专利名称：狐尾藻工程苗快繁方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速生产狐尾藻优质工程苗的方法。
背景技术：
狐尾藻(Myriophyllum spicatum Linn.)为小二仙草科狐尾藻属一种水生草本植物，生长在池塘、湖沼或水稻田中。该植物对水体污染具有较高的耐受性，在富营养化水体生态修复工程中常被用作净水工具种和植被恢复先锋物种。该植物还被广泛栽植于鱼、虾和蟹塘中，不仅可以为上述水产品提供饵料，也可以为之提供必要的避难和产卵场所。另外，在室内观赏水族养殖过程中，该植物也是常用的造景材料。
目前市场上对狐尾藻种苗需求量很大。但有关狐尾藻的研究都集中在其自然种群的分布、其耐污性与净水效果、以及其在鱼虾蟹养殖中的应用。在实践过程中，狐尾藻种源都采集于自然环境。该植物茎柔软而多分枝，打捞过程中根系多遭受严重破坏，且植株间大小不一，不利于其成功移植。另外，自然来源的狐尾藻带有各种杂藻杂菌，不利于鱼虾蟹塘和室内观赏水族缸中的安全使用。最后自然环境中狐尾藻种源有限，过量采集容易导致其原生生境的破坏。
迄今国内外未见有关狐尾藻无菌苗的培养及其大规模人工繁殖的研究与报道。
发明内容
本发明的目的是利用植物组织培养技术，获得并在室内大规模繁殖狐尾藻工程苗，并尽量保持其无菌，以克服该物种野外收集有限且污染严重的弊端，适应我国淡水湖泊植被恢复、野外鱼虾蟹水产养殖以及室内观赏水族布景的需要。本发明的技术方案是1.狐尾藻无菌芽的获得从野外自然生境中采集狐尾藻植株，剪取幼嫩芽段，于肥皂水中浸泡2h以上，用自来水冲洗干净。在超净工作室中，用70％乙醇浸泡一定时间，再用适当浓度的NaClO漂白剂并一定比例的Tween-80浸泡一定时间，用无菌水彻底漂洗后接种于培养液①(见表1)中，并置于组织培养室中培养。室内平均光照强度2000lx，每日光照10h，温度为25℃左右。期间注意观察，随时剔除仍然污染的材料，以免交叉感染。
2.狐尾藻丛芽的扩增由上述步骤获得的无菌个体经过2周培养后，多数茎叶已明显伸长，并有侧芽长出。于超净工作室中，将所有2cm以上的侧芽切下，过长的茎段再以每2cm长度切小，将每段转接到新的培养液①中。以后每隔2周将长大的材料按上述方法重复切割，以获得足够多的无菌芽。上述扩增培养过程仍在组培室中进行，光照和温度不变。
3.狐尾藻生根与完整苗的诱导取上述步骤2获得无菌侧芽，同样保持在2cm左右，转接到培养液②(见表1)中，继续在组培室中培养10d以上，诱导材料生根并形成完整幼苗。组培室中光照和温度不变。
表1.狐尾藻培养液①、②配方为
*上述培养液按浓度配好后均用稀HCl或NaOH调整pH到5.7，分装到100mL三角瓶中，用封口膜包扎后于121℃、0.1MPa左右湿热灭菌18min。
4.狐尾藻工程苗的壮苗将上述培养液②中茎长6cm以上，并至少带有2根2cm以上根的狐尾藻幼苗取出，移栽到底部铺有灭过菌的沙石的大玻璃缸中。保持水深50cm以上，每周换水并添加一定量Hoagland营养液以促进其生长。当室外白昼气温20℃以上时，将玻璃缸置于室外，直接利用太阳光照；否则，将玻璃缸置于温室中，昼夜温度分别保持18℃和25℃以上，并在白天适当补充人工光照。上述培养保持到植株长至40cm以上。
5.狐尾藻工程苗的应用上述通过步骤3培养后收获的茎长6cm以上、根系发达的健康狐尾藻小苗，直接应用于室内观赏水族布景。具体操作方法为先用自来水将植株上残留的培养液冲洗干净，以防粘附培养液对观赏水族的污染，然后根据布景的需要，插植于水族缸底沙中。上述通过步骤4培养后获得的株高40cm以上、根系发达的健康狐尾藻植株，应用于鱼虾蟹塘的养殖以及大型湖泊水体生态修复工程中。具体操作方法为从大玻璃缸中挖取健康狐尾藻植株，注意保持其根系完整，采用黑暗和保湿方式迅速运抵目标地后，根椐鱼虾蟹苗投放量或水体富营养和植被退化程度决定狐尾藻栽种密度，并根据实际需要，采用单株或丛株移栽，以及单一物种移栽或与其它物种混合移栽。
本发明的效果在于1)获得了狐尾藻无菌苗。野外采集的狐尾藻原材料本身污染严重，而该水草茎叶细嫩，又兼有吸收能力，使其灭菌过程具有相当难度。本技术先采用较温和的肥皂水浸洗，初步降低污染后，再以乙醇、NaClO漂白剂以及Tween-80共同作用，彻底灭菌。通过该程序，在保证平均无菌率60％的基础上，材料存活率可保证在50％以上。再利用合适的培养液和激素配比，分别诱导出丛芽和根，并最终获得完整无菌苗。经过驯化培养的狐尾藻无菌芽，在培养液①中每2周的增殖率在1∶30以上(即每个单芽经2周培养后，至少可获得30个以上丛芽)，同时在培养液②中，材料的生根率也在80％以上。
2)建立了狐尾藻工程苗快速繁殖途径。本技术在获得狐尾藻无菌芽的基础上，直接利用其侧芽进行分割繁殖，步骤简单，操作方便。所用试剂均为常规化工产品，成本低廉，便于其大规模工厂化生产。期间未涉及愈伤组织的脱分化和分化过程，尽量避免了组织培养过程中遗传变异的可能性，一旦获得无菌种芽，即可进行长期扩增繁殖。
本项发明可不分季节，随时为湖泊植被恢复、鱼虾蟹塘养殖以及室内水族观赏布景提供足够的狐尾藻优质工程苗。
具体实施例方式
实例1.于2003年10月从南京江浦县采集狐尾藻种源，剪取2cm长的芽段5个，于肥皂水中浸泡4h后用自来水漂洗。进入超净工作室中，用70％乙醇浸泡数秒，再用稀释适当比例并含有一定量Tween-80的NaClO漂白剂浸泡数分钟，用无菌水彻底漂洗后，将每个芽单独接种于含培养液①并已灭菌的的封口三角瓶中，于组培室中培养。平均光照强度2000lx，每日光照10h，温度25℃左右。此后经观察，发现其中2瓶仍然污染，而另3瓶无菌并在几天后开始明显返绿。2周后于超净工作室中将3瓶材料中的每个2cm以上的侧芽切下并单独接种于新的培养液①中，共得11瓶。继续培养2周后再次切割，并以每5个芽为一瓶，接种到培养液②中，共为62瓶。20d后收获茎长6cm以上，且至少带2个2cm以上根的完整狐尾藻无菌苗272株。2004年1月将这些健康小苗用于观赏水族布景。
实例2.于2003年11月从苏州东太湖采得狐尾藻种源，剪取2cm长的芽段20个，于肥皂水中浸泡4h后用自来水漂洗。进入超净工作室中，用70％乙醇浸泡数秒，再用稀释适当比例并含有一定量Tween-80的NaClO漂白剂继续消毒。用无菌水彻底漂洗后，将每个芽单独接种于培养液①中，于组培室中培养。平均光照强度2000lx，每日光照10h，温度25℃左右。2周内共剔除污染材料11份，另9份材料中有5份明显增长。初次切割后共获得48个侧芽，继续培养于培养液①中。此后每隔2周分割一次并转接到新的培养液①中以诱导更多丛生芽。2个月后，将新生芽转接到培养液②中以诱导生根。15d后将完整小苗取出，移栽到铺有灭过菌的沙石的大玻璃缸中，并在温室中培养。每周换水且补充Hoagland营养液以壮苗。该批材料将被应用于太湖富营养化水体生态修复工程中。
权利要求
1.一种狐尾藻无菌苗培养及其工程苗快速扩繁的方法，其特征为该方法由以下步骤组成1)经过一系列灭菌过程，获得狐尾藻无菌芽；2)将原生无菌芽接种于以Ms为基本成分并附加有一定量激素的培养液①中以诱导丛生芽，并每隔2周将2cm以上长度的新芽切下并接种到新的培养液①中以不断扩增直到获得足够多材料；3)将新芽同样切割下来后转接到以Ms为基本成分但激素类型和含量有所变化的培养液②中以诱导生根；4)将培养液②培养到茎长6cm以上，根系发达的幼苗转到大玻璃缸中，补充Hoagland营养液继续壮苗，直到植株长至40cm以上。
2.根据权利要求1所述狐尾藻工程苗在湖泊植被恢复工程中的应用。
3.根据权利要求1所述狐尾藻工程苗在鱼虾蟹养殖过程中的应用。
4.根据权利要求1所述狐尾藻工程苗在室内观赏水族养殖过程中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域。运用狐尾藻组织培养技术，获得并大规模扩繁其优质工程苗，以克服该物种在自然环境中种源有限且污染严重的问题。满足目前湖泊生态修复工程中作为净水工具种和植被恢复先锋物种、鱼虾蟹塘养殖过程中作为饵料、避难和产卵场所，以及室内观赏水族养殖过程中作为布景材料的迫切需要。
文档编号A01H4/00GK1559184SQ200410014210
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月4日 优先权日2004年3月4日
发明者周长芳, 安树青, 尹大强, 蒋金辉 申请人:南京大学