下，以至少对于该目的有效的量存在。惊人的是本发明的组合物在浓缩和稀释形式都具有卓越的储藏稳定性。
活性保护剂根据本发明，季铵抗生剂的生物杀伤活性在使用中被“活性保护剂”保护，该保护剂是一种组合物(一种离子、化合物或其组合)，选自已知的“酶稳定系统”，包括可逆或不可逆酶抑制剂，例如在“酶抑制剂手册”，Zollner，H.第二版，VCH1993中所述的那些。优选的活性保护剂是一种硼化合物或更优选的硼化合物和多元醇的混合物。硼化合物可以是例如硼酸、氧化硼、硼砂或正、偏或焦硼酸钠。在一些配方中，理想的是使用过硼酸盐，例如过硼酸钠来获得漂白效果。最优选的硼来源是四硼酸钠。硼化合物的保护作用可以由甲酸盐或钙离子或多官能氨基化合物，例如二或三乙醇胺的存在加强。其它活性保护增强剂或辅助剂，包括阴离子例如磷酸根、柠檬酸根、硫酸根和多价螯合剂，例如用作水软化剂的，例如EDTA。
多元醇在使用硼稳定酶的系统中，已报道加入抗氧化剂和/或多官能氨基化合物，产生协同酶稳定效应，考虑在该系统中使用酶稳定剂协同剂。本文所用的术语“酶稳定剂系统”指稳定剂和增强剂、辅助剂和/或增效剂等的组合。
多元醇优选是含有2-6个羟基，和仅含C、H和O原子的多元醇。典型的例子是乙二醇、丙二醇、1，2-丙二醇、丁二醇和最优选甘油。其它多元醇，例如甘露醇、山梨醇、赤藓醇、葡萄糖、果糖、乳糖等也可用。选择多元醇溶解硼，并增加组合物中的离子强度，通常以至少与硼化合物相等的量存在。
微胶粒抑制剂理想的是包含水混溶性溶剂，根据组合物的应用辅助溶解组合物接触的成分和/或物质，并避免或抑制或改变微胶粒形成。这协同的起到了“活性保护剂”作用，同时在一些情况下凭本身的能力增强生物杀伤活性。
优选水混溶性溶剂选自C1-C6烷醇、C1-C6二醇、C3-C24烷二醇醚、烷二醇烷基醚及其混合物。高度优选的溶剂是二(丙二醇)甲醚。其它已知的微胶粒拮抗剂包括硼酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐。
酶硼稳定剂的加入量的要求是防止蛋白质存在下酶的失活。惊人的是发现可以在本发明的组合物中含有一种或多种酶，并在组合物中提供足够的硼，来同时防止季铵抗生剂被酶灭活和防止季铵抗生剂被另一种蛋白质(即除了酶以外)灭活，还可以稳定酶不被季铵抗生剂变性。可能季铵(例如与蛋白质)的复合物参与可逆保护酶。酶可以是例如蛋白水解酶，或选自碳水化合物酶、酯酶、水化酶、淀粉酶、蛋白酶、过氧化氢酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、转化酶等，及其混合物。蛋白酶的使用是优选的，而枯草杆菌蛋白酶是高度优选的。
表面活性剂在本发明的优选例中存在表面活性剂。表面活性剂是一种非离子表面活性剂，它是高度优选的，选自烷氧化醇或烷氧化苯酚醚。其它半极性非离子物质，例如三烷基氧化胺也是有用的。烷氧化苯酚醚的例子包括具有不同程度烷氧基化的辛基或壬基苯酚。优选每摩尔苯酚6-10摩尔的环氧乙烷。烷基可以从C6-C16变动。最优选的是低级烷氧化的非离子表面活性剂，每个分子具有6-25摩尔的环氧乙烷和/或环氧丙烷。
烷氧化醇包括乙氧基化的和丙氧基化的C6-C16醇，每摩尔醇分别具有约2-10摩尔环氧乙烷，或1-10和1-10摩尔环氧乙烷和环氧丙烷。
如果使用氧化胺，这些可以是一长链，二短链的三氨基氧化胺，可以是乙氧基化或丙氧基化的。一个例子是十二烷基氧化胺，或椰油酰氨基丙基二甲基氧化胺。
选择表面活性剂的数量，提供足够去污的消毒性，并通常在0.05％-10％浓缩液的范围内，更优选约0.5％-6％，最优选是2％-4％。
当以低水平使用时，甚至对于接触食物的表面，也不需要漂洗掉一些单体季铵抗生剂的事实提供了一个机会，配制一步清洁剂/消毒剂，用于被蛋白质污染物污染的食物接触表面。
本发明在本文中被描述成特别针对作为“活性保护剂”的硼。可能不是所有的酶稳定剂系统都可有效作为季铵抗生剂的活性保护剂，但是可以用基于本文的指导的常规筛选确定是否有效。本发明可以通过许多形式实现，这些形式是产品配制领域的技术人员基于本文所含的指导应明白的。
附录1TGA消毒试验该试验方法是在作者和出版商的慷慨同意下，从在“Australian Journal ofHospital Pharmacy”，Vol.8，No.4；1978(152-155)中出版的原始论文中复制的。
1.原理用于医院级去污剂或消毒剂的方法主要是由Kelsey和Maurer(1)提供的，用于测试消毒剂性能。它的形式适合与调整的消毒剂和防腐剂的最低标准结合。该试验的更广泛应用参见补充的注释A。
以厂商在产品标签上推荐的稀释度测试消毒剂。测试包括用细菌接种物攻击稀释的消毒剂，在给定的时间收集样品，并在合适的恢复培养基中培养样品。在取样后，用第二种接种物再攻击混合物，然后在第二个时间间隔后再取样培养。根据两种取样的培养物中所示的生长程度，样品通过或不通过。该测试加入或不加入灭菌酵母，作为有机污染物(分别选择B和A)或两者进行，根据测试的产品标签上提出的使用状况。
表1.用TGA消毒试验对消毒剂和防腐剂的试验参数的选择
对于家用级消毒剂，列出的第一种生物和第二次攻击可以省略，同时选择任选条件C(营养肉汤)作为所选的模拟污染物。对于防腐剂，再次省略第二次攻击，同时选择任选条件D(血清)作为所选的污染物。
2.培养基所有培养基必须装在密封的玻璃容器中。当储藏培养基时，容器必须密封或冷藏。
2.1无菌硬水2.1.1将0.304g无水氯化钙和0.065g无水氯化镁溶于玻璃蒸馏的水，加到1升。
2.1.2分装到玻璃容器中，并在121℃±1℃高压灭菌15分钟。
2.2酵母悬液2.2.1称出200g含水压缩的发面酵母。逐渐加入无菌硬水呈奶油状，同时用重玻璃杆搅拌。将呈乳膏状的部分倒入烧瓶，对于成块的剩余物加入更多水，并重复起乳状和倾析步骤，直到无剩余物，使用了500mL水。
2.2.2剧烈振摇烧瓶的内容物，用100-目筛过筛，使剩余的任何小块破碎。
2.2.3加入500mL无菌硬水，剧烈振摇并用1N氢氧化钠将pH调至6.9-7.1。
2.2.4将50ml、100mL、200mL酵母溶液转移到带有螺旋帽的瓶中。
2.2.5 121℃±1℃高压灭菌15分钟，使高压灭菌锅冷却，不释放压力。冷藏但不冰冻。
2.2.6将两只培养皿干燥至恒重。在各皿中用滴管加入25mL无菌酵母悬液，100℃干燥至恒重。计算悬液的平均固体含量。
2.2.7使用前，在烧杯中滴加25mL无菌酵母悬液。用玻璃电极测定pH，并确定将pH调至6.9-7.1所需的1N氢氧化钠的体积。
2.2.8在使用前，立即在每个无菌酵母瓶中加入一定体积的无菌硬水，和一定体积的1N氢氧化钠，计算将干酵母调节到5.0％的浓度，将pH调节到6.9-7.1范围。丢弃制备3个月后的酵母。
2.3试验菌生长的培养基2.3.1在蒸馏水中制备10％w/v的葡萄糖溶液，121℃±1℃高压灭菌15分钟。冷却至室温。
2.3.2根据作者的方法(2)或用相同组分(注B)的商品制备Wright and Mundy培养基，121℃±1℃高压灭菌15分钟。冷却至室温。
2.3.3在2.3.2中制备的每升Wright and Mundy培养基中加入2.3.1中制备的10mL无菌葡萄糖溶液。
2.3.4如优选的那样，以10mL或15ml量无菌分装。
2.3.5该培养基被称作Wright and Mundy葡萄糖培养基。
2.4恢复培养基2.4.1如下或从同样组分(注B)的商品制备营养肉汤将下列成分加到970mL水中并加热溶解牛肉提取物粉末 10g蛋白胨 10g氯化钠 5g用1N氢氧化钠将pH调节到8.0-8.4。
煮沸10分钟并过滤，冷却。
2.4.2在2.4.1制备的每升营养肉汤中加入30g聚山梨酸酯80(注B)。
2.4.3用1N氢氧化钠将pH调至7.2-7.4。
2.4.4 121℃±1℃高压灭菌15分钟，立即充分振摇，分散聚山梨酸酯80。
2.4.5将10mL量无菌分散到无菌密封玻璃试管中。
3试验接种3.1试验菌使用下列4种菌，除非特别指定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) NCTC 6749普通变形菌(Proteus vulgaris) NCTC 4635大肠杆菌 NCTC 8196金黄色葡萄球菌NCTC 41633.2接种制备3.2.1在Wright and Mundy葡萄糖培养基中，37℃±1℃培养一安瓿冻干培养物的内容物过夜。
3.2.2将培养的培养物接种到Mc-Cartney瓶的营养琼脂斜面上。4℃±1℃储藏3个月。
3.2.3在进行测试前合适的时间，从琼脂斜面移种到10mL或15mL的Wrightand Mundy葡萄糖培养基中传代培养。37±1℃培养24±2小时。
3.2.4用直径4mm的接种环从3.2.3的培养基移种到新鲜培养基中传代培养。37±1℃培养24±2小时。
3.2.5每天重复步骤3.2.4。对于测试过程，仅使用传代培养至少5次，但不多于14次的培养物。
3.2.6将铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的测试培养物滤过无菌Whatmans4号滤纸。
3.2.7离心所有的测试培养物直到细胞紧密，用巴斯德滴管移去上清液。
3.2.8将测试菌重新悬浮在原始体积的液体(即10mL或15mL)中，并用一些无菌玻璃珠振摇1分钟。
3.2.8.1对于任选条件A，重悬浮在无菌硬水中。
3.2.8.2对于任选条件B，重悬浮在4份酵母悬液(如在2.2中制备的)比6份无菌硬水的混合物中。
3.2.8.3对于任选条件C，重悬浮在营养肉汤(如在2.4.1和2.4.3中制备的，高压灭菌)3.2.8.4对于任选条件D，重悬浮在无菌硬水中；在无菌硬水中稀释两次1+9，然后将8mL最后的稀释液中加入先前在56℃灭活20分钟的2mL绵羊血清中，并过滤灭菌。
3.3接种计数在测试前立即对重悬浮的接种物取样，并通过在1/4强度的Ringer’s溶液中10倍稀释和注皿技术计数。随后计算的数量必须代表每毫升不少于2×108，或不大于2×109菌(或用任选条件D1×108-1×107)，否则认为该试验无效。保留含有10-7稀释的试管用作对照(7.3和7.4)。
4.消毒剂稀释用无菌硬水作为稀释剂将消毒剂样品定量稀释到指定程度。使用不少于10ml或10g样品用于第一次稀释，不少于1mL的任何稀释液用于制备随后的稀释。在试验日将所有稀释液置于玻璃容器中。玻璃容器必须用玻璃蒸馏的水漂洗两次并灭菌过。
5.温度当空调不能将试验溶液维持在21±1℃时，将要进行试验的容器置于该温度下的水浴中。
6.试验方法用4种试验菌(3.1)的各一种进行下列试验，除了另外指出的标准外不需要同时测试所有微生物。
6.1将3mL稀释的消毒剂倒入密封玻璃容器。
6.2启动计时装置。立即将消毒剂与1mL培养物(3.2中制备的)混合，并漩涡混合。
6.3在8分钟时，在含有恢复肉汤的5根试管中的每一根中移种1滴(0.02mL±0.002mL)。为了确保在恰好8分钟时将0.02mL传递到第一根恢复肉汤试管中，必须预先吸取合适量的消毒剂测试混合物。这必须立即先进行漩涡。剩余的样品应返回到试验混合物中(见注D)。
6.4除了指定的，在10分钟时将消毒剂与另外1mL培养物一起培养，并漩涡混合。
6.5除了指定的，在18分钟，如6.3进行。
6.6将所有恢复肉汤的试管的内容物通过漩涡混合。37±1℃培养48±2小时。
6.7测试生长并记录结果。
6.8对于每种试验菌，用新鲜消毒剂稀释液和新鲜制备的细菌悬液在每两天重复步骤6.1-6.7。
7.对照7.1恢复肉汤污染37±1℃培养一根未接种试管的恢复肉汤48±2小时，并检测生长。如果发生生长，认为试验由于恢复肉汤的污染而无效。
7.2消毒剂污染在1试管恢复肉汤中加入0.02mL稀释的消毒剂。37±1℃培养48±2小时。如果出现生长，认为该试验无效。7.2中生长而7.1中未生长表明消毒剂测试溶液的污染。
7.3繁殖力测试在1试管恢复肉汤中加入3.3中保留的1.0ml 10-7稀释液。37±1℃培养48±2小时，检测生长。如果未出现生长，认为该试验无效。
7.4灭活剂效力在1试管恢复肉汤中，加入0.02mL稀释的消毒剂和1.0mL 3.3中保留的10-7稀释液。37±1℃培养48±2小时，检测生长。如果未出现生长，认为该试验是无效的。7.3中生长而7.4中不生长表明消毒剂被不适当灭活。
8.无效对照情况下的过程当任何对照使试验无效时，必须重复试验。如果生长在对照7.1中出现，或在对照7.3或7.4中不出现生长，必须用新鲜的恢复肉汤。
如果对照7.2在两种情况时都表明消毒剂污染，认为该消毒剂未通过试验。如果对照7.4在两种情况时都表明不适当灭活，认为试验无效(注C)。
9.结果如果在5个6.3中说明的恢复肉汤中至少有2个没有明显生长，而且在6.5中说明的3种情况时的5个恢复肉汤中至少有2个没有明显生长，使用4种微生物，那么稀释测试通过测试。
10.参考文献(1)Kelsey，J.C.和Maurer Isobel，M.Pharmaceutical Journal(UK)213528-530(1974)。
(2)Wright Eleanore，S.和Mundy，R.A.Journal of Bacteriology 80279-280，(1960)11.补充说明A.为了调查、发展或比较目的，增加第三次攻击，从而进行真实的能力试验，测试在预定的稀释度以上和以下的稀释度是有用的。在这些情况下，应该仔细考虑Kelsey&Maurer关于计时和组织试验的推荐。对于常规测试批量产品可以考虑简化试验。
B.Wright and Mundy培养基是作为“Bacto合成肉汤”，A.O.A.C.编号0352(Difco，Ltd.)购得的。所用的营养肉汤是作为“营养肉汤-2号”(Oxford，Ltd.)购得的。
C.当表明不适当灭活时，应进行调查找到有效的灭活剂。参见Mackinnon，I.H.J.Hyg.(London)73189-195(1974)。
D.推荐具有一次性塑料吸头的Oxford P-7000采样系统，用于回收样品用于传代培养。
附录2可接受的常用名
权利要求
1.一种储藏稳定的液体消毒剂浓缩液组合物，其特征在于，该组合物含有至少1％重量的季铵抗生剂，并能用20份水比1份浓缩液稀释，产生稀释溶液，该稀释溶液在达2％胰蛋白胨或其蛋白质等价物存在的情况下，24小时后的最小抑制浓度比相同浓度的蛋白质存在下，相同浓度的相同季铵抗生剂在水中的简单溶液的最小抑制浓度要小。
2.一种适用于稀释后在蛋白质存在下消毒的储藏稳定的液体消毒剂浓缩液，其特征在于，所述浓缩液含有至少1％重量的季铵抗生剂，和活性保护剂，所述活性保护剂选自“酶稳定剂”、“酶稳定系统”、“微胶粒形成改变剂和抑制剂”，及其组合。
3.如权利要求2所述的浓缩液，其特征在于，该浓缩液能用20份水比1份浓缩液稀释，产生稀释溶液，该稀释溶液在达2％胰蛋白胨或其蛋白质等价物存在的情况下，24小时后的最小抑制浓度比相同浓度的蛋白质存在下，相同浓度的相同季铵抗生剂在水中的简单溶液的最小抑制浓度要小。
4.如权利要求1或2所述的浓缩液，其特征在于，所述季铵抗生剂是单体季铵抗菌剂。
5.如前述任一权利要求所述的浓缩液，其特征在于，季铵抗生剂的生物杀伤效力被活性保护剂保护，所述活性保护剂选自硼化合物、多元醇、甲酸酯、钙离子、多官能氨基化合物、磷酸盐、柠檬酸盐、硫酸盐和多价螯合剂。
6.如前述任一权利要求所述的浓缩液，其特征在于，所述浓缩液含有微胶粒不混溶溶剂。
7.如前述任一权利要求所述的浓缩液，其特征在于，所述微胶粒不混溶性溶剂选自C1-C6烷醇、C1-C6二醇、C3-C24烷二醇醚、烷二醇烷基醚、硼酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐及其混合物。
8.如前述任一权利要求所述的液体消毒剂浓缩液，其特征在于，所述浓缩液在18-25℃储藏于密封容器中12个月后仍保留至少75％的生物杀伤效力。
9.如权利要求1或2所述的液体消毒剂浓缩液，其特征在于，所述浓缩液在18-25℃储藏于密封容器中12个月后仍保留至少90％的生物杀伤效力。
10.如前述任一权利要求所述的浓缩液，其特征在于，该浓缩液含有至少10％重量的季铵抗生剂。
11.如前述任一权利要求所述的浓缩液，其特征在于，该浓缩液含有至少25％重量的季铵抗生剂。
12.如前述任一权利要求所述的浓缩液，其特征在于，该组合物当用20份水比1份浓缩液稀释时，稀释溶液在达2％胰蛋白胨或其蛋白质等价物存在的情况下，24小时后的最小抑制浓度是相同浓度的蛋白质存在下，相同浓度的相同季铵抗生剂在水中的简单溶液的最小抑制浓度的50％以下。
13.如前述任一权利要求所述的浓缩液，其特征在于，该组合物当用20份水比1份浓缩液稀释时，稀释溶液在达2％胰蛋白胨或其蛋白质等价物存在的情况下，24小时后的最小抑制浓度是相同浓度的蛋白质存在下，相同浓度的相同季铵抗生剂在水中的简单溶液的最小抑制浓度的40％以下。
14.如前述任一权利要求所述的浓缩液，其特征在于，该浓缩液还含有至少一种酶。
15.如前述任一权利要求所述的浓缩液，其特征在于，该浓缩液还含有至少一种非离子表面活性剂。
16.如前述任一权利要求所述的浓缩液，其特征在于，所述季铵抗生剂是单体季铵抗微生物化合物，具有通式 其中R′、R″、R_、R″″是烷基，可以相同或不同，取代或未取代、分支或不分支、环化或不环化，X是任何阴离子。
17.如前述权利要求所述的浓缩液，其特征在于，X是氯、或溴。
18.如前述权利要求任一所述的浓缩液，其特征在于，季铵抗生剂选自一长链、三短链、四烷基铵化合物；二长链、二短链的四烷基铵化合物及其混合物。
19.如前述权利要求所述的浓缩液，其特征在于，季铵抗生剂选自一烷基三甲基铵盐、一烷基二甲基苄基化合物、二烷基苄基化合物和葡糖酸洗必太。
20.如前述权利要求任一所述的浓缩液，其特征在于，所述抗生剂选自C8-C22二甲基苄基氯化铵、C8-C22二甲基乙基苄基氯化铵和二C6-C20烷基二甲基氯化铵。
21.如前述权利要求任一所述的浓缩液，其特征在于，所述季铵抗生剂是苄基二甲基卤化铵。
22.如前述的权利要求所述的浓缩液，其特征在于，所述稳定剂选自硼酸、氧化硼、硼砂、或正、偏或焦硼酸钠、过硼酸盐。
23.如前述的权利要求所述的浓缩液，其特征在于，所述稳定剂包括四硼酸钠。
24.如前述权利要求任一所述的浓缩液，其特征在于，所述季铵抗生剂的生物杀伤效力由硼化合物保护，还含有具有2-6个羟基的多元醇。
25.如前述的权利要求所述的浓缩液，其特征在于，所述多元醇选自乙二醇、丙二醇、1，2-丙二醇、丁二醇，最优选甘油、甘露醇、山梨醇、赤藓醇、葡萄糖、果糖和乳糖。
26.如权利要求24所述的浓缩液，其特征在于，所述溶剂包括二(丙二醇)甲醚。
27.如前述的权利要求任一所述的浓缩液，其特征在于，该浓缩液含有选自非离子表面活性剂和半极性非离子表面活性剂的表面活性剂。
28.如权利要求27所述的浓缩液，其特征在于，所述表面活性剂选自烷氧化醇、烷氧化苯酚醚和三烷基氧化胺。
29.如前述的权利要求任一所述的浓缩液，其特征在于，所述浓缩液含有乙氧化壬基苯酚。
30.用200份以上的水比1份浓缩液稀释后的如前述的权利要求任一所述的浓缩液。
31.用1000份以上的水比1份浓缩液稀释后的如前述的权利要求任一所述的浓缩液。
32.一种在蛋白质存在下生物杀伤有效的消毒剂工作溶液，其特征在于，所述溶液含有至少0.5％重量的季铵抗生剂，并能用20份水比1份浓缩液稀释，产生稀释溶液，该稀释溶液在达2％胰蛋白胨或其蛋白质等价物存在的情况下，24小时后的最小抑制浓度比相同浓度的蛋白质存在下，相同浓度的相同季铵抗生剂在水中的简单溶液的最小抑制浓度要小。
33.一种在蛋白质存在下生物杀伤有效的消毒剂工作溶液，其特征在于，该工作溶液含有至少0.5％重量的季铵抗生剂，和活性保护剂，所述活性保护剂选自“酶稳定剂”、“酶稳定系统”、“微胶粒形成改变剂和抑制剂”，及其组合。
34.如权利要求32或33所述的溶液，其特征在于，所述季铵抗生剂是单体季铵抗菌剂。
35.如权利要求32-34任一所述的溶液，其特征在于，季铵抗生剂的生物杀伤效力被一种或多种酶稳定剂和酶稳定增强剂保护，所述酶稳定剂和酶稳定剂增强剂选自硼化合物、多元醇、甲酸酯、钙离子、多官能氨基化合物、磷酸盐、柠檬酸盐、硫酸盐和多价螯合剂。
36.如权利要求32-35任一所述的溶液，其特征在于，所述溶液含有微胶粒不混溶溶剂。
37.如权利要求32-36任一所述的溶液，其特征在于，所述微胶粒不混溶性溶剂选自C1-C6烷醇、C1-C6二醇、C3-C24烷二醇醚、烷二醇烷基醚、硼酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐及其混合物。
38.如权利要求32-37任一所述的溶液，其特征在于，该溶液含有至少1.5％重量的季铵抗生剂。
39.如权利要求32-38任一所述的溶液，其特征在于，该溶液含有至少2.5％重量的季铵抗生剂。
40.如权利要求32-39任一所述的溶液，其特征在于，该溶液在达2％胰蛋白胨或其蛋白质等价物存在的情况下，24小时后的最小抑制浓度是相同浓度的蛋白质存在下，相同浓度的相同季铵抗生剂在水中的简单溶液的最小抑制浓度的50％以下。
41.如权利要求32-40任一所述的溶液，其特征在于，该溶液在达2％胰蛋白胨或其蛋白质等价物存在的情况下，24小时后的最小抑制浓度是相同浓度的蛋白质存在下，相同浓度的相同季铵抗生剂在水中的简单溶液的最小抑制浓度的40％以下。
42.如权利要求32-41任一所述的溶液，其特征在于，该溶液还含有至少一种酶。
43.如权利要求32-42任一所述的溶液，其特征在于，该溶液还含有至少一种非离子表面活性剂。
44.如权利要求32-43任一所述的溶液，其特征在于，所述季铵抗生剂是单体季铵抗微生物化合物，具有通式 其中R′、R″、R_、R″″是烷基，可以相同或不同，取代或未取代、分支或不分支、环化或不环化，X是任何阴离子。
45.如权利要求32-44任一所述的溶液，其特征在于，X是氯、或溴。
46.如权利要求32-45任一所述的溶液，其特征在于，季铵抗生剂选自一长链、三短链、四烷基铵化合物；二长链、二短链的四烷基铵化合物及其混合物。
47.如权利要求32-46任一所述的溶液，其特征在于，季铵抗生剂选自一烷基三甲基铵盐、一烷基二甲基苄基化合物、二烷基苄基化合物和葡糖酸洗必太。
48.如权利要求32-47任一所述的溶液，其特征在于，所述抗生剂选自C8-C22二甲基苄基氯化铵、C8-C22二甲基乙基苄基氯化铵和二C6-C20烷基二甲基氯化铵。
49.如权利要求32-48任一所述的溶液，其特征在于，所述季铵抗生剂是苄基二甲基卤化铵。
50.如权利要求32-49任一所述的溶液，其特征在于，所述稳定剂选自硼酸、氧化硼、硼砂、或正、偏或焦硼酸钠、过硼酸盐。
51.如权利要求32-50任一所述的溶液，其特征在于，所述稳定剂包括四硼酸钠。
52.如权利要求32-51任一所述的溶液，其特征在于，所述季铵抗生剂的生物杀伤效力由硼化合物保护，还含有具有2-6个羟基的多元醇。
53.如权利要求32-52任一所述的溶液，其特征在于，所述多元醇选自乙二醇、丙二醇、1，2-丙二醇、丁二醇，最优选甘油、甘露醇、山梨醇、赤藓醇、葡萄糖、果糖和乳糖。
54.如权利要求53所述的溶液，其特征在于，所述溶剂含有二(丙二醇)甲醚。
55.如权利要求32-54任一所述的溶液，其特征在于，该溶液含有选自非离子表面活性剂和半极性非离子表面活性剂的表面活性剂。
56.如权利要求55所述的溶液，其特征在于，所述表面活性剂选自烷氧化醇、烷氧化苯酚醚和三烷基氧化胺。
57.如权利要求32-56任一所述的溶液，其特征在于，所述溶液含有乙氧化壬基苯酚。
58.一种保护季铵抗生剂不失活的方法，其特征在于，该方法包括将季铵抗生剂与“活性保护剂”混合，所述活性保护剂选自酶稳定剂和微胶粒去稳定剂或其组合。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述活性保护剂是一种或多种选自硼化合物、多元醇、甲酸酯、钙离子、多官能氨基化合物、磷酸盐、柠檬酸盐、硫酸盐和多价螯合剂的物质。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述活性保护剂是一种或多种物质选自硼酸、氧化硼、硼砂或或正、偏或焦硼酸钠、过硼酸盐。
61.如前述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述活性保护剂包括四硼酸钠。
62.一种消毒表面的方法，其特征在于，该方法包括用水稀释权利要求1-27任一所述的浓缩液，在表面上施用稀释的浓缩液一段有效的时间。
63.一种消毒表面的方法，其特征在于，该方法包括在表面上施用权利要求32-60任一所述的溶液一段有效的时间。
64.一种主要根据本文实施例1或实施例2所述的消毒剂。
全文摘要
本发明涉及一种储藏稳定的液体消毒剂浓缩组合物，它含有至少1％重量的季铵抗生剂(生物活性的季铵化合物)，并能用20份水比1份浓缩液稀释，产生稀释溶液，该稀释溶液在达2％胰蛋白胨(或其蛋白质等价物)存在的情况下，24小时后的MIC比相同浓度的蛋白质存在下，相同浓度的相同季铵抗生剂在水中的简单溶液的MIC要小。季铵抗生剂的生物杀伤效力可以通过“活性保护剂”保护，其选自“酶稳定剂”、“酶稳定系统”、微胶粒形成改变剂和抑制剂，及其组合。本发明还涉及用浓缩液制备的消毒液工作溶液和防止季铵抗生剂失活的方法。
文档编号A01N25/00GK1441636SQ01807714
公开日2003年9月10日 申请日期2001年4月5日 优先权日2000年4月7日
发明者A·萨瓦, S·克里兹尔 申请人:新药研究(澳大利亚)有限公司