专利名称：大花蕙兰优质种苗快速繁殖方法
技术领域：
本发明提供大花蕙兰优质种苗快速繁殖方法和所使用的培养基。
背景技术：
大花蕙兰由兰属(cymbidium)植物中大花类原种杂交而来。国内早期从国外引进来后，因其花数众多，花大色艳，植物高大，于是通称称为大花蕙兰，目前大花蕙兰品种达1万多个，今年来通过与兰属中的建兰，春兰等香花品种杂交，还培育出了很多具有宜人香味的品种。大花蕙兰近年来在国内形成消费热潮，每年需从日本、韩国进口大量的商品植株，国内的商品生产发展迅速，目前种苗奇缺。大花蕙兰商品苗生产几乎全部用试管苗进行繁殖，采用组培技术生产高品质的试管苗，为满足种苗市场的需要提供一条有效的途径。大花蕙兰的组织培养技术研究在国外开展较早，是第一个进行兰花工厂化生产的种类。国内近年来也开展了相关的研究，有少数组培公司进行了大规模生产和有一例专利申请的报道。
发明内容
本发明的目的是提供大花蕙兰的组织培养繁殖方法和所使用的培养基。本发明对数种初代和多代杂交培育的大花蕙兰品种的组织培养和快速繁殖技术进行了系统研究，从生产的角度对培养基成分，工艺流程等方面有较大的创新，提供了一套大花蕙兰植物优质种苗快速繁殖方法和相关培养基配方。其外植体消毒效率高、培养基成分独特而且成本低，生产出的种苗品质一流，应用价值高，具体包括如下步骤1.材料本发明采用材料有6个品种的大花蕙兰绿珍珠、钢琴家、金黄小神童、台北小姐、象牙虎头兰(cymbidium tracyanum×cymbidium ebureum)。
2.外植体诱导材料消毒的方法切取大花蕙兰新芽，流水冲洗5分钟，将外植体在超净工作台上用酒精浸泡30秒后，再用重量百分比浓度0.1％升汞浸泡10分钟，无菌水冲洗3次，用解剖刀剥除芽苞片，，再放入重量百分比浓度0.1％的升汞溶液5分钟，无菌水洗三遍，逐层剥去叶片，每剥一层叶片片，用重量百分比浓度0.1％升汞浸泡1分钟，无菌水冲洗三次，直至剥至露出生长点。
3、拟原球茎诱导切取2-5mm3左右的带生长点的组织块接种到拟原球茎诱导培养基MH+6-苄基嘌呤2-10毫克/升+萘乙酸0.2-1.0毫克/升+10-20％椰子水+柠檬酸0-100克/升。椰子水由新鲜上市的椰子中的汁水经过滤而来。加入椰子汁能明显提高拟原球茎的诱导率。
4、继代增殖培养30天左右将拟原球茎转移到继代增殖培养基MH+6-苄基嘌呤0.2-0.5毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+活性炭0.5克/l。增殖培养一般30天左右为一个继代周期。在增殖过程中去除椰子汁主要是为了降低成本，采用低浓度的激素组合和添加少量活性炭可以减少褐化，在保持一定的增殖率的条件下减少变异的发生。
5、成苗培养拟原球茎增殖到一定代数后接种到成苗培养基培养2-3周形成小苗。成苗培养基HF1+6-苄基嘌呤0.5-1毫克/升+萘乙酸0.1-0.2毫克/升。
6.生根壮苗培养当无根苗高2-3厘米时，转接到生根壮苗培养基上培养，加入活性炭根数增多，能防止部分切口褐变.生根壮苗培养基HF2+萘乙酸0.5-1毫克/升+水解酪蛋白0.2克/升+香蕉匀浆10％+0.5％活性炭。
以上培养基均含蔗糖20克/升，pH5.2-5.4，琼脂0.7％。培养温度(28±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12小时/天。
7.试管苗移栽当壮苗培养6周左右，试管苗能长至10-12厘米高，转移到自然光下炼苗7天后，将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入树皮∶塘基石为2∶1的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，1周左右试管苗可恢复生长，移栽的成活率均可达95％-100％。
进行炼苗处理有利于试管苗角质层的形成和对环境的适应能力，移栽成活率增高。
本发明所提供的方法具有外植体去污成功率较高，增殖率高，变异率低，种苗粗壮，品质好、移栽后成活率高，生长势强等优势。其外植体消毒效率高、培养基成分独特而且成本低，生产出的种苗品质一流，应用价值高。
技术特点1.大花蕙兰商业生产都采用试管苗进行繁殖，而进行组织培养时外植体去污难，本专利采用未出叶的新芽为外植体和多步消毒的方法，灭菌的效果可达80％的成功率；2.原球茎增殖时，增殖系数与变异频率往往是正比增长，本专利在增殖培养基中采用低激素浓度和加入活性炭，达到了较高的增殖率和防止变异的效果；3.在大花蕙兰的种苗生产中种苗的品质对后期的栽培有重大的影响，现国内生产的商品大花蕙兰品质难以与日本进口的相比，除栽培技术影响外，种苗品质差也是重要原因，本专利采用两步育苗法，首先严格控制拟原球茎继代时不出苗，有利于增殖和操作，然后转入专门的成苗培养基上培养，有利于诱导出健壮、品质均一的大花蕙兰苗，进一步转入添加有机添加物的壮苗培养基，种苗成长迅速，6周左右可以长到出瓶规格，经过7-14天的炼苗，出瓶苗颜色深绿，株高10-14cm(依品种而异)，根数可达3-6条，苗根与一般种苗比较更粗壮，苗与根长度比例约为3∶2，易于移栽。
4.本专利培育的种苗达到了很高的品质，而在此步骤采用花宝复合培养基，使用方便、成本低、效果显著。
具体实施例方式
实施例11.取材象牙虎头兰未出叶的新芽。
2.外植体诱导材料消毒的方法用锋利的刀片自基部切取温室中栽培的象牙虎头兰品种新芽，自来水冲洗5分钟。将外植体在超净工作台上用酒精浸泡30秒后，再用0.1％升汞浸泡10分钟，无菌水冲洗3次，用解剖刀剥除芽苞片，，再放入0.1％的升汞溶液5分钟，无菌水洗三遍，逐层剥去叶片，每剥一层叶片片，用0.1％升汞浸泡1分钟，无菌水冲洗三次，直至剥至露出生长点，切取2-5mm3左右的带生长点的组织块接种到拟原球茎诱导培养基上诱导拟原球茎芽形成。
3.拟原球茎诱导切取2-5mm3左右的带生长点的组织块接种到拟原球茎诱导培养基MH+6-苄基嘌呤2毫克/升+萘乙酸0.2毫克/升+15％椰子水+柠檬酸50克/升；培养30天左右有拟原球茎形成。
4.继代增殖诱导培养30天左右将拟原球茎转移到MH+6-苄基嘌呤0.2毫克/升+萘乙酸0.5毫克/升+活性炭0.5克/l继代增殖培养基上继代增殖，一般30天左右为一个继代周期。
5.成苗培养增殖到一定代数后接种到成苗培养基HF1+6-苄基嘌呤0.5毫克/升+萘乙酸0.1毫克/升。一周后即可见拟原球茎形成苗端，3-4周可长成3cm左右的无根小苗。
6.生根壮苗培养将在成苗培养基上培养4周左右，形成的约3cm高的小苗转接到生根壮苗培养基HF2+萘乙酸1毫克/升+水解酪蛋白0.2克/升+香蕉匀浆10％+0.5％活性炭；每瓶接种22株。接种6周后植株平均根数3.4条，平均株高9.8cm，平均鲜重达2.2克/l7.试管苗移栽将壮苗培养4周的瓶苗，转移到温室栽培条件下炼苗7天，将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入树皮∶塘基石为2∶1的混合基质中，保持适当通风和湿度，移栽的成活率均可达98％以上。
以上培养基均含蔗糖20克/升，pH5.2-5.4，琼脂0.7％。培养温度(28±2)℃，光照度1500～2000lx，光照12小时/天。椰子水由青椰子中的汁水经过滤而来。
实施例2取‘钢琴家’的新芽为外植体。基本操作方法同实施例1一致。但其拟原球茎诱导培养基为MH+6-苄基嘌呤5毫克/升+萘乙酸0.5毫克/升+10％椰子水。拟原球茎增殖培养基为MH+6-苄基嘌呤1毫克/升+萘乙酸0.2毫克/升+活性炭0.5克/l；成苗培养基为HF1+6-苄基嘌呤0.5毫克/升+萘乙酸0.2毫克/升。生根壮苗培养40天后统计平均根数为4.6条，平均株高10.7cm，平均鲜重达3.2克。试管苗移栽的成活率可达100％。
权利要求
1.一种大花蕙兰的组织培养繁殖方法，其特征在于从生产的角度对大花蕙兰植物优质种苗快速繁殖方法提供相关培养基配方，和工艺流程，具体步骤包括如下1)、外植体诱导材料消毒的方法切取大花蕙兰新芽，流水冲洗5分钟，将外植体在超净工作台上用酒精浸泡30秒后，再用重量百分比浓度0.1％升汞浸泡10分钟，无菌水冲洗3次，用解剖刀剥除芽苞片，，再放入重量百分比浓度0.1％的升汞溶液5分钟，无菌水洗三遍，逐层剥去叶片，每剥一层叶片片，用重量百分比浓度0.1％升汞浸泡1分钟，无菌水冲洗三次，直至剥至露出生长点；2)、拟原球茎诱导切取2-5mm3左右的带生长点的组织块接种到拟原球茎诱导培养基；3)、继代增殖培养30天左右将拟原球茎转移到继代增殖培养基上，增殖培养30天为一个继代周期；4)、成苗培养拟原球茎增殖到一定代数后接种到成苗培养基培养2-3周，形成小苗；5)、生根壮苗培养当无根苗高2-3厘米时，转接到生根壮苗培养基上培养；6)、试管苗移栽当壮苗培养6周，试管苗能长至10-12厘米高，转移到自然光下炼苗7天后，将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入树皮∶塘基石为2∶1的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，1周试管苗可恢复生长。
2.根据权利要求1中所述的大花蕙兰的组织培养繁殖方法，其特征在于2)中拟原球茎诱导培养基为MH+6-苄基嘌呤2-10毫克/升+萘乙酸0.2-1.0毫克/升+10-20％椰子水+柠檬酸0-100克/升。
3.根据权利要求1或2中所述的大花蕙兰的组织培养繁殖方法，其特征在于所述椰子水由新鲜的椰子中的汁水经过滤而来。
4.根据权利要求1中所述的大花蕙兰的组织培养繁殖方法，其特征在于3)中、继代增殖培养基、为MH+6-苄基嘌呤0.2-0.5毫克/升+萘乙酸0.2-0.5毫克/升+活性炭0.5克/l。
5.根据权利要求1中所述的大花蕙兰的组织培养繁殖方法，其特征在于4)、中成苗培养基为HF1+6-苄基嘌呤0.5-1毫克/升+萘乙酸0.1-0.2毫克/升。
6.根据权利要求1中所述的大花蕙兰的组织培养繁殖方法，其特征在于5)、中生根壮苗培养基为HF2+萘乙酸0.5-1毫克/升+水解酪蛋白0.2克/升+香蕉匀浆10％+0.5％活性炭。
7.根据权利要求1中所述的大花蕙兰的组织培养繁殖方法，其特征在于以上拟原球茎诱导培养基、继代增殖培养基、成苗培养基、生根壮苗培养基，均含蔗糖20克/升，pH5.2-5.4，琼脂0.7％；培养温度28±2℃，光照度1500～2000lx，光照12小时/天。
全文摘要
本发明提供大花蕙兰优质种苗快速繁殖方法和所使用的培养基。大花蕙兰由兰属植物中大花类原种杂交而来。大花蕙兰近年来在国内形成消费热潮，目前种苗奇缺，本发明从生产的角度对培养基成分，工艺流程等方面有较大的创新，提供了一套大花蕙兰植物优质种苗快速繁殖方法和相关培养基配方。本发明所提供的方法具有外植体去污成功率较高，增殖率高，变异率低，种苗粗壮，品质好、移栽后成活率高，生长势强等优势。其外植体消毒效率高、培养基成分独特而且成本低，生产出的种苗品质一流，应用价值高。
文档编号A01H3/00GK1586166SQ20041005090
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月30日 优先权日2004年7月30日
发明者段俊, 曾宋君, 陈之林, 陈建通 申请人:中国科学院华南植物园