专利名称：利用交变脉冲电泳进行植物种子转基因的方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，特别是涉及生物工程中采用脉冲电场电泳的植物转基因方法。
背景技术：
1984年美国《细胞》杂志(Cell，37，67，1984)介绍了司可瓦兹(D.Schwartz)和堪特尔(C.Cantor)所发明的一种从细胞中分离大分子量DNA的交变脉冲电泳(又称脉冲场电泳Pulsed Field GeI Electrophoresis)技术。据卢圣栋主编的《现代分子生物学实验技术》(高等教育出版社，1993)第84-86页介绍，该方法采用每隔一定时间(1sec-5min)改变电流方向的脉冲场(Pulsed Field)，使大片段的DNA分子能在交替变向(变向角度600-90°-120°)的电场下在狭小曲折的凝胶孔道中蛇似地穿行而不断向前移动。目前仅见其被用于生物化学实验中分离大片段的DNA分子。至今未见其被用于转基因技术。迄今为止，用于植物转基因的仅是单方向的、非交变的脉冲电场。
我国《植物学报》(11825-832，1991)首次报道了杨金水等利用脉冲电场对水稻的小细胞团进行转基因。该方法先对水稻进行小细胞团悬浮培养，然后部分地酶解它的细胞壁，释放出10％的原生质体(没有细胞壁的细胞)，最后进行转基因。
美国《转基因研究》(Transgenic Research，2245-251，1993.)和中国科学(B辑)(Vol.25，No.3，295-301，1995)分别报道了杨金水等改用水稻胚性愈伤组织进行转基因的方法，该方法在诱导培养基上诱发愈伤组织，经2-3周的继代培养后，经过部分酶解，使10％的细胞释放出原生质体，放入低压脉冲装置中进行低压脉冲电泳。
上述脉冲电场转基因技术存在的问题是(1)所用的脉冲电场是单一方向的电场，DNA分子只能在一个方向上直线地运动，对细胞膜缺乏穿透力。转基因效率低。
(2)在进行脉冲电场处理前，植物细胞必须先培养出小细胞团或娇嫩的愈伤组织，然后经过酶解细胞壁，释放出10％的没有细胞壁的原生质体，才能转基因。手续繁杂，费时，而且往往损伤细胞，生存率只能达到50％左右。
(3)由于手续繁杂，每次进行转基因的只能是少量愈伤组织(每一块愈伤组织只相当于一粒种子)。
(4)因为DNA分子本身没有穿透力，只能依靠脉冲电流在细胞膜上穿孔。《生物技术学》(Biotechnol，44(1-3)7634-7638，1996)认为，该方法所用电压较低，在这样的电压下不足以使细胞膜发生变形或产生小孔。
对于上述这种脉冲电场的转基因能力，在理论上缺乏解释，使人产生怀疑，因此至今未能被广泛地接受。
本发明利用交变脉冲电泳进行植物种子转基因的方法，其特征在于包括以下步骤1、制备转基因样品以琼脂糖胶为基质，制备种子包埋胶与电泳支持胶，琼脂糖浓度视所转移的DNA分子量的大小确定①制备种子包埋胶种子在包埋前进行消毒、浸种处理；将分析纯的低熔点(LMP)琼脂糖(Agarose，Low Melting Point，AnalyticaI Grade，熔点是64℃，凝胶化温度是25℃)熔化，在胶液冷却到30℃(±5℃)时把种子悬浮其中，然后冷却凝结；包埋胶块的大小为支持胶的1/3，厚度为支持胶厚度的1/2；②制备电泳支持胶用一般的琼脂糖制作与包埋胶同样浓度的电泳支持胶；将熔化的支持胶倒入电泳槽内，待其冷却凝结后(25℃-0℃)，在中央位置用消毒手术刀片挖一能容纳包埋胶的凹槽(槽底不可挖穿)，然后用LMP琼脂糖胶液把制备好的含有种子的包埋胶块封固在凹槽中；封固时凹槽底面必须灌胶，不可留有空隙或气泡；2、将要转移的外源DNA样品放在位于电泳起始位置的点样长槽中；DNA溶液中混有电泳指示剂；3、试验确定交变脉冲电场强度；一般采用7V(±3V)/cm，也可根据具体情况采用其他电场强度；4、试验确定交变脉冲转换间隔时间；一般采用以秒为单位，也可以根据具体情况采用其他间隔时间；5、以上述试验确定的交变脉冲电场强度和转换间隔时间按常规进行交变脉冲电泳，至电泳指示剂越过样品包埋胶为止；6、电泳完毕后，除去种子外面的包埋胶。
本发明首次把交变脉冲电泳技术转化为用于植物种子的交变脉冲电泳转基因技术。它与现有脉冲电场转基因方法的最大的不同是它的脉冲电场是交变的，在不同瞬间进行一定角度的变动。因而解决了以下几个技术问题，并具有显著效果1.由于本发明使用交变脉冲电场对植物种子进行转基因，在频繁的脉冲电流方向的变换下，细胞膜将变形及产生小孔。这不仅为基因进入细胞提供了可能，而且大大地提高了转基因的效率。
2.交变脉冲电场可使DNA分子在前进中作蛇行运动，大大提高了被转移的DNA分子的长度。在单一方向的脉冲电场中，被转移的DNA分子只能有10Kb左右(王蓓，杨金水等，低压脉冲电泳介导的水稻转基因植株再生，中国科学(B辑)，Vol.25，No.3，295-301，1995。)，而在交变脉冲电场中被转移的DNA可高达5000Kb。这使转移大片段的基因成为可能，极大地扩大了转基因的范围。
3.植物的细胞壁是多层的纤维构成，上面的孔隙错综重叠，直线运动的DNA分子很难通过。但在交变脉冲电场中作蛇似穿行运动的DNA分子能够很容易地穿过植物的细胞壁的弯曲孔道，省却了必须酶解细胞壁(产生原生质体)的麻烦。酶解细胞壁往往损伤细胞，降低转基因后的生存率；而交变脉冲电泳转基因是一种对细胞无损伤的转基因技术。这一点是目前流行的转基因技术(如显微注射、基因枪等)很难作到的。
4.因为省却了必须酶解植物细胞壁(产主原生质体)的麻烦，就可以直接地在交变脉冲电场中批量地、无损伤地处理完整的植物种子。这是目前使用的单向脉冲电场技术以及显微注射、基因枪等所无法做到的。
5.本发明使用低熔点包埋胶与高熔点支持胶相结合的电泳支持胶用分析纯的低熔点琼脂糖胶把转基因受体的种子包埋起来，并置于一般琼脂糖的电泳支持胶内；低熔点包埋胶与普通支持胶的结合使用，既可使种子在包埋时不因温度过高受损，又能防止电泳中凝胶的软化变形，保证了对种子转基因的顺利进行。用一般的琼脂糖作支持胶是因为它的熔点高(85℃-90℃)，能经受住并能适当地消散电泳中所产生的热量，起到保护包埋胶的作用。
采用本发明方法可在常温、常压及低电压的状态下，直接地、无损伤地对完整的、批量的植物种子进行交变脉冲电泳转基因。
具体实施例方式实施例1、
使用江苏兴化市分析仪器厂生产的DY-4A型交变脉冲电泳仪，以高产优质的玉米品种——A98130的种子为转基因受体，进行玉米种子转基因。
制备外源DNA样品取质粒pWYX(9.0Kb，含有Bar基因及B.t基因)溶于TE缓冲液中，浓度为300μg/ml，DNA溶液中混有20％的溴酚蓝(也可采用其他的电泳指示剂)。
(1)选取成熟饱满的玉米种子，在0.01-0.1％的HgCl2中消毒15分钟，经灭菌水彻底冲洗干净待用；(2)在交变脉冲电泳槽中灌制1.5％的琼脂糖支持胶；然后将含有100粒玉米种子的包埋胶块(LMP琼脂糖胶，1.5％)置于支持胶中；(3)取质粒pWYX溶液50μl加入点样槽中，电泳缓冲液0.5×TBE(pH8)；(4)电泳的行程以溴酚蓝为标记，经试验确定采用脉冲间隔2sec、电压6V/cm(也可根据所用种子的大小或种皮厚薄选用合适的其他电压)进行电泳，至DNA样品扫过种子包埋块；(5)同时设置不走电泳的质粒pWYX溶液与种子混合的处理为对照。
(6)利用除草剂(PPT)对转基因植株的筛选pWYX同时含有抗除草剂基因(Bar)及抗虫基因(B.t)，因此可以利用Bar基因作为筛选的标记基因。具体做法①转化一代筛选转基因植株苗长至3-4叶时，用PPT溶液进行除草剂抗性初步筛选。②转化二代筛选转基因后的种子播种，开花后进行严格自交的人工授粉，单株收获种子，待种子萌发后长至3-4叶时，喷施PPT筛选。
(7)对筛选出的抗性植株的基因组DNA，以质粒pWYX为正对照，以Bar基因引物及B.t基因引物进行PCR分析，来检测这两个基因是否已成功地转入玉米基因组中。
检测Bar基因引物上链5＇-GGATCCATTAGCCCAGAA-3＇/下链5＇-TCGGATCTCGGTGACGGCA-3＇检测B.t基因引物上链5＇-AGTCCAGCTGCCAGAAACC-3＇/下链5＇-CAATCAGCCTAGTAAGGTCG-3＇两引物间DNA片段长度为300bp；于Hema480C PCR扩增仪上进行扩增①94℃，5分钟，②30个循环94℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，1分钟③72℃10分钟。反应结束后，扩增产物于1.4％agrose凝胶上电泳。扩增结果表明经除草剂筛选的抗性植株基因组中含有Bar基因与B.t基因。
(8)对转基因植株进行Southern分子杂交证明Bar基因和B.t基因已整合到玉米基因组中。
我们在实验室经过了长达两年的实施，成功地将外源抗虫基因(B.t)和抗除草剂基因(Bar)转入玉米成熟种子，并经PCR分析及southern分子杂交，证明Bar基因和B.t基因已经成功地整合到玉米的基因组中。经过除草剂(PPT)处理，证明Bar基因已在F2中成功表达。
权利要求
1.一种利用交变脉冲电泳进行植物种子转基因的方法，其特征在于包括以下步骤将分析纯的低熔点琼脂糖熔化，在胶液冷却到30℃(±5℃)时把包埋前进行消毒、浸种处理的种子悬浮其中，然后冷却凝结；包埋胶块的大小为支持胶的1/3，厚度为支持胶厚度的1/2；用一般的琼脂糖制作与包埋胶同样浓度的电泳支持胶；将熔化的支持胶倒入电泳槽内，待其冷却凝结后(25℃-0℃)，在中央位置挖一能容纳包埋胶的凹槽，然后用分析纯的低熔点琼脂糖胶液把制备好的含有种子的包埋胶块封固在凹槽中；将要转移的外源DNA样品放在位于电泳起始位置的点样长槽中；以试验确定的交变脉冲电场强度和转换间隔时间进行交变脉冲电泳，至电泳指示剂越过样品包埋胶；最后除去种子外面的包埋胶。
全文摘要
本发明利用交变脉冲电泳进行植物种子转基因的方法，特征是用一般的琼脂糖制作与包埋胶同样浓度的电泳支持胶；将熔化的支持胶倒入电泳槽内，待其冷却凝结后，在中央位置挖一能容纳包埋胶的凹槽，然后用分析纯的低熔点琼脂糖胶液把制备好的含有种子的包埋胶块封固在凹槽中；将要转移的外源DNA样品放在位于电泳起始位置的点样长槽中；以试验确定的交变脉冲电场强度和转换间隔时间进行交变脉冲电泳，至电泳指示剂越过样品包埋胶；最后除去种子外面的包埋胶。采用本方法可在常温、常压及低电压的状态下，直接地、无损伤地对完整的、批量的植物种子进行交变脉冲电泳转基因，大大地提高了转基因的效率，扩大了转基因的范围。
文档编号A01H1/00GK1454998SQ02112980
公开日2003年11月12日 申请日期2002年4月30日 优先权日2002年4月30日
发明者李振刚, 戎锐 申请人:中国科学技术大学