专利名称：制备组织、尸检、细胞样品的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物及其用于制备检查用的组织、尸检、细胞样品和类似样品中的应用。
背景技术：
众所周知，现代医学上分析组织、尸检、细胞样品和类似样品是非常重要的，不仅因为它确保能准确及早地诊断许多病理，而且因为可对它进行复杂研究，有利于医学的进展。很自然地，待分析样品必须经过处理，并按照精确的流程制备，以便保证保存效果最佳，而且获得的结果可分析再现，可靠。
目前，在从已施行手术的一部分或死后检查取样(例如组织样品)并且该样品已被固定的情况下，制备检查用样品的第一阶段由一个称之加工阶段组成，该阶段是用来制备包埋在一适当密实度介质内的样品，使之获得足够刚度以致可用刀片进行切片。现时满足这些特性的最好包埋材料是石蜡，但它不能与大部分固定剂混合。因此，为了将组织包埋在石蜡内然后按要求切片，必须经过加工阶段的各种处理，归纳如下 -脱水阶段，在这一阶段中样品所含的水由无水试剂代替。
-净化阶段，在这一阶段中无水试剂由某一组分(净化介质)代替，所述组分能与无水试剂及与包埋介质混合。
-浸渍阶段，在这一阶段中净化介质由浸渍介质(或包埋介质)代替。
第一阶段可以除去初始阶段中用于固定被采集到的样品的水性试剂。可使用的脱水剂有很多种，但最好用递增浓度的乙醇，即样品先用70％乙醇处理，再依次用95％乙醇和100％乙醇处理。因为最常用的脱水剂不溶于石蜡(样品必须包埋于其中的介质)，所以它们必须用一种可溶于脱水剂和浸渍试剂的组分代替。此阶段通常采用二甲苯，它是一种芳香族碳氢化合物，由邻位、间位和对位异构体的混合物组成，是一种可燃液体，易挥发，潜在毒性高。二甲苯的潜在毒性始终是使用者需要考虑的问题。它对中枢神经系统的非特异性影响最初表现为恶心和肠胃问题，如果中毒持续，会出现头晕、昏迷和呕吐。吸入二甲苯可刺激呼吸道粘膜，可能导致肺水肿。若长期接触，可观察到中枢神经系统、白细胞组成、心功能发生改变，最重要的是，可能会致癌。
根据现有技术，加工阶段后通常为一包埋于石蜡的阶段、一切片阶段和一染色阶段。后者用二甲苯处理除去石蜡(石蜡仅用作切片支持物)，一再水合阶段则使用不同浓度(70％、95％、100％)乙醇，使样品染色，再有一个脱水阶段(70％、95％、100％)，最后，再以二甲苯处理除去脱水剂。
若对细胞样品(不安排或不需要包埋在石蜡内)进行分析，需要重复用二甲苯，这是因为在此情况下样品要经过多个水合和脱水阶段。因此，明显地，按顺序重复使用二甲苯制备检查用的组织和/或尸检样品对操作者而言有一定风险，在大部分步骤由自动化系统操作的情况亦然。
已经进行了很多研究，试图寻找二甲苯替代物。
EP 1195594描述了一种固定显微镜分析样品的方法，其包括至少一种丙烯酸甲酯树脂在有机溶剂中的溶液。该有机溶剂有利地选自饱和碳氢化合物，有需要的时候，与一或多种醇混合。使用的处理介质特别用来给显微镜分析载玻片加覆盖物，以改善材料保存于档案时的保存效果。
EP 0822403描述了一个分析用的有机组织的加工程序，其利用由脱水剂和净化剂组成的混合物同时使样品脱水和净化。根据该专利的描述，脱水剂可以是例如乙醇和异丙醇混合物，而净化剂可以是脂肪族碳氢化合物，例如辛烷。使样品同时脱水和净化的阶段在如下条件下进行压力例如300-500mbar，温度为70℃至90℃之间。EP 0822403也描述了在适当压力和温度条件下使用微波装置进行上述阶段。它还描述了进行所述程序的设备，其包括一个微波加热器。
根据上述发明，在同时脱水和净化阶段中将待分析样品加热至特定温度，产生的压力足以在处理周期结束时获得良好结果。然而，明显地，加热样品的操作温度不能高于所示温度，否则样品将会干枯，其细胞被破坏；同样地，因为这一原因，操作压力也不能太高。另一方面，低于所示数值的温度和压力不能有效地加工样品，得出令人不满意的结果，这样的样品难以分析，而且结果也不可靠。因此，除了使用特定微波装置(对加工阶段的成功是必不可少的)外，EP 0822403所述的程序也要求操作者特别注意进行操作和样品处理时的压力和温度条件。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备组织、尸检、细胞样品和类似样品的组合物，它不会致癌，而且毒性低，实施快速容易。
本发明另一个目的在于提供一种制备组织、尸检、细胞样品和类似样品的组合物，它省去了现时制备检查用的样品时必需的许多步骤，而且相对于常规方法不涉及使用任何附加设备，在某些情况下，也节省了制备时间。
本发明又一目的在于提供一种制备组织、尸检、细胞样品和类似样品的组合物，它代替了各种试剂，减少混淆风险，因此操作者出错率降低，所述组合物不涉及任何加热阶段或者在脱水和净化阶段也无需用附加设备处理样品。
本发明再一目的在于提供一种制备检查用的组织、尸检、细胞样品和类似样品的组合物，它快速、有效、可靠，而且对操作者无风险，确保样品获得最佳保存，样品的检查结果能再现，可靠。
具体实施例方式 这些和其他目的及相关优点将在下文详细说明，并通过制备检查用的组织、尸检、细胞样品和类似样品的组合物来实现，所述组合物含有至少一个C5-C20烷基和至少一种脂肪醇。
根据本发明，含有所述烷基和所述脂肪醇的所述组合物含有至少一个C7-C14烷基。
更具体地说，根据本发明，所述烷基是C10-C13。
根据本发明，所述烷基是辛烷。
根据本发明，所述C5-C20烷基可以是选自C5-C20烷基的单个化合物，或者是C5-C20烷基的混合物，例如是辛烷和C10-C13烷基的混合物。
根据本发明，所述组合物含有辛烷、异丙醇和乙醇。根据本发明，所述组合物含有至少一个C5-C20烷基，例如辛烷和C10-C13烷基的混合物，或者C10-C13烷基。
所述乙醇是无水乙醇(99.9％)。详细地说，所述组合物含有至少一个40％-70％(体积)C5-C20烷基或其混合物，5％-40％(体积)异丙醇和5％-40％(体积)乙醇。需要注意，以组合物为整体计全部组分的总百分比为100。
根据本发明，所述组合物含有至少一个40％-70％(体积)C10-C13烷基或其混合物，5％-40％(体积)异丙醇和5％-40％(体积)乙醇。需要注意，以组合物为整体计全部组分的总百分比为100。
根据本发明，所述组合物含有40％-70％(体积)辛烷和C10-C13烷基的混合物，5％-40％(体积)异丙醇和5％-40％(体积)乙醇。需要注意，以组合物为整体计全部组分的总百分比为100。
根据本发明，所述组合物含有至少40％-70％(体积)辛烷，5％-40％(体积)异丙醇和5％-40％(体积)乙醇。需要注意，以组合物为整体计全部组分的总百分比为100。
在一优选形式中，本发明的组合物含有60％(体积)C5-C20烷基和/或C7-C14烷基和/或C10-C13烷基和/或辛烷，10％(体积)异丙醇和30％(体积)乙醇。需要注意，以组合物为整体计全部组分的总百分比为100。在此情况下，该组合物不需要用到附加设备就可以使待分析样品脱水和净化，也不必如上述那样在特定温度和/或压力条件下处理样品。事实上，上述浓度的本发明组合物可在室温和大气压下使用，得到极佳处理的样品，结果的可靠性高，而且使用极为简便。因为没有附加设备，所以操作容易，甚至非专业操作者都可轻易和成功地加工样品进行分析。
根据实施例的另一个形式，本发明的组合物含有50％(体积)C5-C20烷基和/或C7-C14烷基和/或C10-C13烷基和/或辛烷，25％(体积)异丙醇和25％(体积)乙醇。在此情况下，脂肪醇的数量等于其他醇的数量，醇的总量等于C5-C12烷基的数量。需要注意，以组合物为整体计全部组分的总百分比为100。
例如，本发明的组合物含有C10-C13烷基混合物或者辛烷和所述C10-C13烷基混合物之混合物，其中所述C10-C13烷基混合物在提交本申请时以商品名“METRY I 103”在市场上供应，在意大利由BRENNTAG SPA、VIAKULISCIOFF 22、MILANO MI经销。
本发明组合物的制备程序是混合各组分至它们完合混匀。
本发明的上述组合物适宜代替各种浓度的乙醇和前述毒性高和有潜在致癌性的二甲苯，制备组织、尸检、细胞样品和类似样品。本发明组合物的组分毒性不高，而且无迹象显示致癌。实际上，例如制备尸检和/或组织样品时，可使用本发明的组合物代替一系列不同浓度的乙醇，在制备样品阶段也代替二甲苯，仅使用该组合物就可进行脱水和净化阶段。此外，如上所述，使用本发明的组合物时不需要用到附加设备或需要特定温度和/或压力条件。脱水和净化阶段在室温和大气压下进行，无需经过任何附加处理，因此它们可在任何工作环境下由非专业操作者就可以轻易实施。另外，因为不必应用特定温度和压力，出错风险减低，结果更可靠。
根据本发明，应强调，异丙醇是本发明组合物的必要组分。
特别对于加工阶段，通过下表给出的所谓“大”样品加工流程，突出了使用本发明组合物获得的优点。
在下表中，将本发明的组合物称为组合物A。
根据本发明，使上述组分(C5-C20烷基和/或C7-C14烷基和/或C10-C13烷基和/或辛烷、异丙醇及乙醇)混合可制成组合物A。当下列实施例中提到组合物A时，指的是根据本发明混合上述组分所得到的任何组合物。
参看所附表格，表1列出根据已知技术加工样品常用的程序，而表2列出使用组合物A的同一程序，表2A为根据本发明对该程序所作出的改变。
表1 标准加工流程试剂时间温度真空/压力乙醇70°1小时Ta大气压乙醇95°1小时Ta大气压乙醇95°1小时Ta大气压乙醇95°1小时Ta大气压乙醇100°1小时Ta大气压乙醇100°1小时Ta大气压乙醇100°1小时Ta大气压二甲苯1.5小时Ta大气压 二甲苯1.5小时Ta大气压石蜡52-54°1小时55°大气压石蜡52-54°1小时55°真空/压力石蜡52-54°1小时55°真空/压力13小时表2 使用组合物A的加工流程 第一种情形试剂时间温度真空/压力组合物A2.5小时Ta大气压组合物A2.5小时Ta大气压组合物A2.5小时Ta大气压组合物A2.5小时Ta大气压石蜡52-54°1小时55°大气压石蜡52-54°1小时55°真空/压力石蜡52-54°1小时55°真空/压力13小时 表2A 使用组合物A的加工流程 第二种情形试剂时间温度真空/压力中间体试剂 2分钟Ta大气压组合物A 2.5小时Ta大气压组合物A 2.5小时Ta大气压组合物A 2.5小时Ta大气压组合物A 2.5小时Ta大气压石蜡52-54° 1小时55°大气压石蜡52-54° 1小时55°真空/压力石蜡52-54° 1小时55°真空/压力 约13小时 由此可见，虽然制备样品所用的总时间保持不变，但使用不同浓度乙醇溶液的步骤和后来使用二甲苯的步骤被仅用组合物A的步骤所代替。另一个选择是，本发明的加工流程有一个时间很短的初始阶段，即在脱水和净化之前用中间体试剂洗涤样品，收集固定样品阶段所留下的可能仍存在于样品中的过量福尔马林。根据本发明，所述中间体试剂是95％乙醇。
因此，本发明的组合物允许在室温和大气压下用单个组分进行脱水和净化。以此方式，加工阶段所用的步骤减少，使用的物质无毒，不致癌，与已知技术的程序必需用到二甲苯相反。另外，也不必在高温和/或高压(或者至少在不同于室温和大气压)下进行脱水和净化操作，因而无需用到附加设备。
再看制备检查用的组织和尸检样品的程序，如前所述，样品必须包埋在支持物内以使其可以切成适合检查的切片。最常用的包埋介质是石蜡，一方面是因为它较便宜，另一方面是因为它容易操作，能获得精细的组织切片。
下文将描述后续阶段，包括将样品包埋在石蜡内、切成所需切片、除去支持物石蜡及使待分析样品染色的程序。在这些后续阶段中，根本在于使用本发明的组合物代替用各种浓度的乙醇和二甲苯处理样品的阶段。
-包埋 一旦待检查样品被加工后，就可以通过钢模将它们包埋在熔点为56-58℃的石蜡内。
-切片 使用切片机切片，获得3-5μm厚的切片。这些组织切片用刷子收集，置于35℃水浴中，让它们扩张。
然后，将切片放在载玻片上。
将载玻片置于烘箱内，干燥，干燥时间和温度是可变化的，取决于后续采用的染色方案。
-除去石蜡阶段 对于将要染色的组织切片，必须除去包埋该切片的石蜡层，这样，不同试剂才能直接作用于组织。
为此，采用以下流程。表3为已知技术常用的程序，表4为使用本发明的组合物A的程序，表4A为根据本发明对该程度作出的改变。 表3试剂时间二甲苯10分钟二甲苯10分钟无水乙醇5分钟无水乙醇5分钟乙醇95°2分钟乙醇95°2分钟水5分钟39分钟 用本发明的组合物代替乙醇和二甲苯处理，只需两个步骤就可除去石蜡 表4试剂时间组合物A10分钟组合物A10分钟水3分钟水3分钟26分钟 表4A试剂时间组合物A10分钟组合物A10分钟中间体试剂2分钟水3分钟水3分钟约26分钟 在表4A的变化中，只用三步除去石蜡，其中一步为中间体试剂步骤，该步骤快捷简单。
-透明化(Diaphanisation) 进行任一染色方案后，必须使切片再次脱水，以便使用树脂固定介质施加覆盖物。这保证了切片的保存期较长。
为了进行该步骤，通常采用以下已知技术的程序，作为比较，表6给出使用本发明的组合物A的程序。
表5试剂时间乙醇70°10秒乙醇80°10秒乙醇95°1分钟乙醇95°1分钟无水乙醇2分钟无水乙醇2分钟二甲苯5分钟二甲苯5分钟 16分钟20秒 用本发明的组合物代替乙醇和二甲苯，只需两个步骤完成透明化步骤 表6试剂时间组合物A5分钟组合物A5分钟10分钟 除以上所述外，本发明的组合物还可用在任何组织染色方案中，所述的染色方案要求中间步骤使用不同百分比的乙醇和任何二甲苯处理，有时要维持同一步骤持续的时间，但要保证该方法中人手操作部分有明显改善以及容易实施。
表7，8和8A给出已知技术的苏木精/曙红染色方法以及使用本发明组合物的两个不同改变。
表7 常规系统的流程染色方案时间(分钟)切片在二甲苯中浸渍10切片在二甲苯中浸渍10切片在无水乙醇中浸渍2切片在无水乙醇中浸渍2切片在乙醇95°中浸渍2切片在乙醇80°中浸渍2蒸馏水步骤5切片在苏木精中浸渍5在流动水中颜色改变5切片在曙红醇液中浸渍1切片在乙醇70°中浸渍1切片在乙醇80°中浸渍1切片在乙醇95°中浸渍1切片在无水乙醇中浸渍2切片在无水乙醇中浸渍2切片在二甲苯中浸渍5切片在二甲苯中浸渍5用任何固定介质固定载玻片61分钟 表8 使用组合物A的流程染色方案时间(分钟)切片在组合物A中浸渍10切片在组合物A中浸渍10蒸馏水步骤5切片在苏木精中浸渍5在流动水中颜色改变5切片在曙红醇液中浸渍1切片在组合物A中浸渍5用任何固定介质固定载玻片41分钟 表8A 使用组合物A的流程染色方案时间(分钟)切片在组合物A中浸渍10切片在组合物A中浸渍10中间体试剂2蒸馏水步骤5切片在苏木精中浸渍5在流动水中颜色改变5切片在曙红醇液中浸渍1中间体试剂30秒切片在组合物A中浸渍5用任何固定介质固定载玻片约43分钟 在此情形下，除上述优点外，使用本发明组合物的程序还可节省大量时间。另外，根据表8A所示的改变，用中间体试剂简单冲洗可避免任何过度染色。
-细胞样品 本发明的组合物还有利地应用在制备例如用乙醇和醚固定但不包埋在石蜡或其他包埋试剂(如尿)内的细胞样品，涂片试验、痰和其他液体或者其他类型的样品。
本发明的组合物代替 1.所有用不同浓度的乙醇洗涤的过程，如需要维持相同的总洗涤时间或者必要时减少洗涤时间。
2.最后的透明化过程 表9，10和10A给出已知技术中PAPANICOLAOU染色实施例以及使用本发明组合物作出的两个可能改变。 表9 已知技术的常规流程染色方案 时间(分钟)用合适的固定剂固定涂片后，使切片在乙醇95°中浸渍1切片在乙醇80°中浸渍1切片在乙醇70°中浸渍1切片在乙醇50°中浸渍1切片在新鲜水中浸渍5载玻片在蒸馏水中浸渍1切片在苏木精中浸渍5在流动水中颜色改变5切片在乙醇70°中浸渍1切片在乙醇95°中浸渍1切片在乙醇95°中浸渍1切片在橙G中浸渍3切片在乙醇95°中浸渍30秒切片在乙醇95°中浸渍30秒切片在EA50中浸渍5切片在乙醇95°中浸渍30秒切片在乙醇95°中浸渍30秒切片在无水乙醇中浸渍2切片在无水乙醇中浸渍2切片在二甲苯中浸渍5切片在二甲苯中浸渍5用任何固定介质固定载玻片47分钟 表10 使用组合物A的流程染色方案 时间(分钟)用合适的固定剂固定涂片后，使样品在组合物A中浸渍5样品在新鲜水中浸渍5样品在蒸馏水中浸渍1样品在苏木精中浸渍5在流动水中颜色改变5切片在组合物A中浸渍3 切片在橙G中浸渍3切片在组合物A中浸渍1切片在EA50中浸渍5切片在组合物A中浸渍5用任何固定介质固定载玻片38分钟 表10A 使用组合物A的流程染色方案 时间(分钟) 用合适的固定剂固定涂片后，使样品在组合物A中浸渍5 样品在新鲜水中浸渍5 样品在蒸馏水中浸渍1 样品在苏木精中浸渍5 在流动水中颜色改变5 切片在组合物A中浸渍3 切片在橙G中浸渍3 切片在组合物A中浸渍1 切片在EA50中浸渍5 中间体试剂30秒 切片在组合物A中浸渍5 用任何固定介质固定载玻片 约38分钟 在此情形下，用中间体试剂快速冲洗可避免任何过度染色。
在此情形下，即使时间的节省不是很明显，但所需步骤和试剂都减少是显然的。
上述表格实施的各种情形中，术语“中间体试剂”指的是95％乙醇。
如上所述，本发明的组合物可制备尸检、组织和细胞样品，省去二甲苯和乙醇步骤，因此避免了固定时在不同时间重复使用不同试剂。明显地，当操作者被迫按预定次序使用不同试剂，他可能容易混淆，导致出错，影响分析的最后结果。
本发明的组合物也可降低相应步骤中除去石蜡的时间，这是因为组合物本身、石蜡和所用的其他试剂之间有很高的亲和力。
该组合物在带给组织这些优点的同时不会改变该组织的形态特征和抗原表达。
如上所述，使用本发明的组合物可以在室温和大气压下进行各个阶段，因此不需要特定的设备或附加过程。
如果制备合适样品，可回收在流程各阶段中使用及产生的组合物，必要时经过充分纯化循环再用。自然地，纯化后的任何循环必须与组合物可能污染的类型相符，这主要取决于取样受试者经历的病理，制成所述样品后使其与本发明的组合物接触。
权利要求
1.一种组合物，其特征在于所述组合物含有至少一个C5-C20烷基和至少一种脂肪醇。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物含有至少一个C7-C14烷基和至少一种脂肪醇。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物含有至少一个C10-C13烷基和至少一种脂肪醇。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物含有至少辛烷和至少一种脂肪醇。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述C5-C20烷基是选自C5-C20烷基的单个化合物，或者是C5-C20烷基的混合物。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述C5-C20烷基是辛烷和C10-C13烷基的混合物，或者是C10-C13烷基混合物。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物含有辛烷、异丙醇和乙醇。
8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物含有至少一个40％-70％(体积)C5-C20烷基或其混合物，5％-40％(体积)异丙醇和5％-40％(体积)乙醇。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物含有至少一个40％-70％(体积)C10-C13烷基或其混合物，5％-40％(体积)异丙醇和5％-40％(体积)乙醇。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物含有40％-70％(体积)辛烷和C10-C13 烷基混合物，5％-40％(体积)异丙醇和5％-40％(体积)乙醇。
11.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物含有至少40％-70％(体积)辛烷，5％-40％(体积)异丙醇和5％-40％(体积)乙醇。
12.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物含有60％(体积)C5-C20烷基和/或C7-C14烷基和/或C10-C13烷基和/或辛烷，10％(体积)异丙醇和30％(体积)乙醇。
13.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述C10-C13烷基混合物以商品名“METRYL I 103”在市场上供应。
14.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物含有50％(体积)辛烷，25％(体积)异丙醇和25％(体积)乙醇。
15.如权利要求1所述的组合物在制备检查用的组织、尸检和细胞样品中的应用。
16.组织、尸检和细胞样品的制备方法，其特征在于所述方法包括用权利要求1所述的组合物处理所述样品。
17.检查用的组织、尸检和细胞样品的制备程序，其特征在于所述程序包括用权利要求1所述的组合物处理所述样品。
18.如权利要求17所述的程序，其特征在于所述程序包括至少一个使用中间体试剂的冲洗操作。
19.如权利要求18所述的程序，其特征在于所述中间体试剂是95％乙醇。
20.使用权利要求1所述的组合物制成的检查用的组织、尸检和细胞样品。
21.组织、尸检和细胞样品的检查方法，其特征在于所述方法包括用权利要求1所述的组合物处理所述样品。
全文摘要
基于C5－C20烷基和至少一种脂肪醇的组合物，它们用来制备检查用的组织、尸检、细胞样品，所述组合物适合代替现时根据严格固定顺序所使用的不同试剂。
文档编号A01N1/02GK1672028SQ0381751
公开日2005年9月21日 申请日期2003年5月27日 优先权日2002年5月28日
发明者G·莫斯科尼, M·布兰齐 申请人:戴尔帕斯有限公司