专利名称：：通过基于小寡核苷酸的化合物调节免疫刺激性质的制作方法
技术领域：
：本发明涉及使用寡核苷酸作为免疫刺激剂(immunostimulatoryagent)的免疫学和免疫治疗应用。
背景技术：
：寡核苷酸在现代分子生物学中已成为不可或缺的工具用于各种各样的技术，其范围从诊断性探测(probing)方法到PCR到基因表达的反义抑制(antisenseinhibition)和免疫治疗应用。寡核苷酸的此普遍的用途已导致对于快速、廉价和有效地合成寡核苷酸的方法的需要增加。合成用于反义和诊断应用的寡核苷酸现在可以常规完成。参见，例如，MethodsinMolecularBiology，Vol.20ProtocolsforOligonucleotideandAnalogspp.165-189(S.Agrawal，ed.，HumanaPress，1993)；OligonucleotideandAnalogues，APracticalApproach，pp.87-108(F.Eckstein，ed.，1991)；和Uhlmann和Peyman，supra；Agrawal和Iyer，Curr.Op.inBiotech.612(1995)；和AntisenseResearchandApplications(Crooke和Lebleu，eds.，CRCPress，BocaRaton，1993)。早期的合成方法包括磷酸二酯(phosphodiester)和磷酸三酯化学方法。例如，Khorana等，J.Molec.Biol.72209(1972)公开了用于寡核苷酸合成的磷酸二酯化学。Reese，TetrahedronLett.343143-3179(1978)公开了用于合成寡核苷酸和多核苷酸的磷酸三酯化学方法。这些早期方法很大程度上为更有效的亚磷酰胺(phosphoramidite)和氢膦酸酯(H-phosphonate)合成方法所代替。例如，Beaucage和Caruthers，TetrahedronLett.221859-1862(1981)公开了脱氧核糖核苷亚磷酰胺在多核苷酸合成中的用途。Agrawal和Zamecnik，美国专利No.5,149,798(1992)公开了通过氢膦酸酯方法优化合成寡核苷酸。这些现代方法两者都被用于合成具有大量修饰的核苷间连接(internucleotidelinkage)的寡核苷酸。Agrawal和Goodchild，TetrahedronLett.283539-3542(1987)教导了使用亚磷酰胺化学合成寡核苷酸甲基膦酸酯。Connolly等，Biochem.233443(1984)公开了使用亚磷酰胺化学合成寡核苷酸硫代磷酸酯(phosphorothioate)。Jager等，Biochem.277237(1988)公开了使用亚磷酰胺化学合成寡核苷酸氨基磷酸酯(phosphoramidate)。Agrawal等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)857079-7083(1988)公开了使用氢膦酸酯化学合成寡核苷酸氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。更近一些，几位研究者已证明了在免疫治疗应用中使用寡核苷酸作为免疫刺激剂的有效性。磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸可诱导免疫刺激的观察已导致人们产生开发此副作用(sideeffect)作为治疗工具的兴趣。这些努力集中在含有二核苷酸天然CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸。Kuramoto等，Jpn.J.CancerRes.831128-1131(1992)教导了含有回文序列(palindrome)的磷酸二酯寡核苷酸可诱导干扰素-alpha和gamma合成并增强天然杀伤细胞(naturalkiller)活性，所述回文序列包括CpG二核苷酸。Krieg等，Nature371546-549(1995)公开了硫代磷酸酯含CpG的寡核苷酸是免疫刺激性的。Liang等，J.Clin.Invest.981119-1129(1996)公开了所述寡核苷酸激活人B细胞。Moldoveanu等，Vaccine161216-124(1998)教导了含CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸增强了抗流感病毒(influenzavirus)的免疫应答。McCluskie和Davis，J.Immunol.1614463-4466(1998)教导了含CpG的寡核苷酸作为有效的佐剂，增强抗乙型肝炎病毒(hepatitisB)表面抗原的免疫应答。含CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸的其它修饰也可影响它们的作为免疫应答的调节物的能力。参见，例如，Zhao等，Biochem.Pharmacol.(1996)51173-182；Zhao等，BiochemPharmacol.(1996)521537-1544；Zhao等，AntisenseNucleicAcidDrugDev.(1997)7495-502；Zhao等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(1999)93453-3458；Zhao等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2000)101051-1054；Yu等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2000)102585-2588；Yu等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2001)112263-2267；和Kandimalla等，Bioorg.Med.Chem.(2001)9807-813。含CpG的寡核苷酸可调节的一种应答是哮喘(asthma)。过敏性哮喘应答(allergicasthmaresponse)的特征在于2型T协助细胞(T-helpertype2)(Th2)淋巴细胞的活化。由Th2淋巴细胞诱导的应答在哮喘的变应性炎症的发病机制(pathogenesis)和传播(propagation)中起到主要的作用。Th2细胞因子IL-5增加了嗜酸性粒细胞(eosinophil)的产生和存活，导致出现的气道嗜酸性粒细胞增多(airwayeosinophilia)增加。其它Th2细胞因子(IL-4、IL-9和IL-13)通过诱导产生变应原特异性的(allergen-specific)IgE、肥大细胞增殖(mast-cellproliferation)、内皮细胞粘附分子表达(endothelial-celladhesion-moleculeexpression)和气道高应答性(hyper-responsiveness)也在变应性炎症中起到关连接的作用。皮质类固醇(corticosteroid)是目前唯一广泛使用的变应性哮喘的治疗方法。然后，类固醇治疗只在使炎症的表现最小化中是有效的，而且并不治愈疾病。需要持续的治疗以防止变应性哮喘的进展(progression)。这些报道阐明了仍然需要能够增强并改进由免疫刺激性寡核苷酸引起的应答。
发明内容本发明提供了用于增强并改进由寡核苷酸化合物引起的免疫应答的方法。本发明的方法允许增加免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激作用用于免疫治疗应用。本发明者令人惊讶地发现对可选地存在于免疫刺激性寡核苷酸5’末端的修饰显著地增强了其免疫刺激能力。所述寡核苷酸在本文中称为″致免疫物(immunomer)″。因此，在第一个方面，本发明提供致免疫物，其包含在它们的3’末端，核苷酸间连接，或通过非-核苷酸接头在功能化的核碱基或糖连接的至少两个寡核苷酸，所述寡核苷酸中的至少一个作为免疫刺激性寡核苷酸并具有可接近的5′末端。在一个实施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸致免疫物包含SEQIDNO170的序列。在第二个方面，本发明提供免疫调节性组合物，其包括含有SEQIDNO170的序列的免疫调节性寡核苷酸致免疫物；而且还包含共-刺激分子，所述共-刺激分子选自细胞因子、趋化因子、蛋白质配体、反式-活化因子、肽和包含经修饰的氨基酸的肽组成的组。在本发明的这个方面，所述共-刺激分子可选地与所述免疫调节性寡核苷酸致免疫物结合，而且所述免疫调节性组合物还可选地包含佐剂和/或可药用的载体。在第三个方面，本发明提供免疫调节性组合物，其包括含有SEQIDNO170的序列的免疫调节性寡核苷酸致免疫物；而且还包含抗原，其中所述抗原选自肽(peptide)、糖蛋白(glycoprotein)、脂蛋白(lipoprotein)、多糖(polysaccharide)和脂质(lipid)，或其中所述抗原是变应原(allergen)。在本发明的这个方面，所述免疫调节性组合物还可选地包含佐剂和/或可药用的载体。在另一个实施方案，所述免疫刺激性寡核苷酸致免疫物包含SEQIDNO171的序列。在第四个方面，本发明提供免疫调节性组合物，其包括含有SEQIDNO171的序列的免疫调节性寡核苷酸致免疫物；而且还包含共-刺激分子，所述共-刺激分子选自细胞因子、趋化因子、蛋白质配体、反式-活化因子、肽和包含经修饰的氨基酸的肽组成的组。在本发明的这个方面，所述共-刺激分子可选地与所述免疫调节性寡核苷酸致免疫物结合，而且所述免疫调节性组合物还可选地包含佐剂和/或可药用的载体。在第五个方面，本发明提供免疫调节性组合物，其包括含有SEQIDNO171的序列的免疫调节性寡核苷酸致免疫物；而且还包含抗原，其中所述抗原选自肽、糖蛋白、脂蛋白、多糖和脂质组成的组，或其中所述抗原是变应原。在本发明的这个方面，所述免疫调节性组合物还可选地包含佐剂和/或可药用的载体。在另一个实施方案中，本发明提供治疗患有如下病症的患者的方法气道炎症(airwayinflammation)、炎性疾病(inflammatorydisorder)、过敏症(allergy)或哮喘(asthma)，所述方法包含对所述患者施用致免疫物。在第六个方面，本发明提供治疗患者的方法，其中所述致免疫物包含通过非核苷酸接头连接并具有多于一个5’末端的至少两个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中至少一个是具有可接近的5’末端并包含免疫刺激性二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸。所述免疫刺激性二核苷酸选自CpG、C*pG、CpG*和C*pG*组成的组，其中C是胞苷(cytidine)或2′-脱氧胞苷(2′-deoxycytidine)，C*是2′-脱氧胸苷(2’-deoxythymidine)、阿糖胞苷(arabinocytidine)、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤(1-(2′-deoxy-β-D-ribofuranosyl)-2-oxo-7-deaza-8-methyl-purine)、2’-脱氧-2’-取代的阿糖胞苷(2’-deoxy-2’-substitutedarabinocytidine)、2’-O-取代的阿糖胞苷(2’-O-substitutedarabinocytidine)、2′-脱氧-5-羟基胞苷(2′-deoxy-5-hydroxycytidine)、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷(2′-deoxy-N4-alkyl-cytidine)、2′-脱氧-4-硫代尿苷(2′-deoxy-4-thiouridine)，或其它非天然嘧啶核苷，G是鸟苷(guanosine)或2’脱氧鸟苷(2′-deoxyguanosine)，G*是2′脱氧-7-脱氮-鸟苷(2’deoxy-7-deazaguanosine)、2′-脱氧-6-硫代鸟苷(2’-deoxy-6-thioguanosine)、阿糖鸟苷(arabinoguanosine)、2′-脱氧肌苷(2′-deoxyinosine)、2’-脱氧-2’取代的-阿糖鸟苷(2’-deoxy-2’substituted-arabinoguanosine)、2’-O-取代的-阿糖鸟苷(2’-O-substituted-arabinoguanosine)。在第七个方面，本发明提供治疗患者的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO170的序列，或SEQIDNO171的序列，或SEQIDNO172的序列，或SEQIDNO173的序列。在第八个方面，本发明提供治疗患者的方法，其还包括施用与所述疾病或病症有关的抗原，其中所述致免疫物和/或抗原连接于免疫原性蛋白质或非免疫原性蛋白质，和/或还包含施用佐剂。在另一个实施方案中，本发明提供调节患有气道炎症、炎性疾病、过敏症或哮喘的患者中的免疫应答的方法，所述方法包含对所述患者施用致免疫物。其中所述免疫应答是Th1和/或Th2免疫应答。在第九个方面，本发明提供调节患者中的免疫应答的方法，其中所述致免疫物包含通过非核苷酸接头连接并具有多于一个5’末端的至少两个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中至少一个是具有可接近的5’末端并包含免疫刺激性二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸。所述免疫刺激性二核苷酸选自CpG、C*pG、CpG*和C*pG*组成的组，其中C是胞苷或2′-脱氧胞苷，C*是2′-脱氧胸苷、阿糖胞苷、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-脱氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或其非天然嘧啶核苷，G是鸟苷或2’脱氧鸟苷，G*是2′脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷、2’-脱氧-2’取代的-阿糖鸟苷、2’-O-取代的-阿糖鸟苷。在第十个方面，本发明提供在患者体内调节免疫应答的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO170的序列，或SEQIDNO171的序列，或SEQIDNO172的序列，或SEQIDNO173的序列。在第十一个方面，本发明提供治疗患者的方法，其还包括施用与所述疾病或病症有关的抗原，其中所述致免疫物和/或抗原连接于免疫原性蛋白质或非免疫原性蛋白质，和/或还包括施用佐剂。图1是本发明的有代表性的致免疫物的图示。图2显示本发明的几种有代表性的致免疫物。图3显示一组有代表性的小分子接头，其适于线性(linear)合成本发明的致免疫物。图4显示一组有代表性的小分子接头，其适于平行(parallel)合成本发明的致免疫物。图5是线性合成本发明的致免疫物的合成方案。DMTr＝4，4′二甲氧基三苯甲基，CE＝氰乙基。图6是平行合成本发明的致免疫物的合成方案。DMTr＝4，4′二甲氧基三苯甲基，CE＝氰乙基。图7A图示了通过致免疫物1-3在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-12。这些数据显示具有可接近的5’-末端的致免疫物2是比单体的Oligo1更强的IL-12诱导物，而不具有可接近的5’-末端的致免疫物3与oligo1相比具有相等或较弱的产生免疫刺激的能力。图7B图示了通过致免疫物1-3在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-6(分别为由顶至底)。这些数据显示具有可接近的5’-末端的致免疫物2是比单体的Oligo1更强的IL-6诱导物，而不具有可接近的5’-末端的致免疫物3与oligo1相比具有相等或较弱的产生免疫刺激的能力。图7C图示了通过致免疫物1-3在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-10(分别为由顶至底)。图8A图示了通过不同浓度的致免疫物5和6在细胞培养物中诱导BALB/c小鼠脾细胞增殖，所述的致免疫物5和6分别具有不可接近的和可接近的5’-末端。图8B图示了由致免疫物4-6引起的BALB/c小鼠脾增大，所述的致免疫物4-6在CpG基序的5’-侧翼序列具有免疫原性化学修饰。而且具有可接近的5’-末端的致免疫物(6)与不具有可接近的5’-末端的致免疫物5和单体的Oligo4相比，具有更强的使脾增大增加的能力。图9A图示了通过不同浓度的Oligo4和致免疫物7和8在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-12。图9B图示了通过不同浓度的Oligo4和致免疫物7和8在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-6。图9C图示了通过不同浓度的Oligo4和致免疫物7和8在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-10。图10A图示了通过致免疫物14、15和16在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导细胞增殖。图10B图示了通过不同浓度的致免疫物14和16在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导由IL-12引起的细胞增殖。图10C图示了通过不同浓度的致免疫物14和16在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导由IL-6引起的细胞增殖。图11A图示了通过Oligo4和17和致免疫物19和20在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导细胞增殖。图11B图示了通过不同浓度的Oligo4和17和致免疫物19和20在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导由IL-12引起的细胞增殖。图11C图示了通过不同浓度的Oligo4和17和致免疫物19和20在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导由IL-6引起的细胞增殖。图12图示了使用寡核苷酸4和致免疫物14、23和24引起的BALB/c小鼠脾增大。图13图示了寡核苷酸的3′-末端核苷，其显示非-核苷酸连接(non-nucleotidiclinkage)可在核碱基，在3’位置，或在2’位置与核苷连接。图14显示用于实施例13的化学取代。图15显示使用实施例13的修饰的寡核苷酸得到的细胞因子曲线(profile)。图16显示与氨基接头(aminolinker)相比，甘油接头(glycerollinker)的相对细胞因子诱导。图17显示各种接头和接头组合的相对细胞因子诱导。图18A-E显示各种PS和PO致免疫物和寡核苷酸的相对核酸酶抗性(relativenucleaseresistance)。图19显示在BALB/c小鼠脾细胞培养物中，与PS致免疫物相比PO致免疫物的相对细胞因子诱导。图20显示在C3H/Hej小鼠脾细胞培养物中，与PS致免疫物相比PO致免疫物的相对细胞因子诱导。图21显示在C3H/Hej小鼠脾细胞培养物中，在高浓度的致免疫物条件下，与PS致免疫物相比PO致免疫物的相对细胞因子诱导。图22显示致免疫物(IMOs)的序列和化学修饰。图23A和23B显示小鼠中OVA-诱导的Th2免疫应答的IMO预防(prevention)，如通过脾细胞培养物中的细胞因子应答所显示的那样。图24A和24B显示小鼠中OVA-诱导的Th2免疫应答的IMO预防，如通过血清抗体应答所显示的那样。图25显示IMOs1和2对于小鼠中建立的OVA-诱导的变应性哮喘的剂量依赖性影响(dose-dependentefiect)。细胞因子分泌在OVA-回忆应答(OVA-recallresponse)的脾细胞培养物中。IMOs1和2以剂量依赖性的方式显著地抑制IL-5分泌。IL-13被所述两种IMO化合物显著地抑制。两种IMO化合物诱导剂量依赖性的IFN-g分泌。图26显示血清抗原-特异性的抗体和总抗体。IMOs1和2产生OVA-特异性IgE的剂量依赖性减少和OVA-特异性IgG2a的增加。图27显示单次高剂量的IMO化合物相对于多次低剂量的IMO化合物对于初次接受试验的小鼠(navemice)中局部和系统Th1细胞因子水平的影响。单剂量的100mg诱导更高水平的系统性细胞因子应答。与此相反，三次较小剂量(3×33mg)诱导更高的局部(BALF)细胞因子应答。图28显示IMO化合物的低量多次给药(lowmultipleadministration)对于初次接受试验的小鼠中局部和系统细胞因子水平的剂量依赖性影响。当多次以小剂量给药时，IMO1使小鼠中局部(BALF)细胞因子水平，而不是系统细胞因子水平增加。此影响是剂量依赖性的。图29比较了IMO和皮质类甾醇(corticosteriod)在体外的作用。IMO1和布地奈德(budesonide)两者都抑制OVA-诱导的Th2细胞因子分泌。然而，只有IMO1显示强的Th1细胞因子诱导。发明详述本发明涉及寡核苷酸作为免疫刺激剂用于免疫治疗应用的治疗用途。本文中引用的已颁布的(issued)专利、专利申请和参考文献掺入本文作为参考，其程度如同具体而单独地指出将每一篇掺入作为参考。在本文引用的任何文献的任何教导与本发明说明书之间不一致的情况下，对于本发明而言应以后者为准。本发明提供了增强和改进由免疫刺激化合物引起的免疫应答的方法用于免疫治疗应用，如，但不限于，治疗癌症、自身免疫性疾病(autoimmunedisorder)、哮喘、呼吸过敏(respiratoryallergies)、食物过敏(foodallergy)和成年及儿科的(pediatric)人体内细菌、寄生的(parasitic)和病毒的感染和兽医的(veterinary)应用。变应性哮喘是特别优选的用于通过本方法和化合物治疗的病症。因此，本发明还提供具有最佳水平的免疫刺激作用用于免疫治疗的化合物，和用于制备和使用所述化合物的方法。此外，本发明的致免疫物用作佐剂与DNA疫苗、抗体、变应原、化学治疗剂和反义寡核苷酸联用。本发明人已令人吃惊地发现对可选地存在于免疫刺激性寡核苷酸5’末端的修饰显著地影响了其免疫刺激能力。所述寡核苷酸在本文中称为″致免疫物″。在第一个方面，本发明提供致免疫物，其包含在它们3’末端，或核苷间连接或功能化的核碱基或糖与非-核苷酸接头连接的至少两个寡核苷酸，至少所述寡核苷酸中的一个作为免疫刺激性寡核苷酸并具有可接近的5′末端。如本文所使用的，术语“可接近的5’末端”指寡核苷酸的5’末端是充分可用的以致于识别和结合致免疫物并刺激免疫系统的因子具有接近它的通路。在具有可接近的5’末端的寡核苷酸中，末端糖的5’OH位置不与多于两个核苷残基共价连接。可选地，可将所述5′OH连接于磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)部分，芳香族或脂肪族接头，胆固醇(cholesterol)，或不干扰可接近性的其它实体。为了本发明的目的，术语“致免疫物”指任何化合物，其包含在它们3’末端或核苷间连接，或功能化的核碱基或糖直接连接与通过非-核苷酸接头连接的至少两个寡核苷酸，至少所述寡核苷酸中的一个(在致免疫物的上下文中)作为免疫刺激性寡核苷酸并具有可接近的5′末端，其中当给药于脊椎动物(vertebrate)时，所述化合物诱导免疫应答。在一些实施方案中，所述脊椎动物是哺乳动物，包括人。在一些实施方案中，致免疫物包含两个或更多个免疫刺激性寡核苷酸，其(在致免疫物的上下文中)可相同或不同。优选地，每个所述的免疫刺激性寡核苷酸具有至少一个可接近的5’末端。在一些实施方案中，除了免疫刺激性寡核苷酸以外，致免疫物还包含至少一个与基因互补的寡核苷酸。如本文所使用的，术语“与...互补”指在生理条件下寡核苷酸与基因的区域杂交。在一些实施方案中，寡核苷酸下调基因的表达。所述的下调的寡核苷酸优选自反义寡核苷酸、核酶(ribozyme)寡核苷酸、小抑制RNA和诱饵(decoy)寡核苷酸组成的组。如本文所使用的，术语“下调基因”指抑制基因的转录或基因产物的翻译。因此，根据本发明的这些实施方案的致免疫物可用于靶向一个或多个具体的疾病靶物(diseasetarget)，同时也刺激免疫系统。在一些实施方案中，致免疫物包括核酶(ribozyme)或诱饵寡核苷酸。如本文所使用的，术语“核酶”指具有催化活性的寡核苷酸。优选地，核酶与特异的核酸靶物结合并切割该靶物。如本文所使用的，术语“诱饵寡核苷酸”指以序列特异性的方式与转录因子结合并表现转录活性的寡核苷酸。优选地，核酶或诱饵寡核苷酸显示二级结构，其包括，但不限于茎-环(stem-loop)或发卡结构(hairpinstructure)。在一些实施方案中，至少一个寡核苷酸包含poly(I)-poly(dC)。在一些实施方案中，至少一组Nn包括一串3至10个dGs和/或Gs或2’-取代的核糖(ribo)或阿拉伯糖(arabino)Gs。为了本发明的目的，术语“寡核苷酸”指由多个连接的核苷单元形成的多核苷。所述的寡核苷酸可由已存在的核酸来源，包括基因组或cDNA中得到，但优选通过合成方法制备。在优选的实施方案中，每个核苷单元包括杂环的碱基和呋喃戊糖基(pentofuranosyl)、海藻糖(trehalose)、阿拉伯糖(arabinose)、2’-脱氧-2’-取代阿拉伯糖、2’-O-取代阿拉伯糖或己糖基(hexosesugargroup)。核苷残基可通过已知的核苷间连接中的任一种彼此偶联。这样的核苷间连接包括，但不限于，磷酸二酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，烷基膦酸酯(alkylphosphonate)，烷基硫代磷酸酯(alkylphosphonothioate)，磷酸三酯(phosphotriester)，氨基磷酸酯，硅氧烷(siloxane)，碳酸酯(carbonate)，烷氧羰基(carboalkoxy)，乙酰胺化物(acetamidate)，氨基甲酸酯(carbamate)，吗林代(morpholino)，硼烷(borano)，硫醚(thioether)，桥连的氨基磷酸酯(bridgedphosphoramidate)，桥连的亚甲基膦酸酯(bridgedmethylenephosphonate)，桥连的硫代磷酸酯(bridgedphosphorothioate)和砜(sulfone)核苷间连接。术语“寡核苷酸”也包括具有一个或多个立体特异性核苷间连接的多聚核苷(例如，(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或磷酸三酯连接)。如本文所使用的，术语“寡核苷酸”和“二核苷酸”明显地旨在包括具有任意上述核苷间连接的多聚核苷和二核苷，而无论所述的连接是否包含磷酸基团。在一些优选实施方案中，这些核苷间连接可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接，或其组合。在一些实施方案中，每个寡核苷酸具有约3至约35个核苷残基，优选约4至约30个核苷残基，更优选约4至约20个核苷残基。在一些实施方案中，所述的寡核苷酸具有约5-约18或约5-约14个核苷残基。如本文所使用的，术语“约”意味着确切的数字并不重要。因而在所述的寡核苷酸中核苷残基的数目并不重要，具有1或2个较少的核苷残基的寡核苷酸或者有一个至几个额外核苷残基的寡核苷酸，可作为前述的每个实施方案的相等物。在一些实施方案中，一或多种寡核苷酸有11个核苷酸。术语“寡核苷酸”也包括含有额外的取代基的多聚核苷，所述的取代基包括，但不限于，蛋白质基团(proteingroup)，亲脂基团(lipophilicgroup)，嵌入剂(intercalatingagent)，二元胺(diamine)，叶酸(folicacid)，胆固醇和金刚烷(adamantane)，术语“寡核苷酸”也包括任何其它含有聚合物的核碱基，所述的聚合物包括，但不限于，肽核酸(peptidenucleicacid)(PNA)，具有磷酸基团的肽核酸(PHONA)，封闭的核酸(lockednucleicacid)(LNA)，吗林代-骨架寡核苷酸和具有带烷基接头或氨基接头的骨架部分的寡核苷酸。如本文应用的，所述的术语“二级结构”是指分子内和分子间的氢连接连接(hydrogenbonding)。分子内氢连接连接导致茎-环结构的形成，分子间氢连接连接导致双链体核酸分子的形成。本发明的寡核苷酸可以包括天然存在的核苷，经修饰的核苷或其混合物。如本文所使用的，术语“经修饰的核苷”是指包括经修饰的杂环碱基，经修饰的糖基部分，或其组合的核苷。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是如本文所描述的非-天然的嘧啶或嘌呤核苷。在一些实施方案中，经修饰的核苷是2′-取代核糖核苷，阿拉伯糖核苷或2’-脱氧-2’-取代阿拉伯糖苷。为了本发明目的，术语“2′-取代核糖核苷”包括核糖核苷，其中在该戊糖部分的2′位置的羟基被取代而产生2′-O-取代核糖核苷。优选地，这样的取代是以含有1-6个饱和的或不饱和的碳原子的低级烷基，或者以具有6-10个碳原子的芳基取代，其中，所述的烷基或芳基可为未取代的或可为取代的，例如以卤基(halo)，羟基，三氟甲基(trifluoromethyl)，氰基(cyano)，硝基(nitro)，酰基(acyl)，酰氧基(acyloxy)，烷氧基(alkoxy)，羧基(carboxyl)，烷氧羰基(carboalkoxy)或氨基进行取代。2′-O-取代核糖核苷的实例包括，但不限于2′-O-甲基核糖核苷，2′-O-甲基阿拉伯糖苷和2′-O-甲氧基乙基核糖核苷(2′-O-methoxyethylribonucleoside)。术语“2′-取代核糖核苷”也包括其中2′-羟基被含有1-6个饱和或不饱和碳原子的低级烷基所取代或被氨基或卤素基团取代的核糖核苷。所述的2′-取代核糖核苷的实例包括，但不限于，2’-氨基，2’-氟(2’-fluoro)，2’-烯丙基(2’-allyl)和2’-炔丙基(2’-propargyl)核糖核苷。术语“寡核苷酸”包括杂合(hybrid)寡核苷酸和嵌合(chimeric)寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”是具有一个以上类型的核苷间连接的寡核苷酸。所述的嵌合寡核苷酸的一个优选实例是包含硫代磷酸酯，磷酸二酯或二硫代磷酸酯区域和非-离子键例如烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯键的嵌合寡核苷酸(参见，例如Pederson等，美国专利No.5,635,377和5,366,878)。“杂合寡核苷酸”是具有一个以上类型核苷的寡核苷。所述的杂合寡核苷酸的一个优选实例是包含核糖核苷酸或2′取代核糖核苷酸区域，和脱氧核糖核苷酸区域(参见，例如Metelev和Agrawal，美国专利No.5,652,355，6,346,614和6,143,881)。为了本发明的目的，术语“免疫刺激性寡核苷酸”指如上所述的当对脊椎动物，诸如鱼、禽类或哺乳动物施用时诱导免疫应答的寡核苷酸。如本文所使用的，术语“哺乳动物”包括，但不限于大鼠、小鼠、猫、狗、马、牛、奶牛、猪、兔、非人灵长类动物(non-humanprimate)和人。有用的免疫刺激性寡核苷酸的描述可见于1998年11月5日公开的Agrawal等，WO98/49288；2001年2月22日公开的WO01/12804；2001年8月2日公开的WO01/55370；2001年4月30日提交的PCT/US01/13682；和2001年9月26日提交的PCT/US01/30137。优选地，所述免疫刺激性寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷间连接。在一些实施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸包含式5′-Pyr-Pur-3′的免疫刺激性二核苷酸，其中Pyr是天然的或合成的嘧啶核苷而Pur是天然的或合成的嘌呤核苷。如本文所使用的，术语“嘧啶核苷”是指核苷，其中所述核苷的碱基组成是嘧啶碱基。类似地，术语“嘌呤核苷”是指核苷，其中所述核苷的碱基组成是嘌呤碱基。为了本发明目的，“合成的”嘧啶或嘌呤核苷包括非天然存在的嘧啶或嘌呤碱基，非天然存在的糖部分，或其组合。根据本发明优选的嘧啶核苷，具有结构(I)(i)其中D是氢连接供体(hydrogenbonddonor)；D′选自氢、氢连接供体、氢连接受体、亲水基团、疏水基团、吸电子基团或给电子基团；A是氢连接受体或亲水基团；A’选自氢连接受体、亲水基团、疏水基团、吸电子基团和给电子基团；X是碳或氮；和S′是戊糖环或己糖环或非-天然存在的糖。优选地，糖环是利用磷酸部分、修饰的磷酸部分或其它适于连接所述的嘧啶核苷与其它核苷或核苷类似物的接头部分衍生的。优选的氢连接供体包括，但不限于，-NH-，-NH2，-SH和-OH。优选的氢连接受体包括，但不限于，C＝O，C＝S，和芳香杂环中的氮原子，例如，胞嘧啶的N3。在一些实施方案中，(I)中的碱基部分是非天然存在的嘧啶碱基。优选的非天然存在的嘧啶碱基的实例包括，但不限于，5-羟基胞嘧啶(5-hydroxycytosine)，5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine)，N4-烷基胞嘧啶(N4-alkycytosine)，优选N4-乙基胞嘧啶(N4-ethylcytosine)和4-硫尿嘧啶(4-thiouracil)。然而，在一些实施方案中，特别将5-溴胞嘧啶(5-bromocytosine)除外。在一些实施方案中，(I)中的糖部分S′是非天然存在的糖部分。为了本发明之目的，“天然存在的糖部分”是天然作为核酸的一部分存在的糖基，例如，核糖和2′-脱氧核糖，而且“非天然存在的糖部分”是任何不天然作为核酸的一部分存在的糖基，但其可以用作寡核苷酸的骨架，例如，己糖。阿拉伯糖或阿拉伯糖衍生物是优选的糖部分的实例。根据本发明优选的嘌呤核苷类似物具有结构(II)(ii)其中D是氢连接供体；D’选自氢连接、氢连接供体和亲水基团；A是氢连接受体或亲水基团；X是碳或氮；每个L独立地选自C，O，N或S；和S′是戊糖环或己糖环，或非-天然存在的糖。优选地，糖环是用磷酸酯部分、修饰的磷酸酯部分或其它适于将所述的嘧啶核苷与其它核苷或核苷类似物连接的接头部分衍生的。优选的氢连接供体包括，但不限于，-NH-，-NH2，-SH和-OH。优选的氢连接受体包括，但不限于，C＝O，C＝S，-NO2和芳香杂环中的氮原子，例如，鸟嘌呤的N1。在一些实施方案中，(II)中的碱基部分是非天然存在的嘌呤碱基。优选的非天然存在的嘌呤碱基的实例包括，但不限于，6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)和7-脱氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)，在一些实施方案中，(II)中的糖部分S′是天然存在的糖部分，如前面的结构(I)所述。在优选的实施方案中，所述免疫刺激性二核苷酸选自CpG、C*pG、CpG*和C*pG*组成的组，其中C是胞苷或2′-脱氧胞苷，C*是2′-脱氧胸苷、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、阿糖胞苷、2′-脱氧胸苷、2’-脱氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷或极少存在的嘧啶核苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，G*是2′脱氧-7-脱氮-鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2’-脱氧-2’取代的-阿糖鸟苷、2’-O-取代的-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷或极少存在的嘌呤核苷，而且p是选自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的核苷间连接。在一些优选实施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。所述免疫刺激性寡核苷酸可包括在免疫刺激性二核苷酸的一侧或两侧的免疫刺激部分。因此，在一些实施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸包含结构(III)的免疫刺激区域5’-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3’(III)其中Y是胞苷、2’脱氧胸苷、2’脱氧胞苷、阿糖胞苷、2’-脱氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-脱氧胸苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷或其它非天然嘧啶核苷；Z是鸟苷或2′脱氧鸟苷，G*是2’脱氧-7-脱氮鸟苷、2’-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2’-脱氧-2’取代的-阿糖鸟苷、2’-O-取代-阿糖鸟苷、2’脱氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷；N1，每次出现时，优选为天然存在的或合成的核苷或免疫刺激部分，其选自无碱基核苷(abasicnucleoside)、阿糖核苷、2′-脱氧尿苷、α-脱氧核糖核苷、β-L-脱氧核糖核苷，和通过磷酸二酯或修饰的核苷间连接与邻近的核苷在3′侧连接的核苷，所述修饰的核苷间连接选自，而不限于，具有大约2埃(angstrom)至大约200埃长度的接头、C2-C18烷基接头、聚(乙二醇)接头、2-氨基丁基-1，3-丙二醇接头(2-aminobutyl-1，3-propanediollinker)、甘油基接头(glyceryllinker)、2′-5′核苷间连接，和硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间连接；Nn，每次出现时，优选为天然存在的核苷或免疫刺激部分，其选自无碱基核苷、阿糖核苷、2′脱氧尿苷、α-脱氧核糖核苷、2′-O-取代核糖核苷，和通过修饰的核苷间连接与邻近的核苷在3′侧连接的核苷，所述修饰的核苷间连接优选自氨基接头、2′-5′核苷间连接和甲基膦酸酯核苷间连接；假设至少一个N1或Nn是免疫刺激部分；其中n是0至30的数；和其中3’端，其为核苷间接头，或衍生的核碱基或糖，直接或通过非-核苷酸接头与另一个寡核苷酸连接，所述另一个寡核苷酸可为或可不为免疫刺激的。在一些优选的实施方案中，YZ是阿糖胞苷或2’-脱氧-2’-取代的阿糖胞苷和阿糖鸟苷或2’脱氧-2’-取代阿糖鸟苷。优选的免疫刺激部分包括磷酸骨架中的修饰，其包括，但不限于甲基膦酸酯、甲基硫代膦酸酯(methylphosphonothioates)、磷酸三酯、硫代磷酸三酯(phosphothiotriester)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、三酯前药(triesterprodrug)、砜、磺胺(sulfonamide)、氨基磺酸酯、甲乙缩醛(formacetal)、N-甲基羟胺(N-methylhydroxylamine)、碳酸酯、氨基甲酸酯、吗林代、硼膦酸酯(boranophosphonate)、氨基磷酸酯，具体是伯氨基-氨基磷酸酯(primaryamino-phosphoramidate)、N3氨基磷酸酯和N5氨基磷酸酯，和立体特异性的连接(例如，(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或磷酸三酯连接)。根据本发明优选的免疫刺激部分还包括具有糖修饰的核苷，所述糖修饰包括，但不限于2’取代戊糖，其包括，而不限于2’-O-甲基核糖、2’-O-甲氧基乙基核糖、2’-O-炔丙基核糖和2’-脱氧-2′-氟核糖；3’取代的戊糖，其包括，而不限于3’-O-甲基核糖；1′，2′双脱氧核糖；阿糖；取代的阿糖，其包括，而不限于1’甲基阿糖、3’-羟基甲基阿糖、4’羟基甲基阿糖和2’取代的阿糖；己糖，其包括，而不限于1，5-无水己糖醇(1，5-anhydrohexitol)；和alpha-端基异构体(alpha-anomers)。在修饰的糖是3′-脱氧核糖核苷或′-O-取代的核糖核苷的实施方案中，免疫刺激部分通过2′-5核苷间连接与邻近的核苷连接。根据本发明优选的免疫刺激部分还包括具有其它碳水化合物骨架修饰和取代的寡核苷酸，包括肽核酸(peptidenucleicacid)(PNA)、具有磷酸基团的肽核酸(PHONA)、封闭的(locked)核酸(LNA)、吗啉代骨架寡核苷酸，和具有骨架接头部分的寡核苷酸，所述骨架接头部分具有大约2埃至大约200埃的长度，其包括而不限于，烷基接头或氨基接头。所述烷基接头可为分枝的或不分枝的，取代的或不取代的，和手性纯的或外消旋混合物。最优选地，所述烷基接头具有大约2至大约18个碳原子。在一些优选的实施方案中，所述烷基接头具有大约3至大约9个碳原子。一些烷基接头包括一个和多个官能团，所述官能团选自羟基、氨基、硫醇(thiol)、硫醚(thioether)、醚、酰胺、硫代酰胺(thioamide)、酯、脲和硫醚。一些所述功能化的烷基接头是式-O-(CH2-CH2-O-)n(n＝1-9)的聚乙二醇接头。一些其它功能化的烷基接头是肽或氨基酸。根据本发明优选的免疫刺激部分还包括DNA同种型(isoform)，其包括，但不限于β-L-脱氧核糖核苷和α-脱氧核糖核苷。根据本发明优选的免疫刺激部分掺入3’修饰，而且还包括具有非天然核苷间连接位置的核苷，包括，但不限于2’-5’、2′-2′、3’-3’和5’-5’连接。根据本发明优选的免疫刺激部分还包括具有修饰的杂环碱基的核苷，所述杂环碱基包括，但不限于5羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶，优选N4-乙基胞嘧啶、4-硫尿嘧啶、6-硫鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、肌苷、硝基吡咯(nitropyrrole)、C5-丙烯基嘧啶(propynylpyrimidine)和二氨基嘌呤(diaminopurine)，其包括，但不限于2，6-二氨基嘌呤。为了具体的说明而不是为了限制，例如，在结构(III)的免疫刺激区域中，在位置N1或Nn的甲基膦酸酯核苷间连接是免疫刺激部分，具有大约2埃至大约200埃的长度的接头、在位置X1的C2-C18烷基接头是免疫刺激部分，而且在位置X1的β-L-脱氧核糖核苷是免疫刺激部分。免疫刺激部分的代表性位置和结构参见下述表1。可以理解，将接头称为在具体位置免疫刺激部分的意思是将在该位置的核苷残基在其3′-羟基用指定的接头取代，由此在该核苷残基和邻近核苷之间3′侧产生修饰的核苷间连接。类似地，将修饰的核苷间连接称为在具体位置的免疫刺激部分的意思是通过所述的连接将在该位置的核苷残基与邻近的核苷在3’侧连接。表1表2显示具有上游增强区的免疫刺激性寡核苷酸内的免疫刺激部分的代表性位置和结构。如本文所使用的，术语“间隔区(spacer)9”指式-O-(CH2CH2-O)n-的聚(乙二醇)接头，其中n为3。术语“间隔区18”指式-O-(CH2CH2-O)n-的聚(乙二醇)接头，其中n是6。如本文所使用的，术语“C2-C18烷基接头”指式-O-(CH2)q-O-的接头，其中q是2至18的整数。因此，术语″C3-接头″和″C3-烷基接头″指式-O-(CH2)3-O-的接头。对于每个间隔区9、间隔区18和C2-C18烷基接头而言，将所述接头通过磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接连接于邻近的核苷。表2表3显示具有下游增强区的免疫刺激性寡核苷酸内的免疫刺激部分的代表性位置和结构。表3根据本发明的致免疫物包含在它们3’末端核苷间连接或或通过非核苷酸接头在功能化的核碱基或糖进行连接的至少两个寡核苷酸。为了本发明的目的，″非核苷酸接头″是能与寡核苷酸通过共价或非共价连接连接的任何部分。优选所述接头长度为大约2埃至大约200埃。优选的接头的几个实例列在下面。非共价连接包括，但不限于，静电相互作用(electrostaticinteraction)、疏水相互作用(hydrophobicinteraction)、π-堆积相互作用(π-stackinginteraction)，和氢连接连接。术语“非核苷酸接头”并不是指如上所述的核苷间连接，例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯官能团，其直接连接两个核苷的3′-羟基基团。为了本发明的目的，所述的直接3′-3′连接被认为是″核苷酸连接″。在一些实施方案中，所述非核苷酸接头是金属，包括，但不限于金粒子(goldparticle)。在一些其它实施方案中，所述非核苷酸接头是可溶的或不可溶的生物可降解聚合物珠。在又一个实施方案中，所述非核苷酸接头是有机部分，其具有允许与寡核苷酸连接的官能团。所述连接优选通过任何稳定的共价连接连接。作为非限制性的实例，可将接头连接于核苷上任何合适的位置，如图13所示。在一些优选的实施方案中，将接头连接于3′-羟基。在所述实施方案中，接头优选包含羟基官能团，其优选通过磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或非基于磷酸的连接(non-phosphate-basedlinkage)连接于3′-羟基。在一些实施方案中，所述非核苷酸接头是生物分子，其包括，但不限于多肽、抗体、脂质、抗原、变应原和寡糖。在一些其它实施方案中，所述非核苷酸接头是小分子。为了本发明的目的，小分子是具有小于1,000Da的分子量的有机部分。在一些实施方案中，小分子具有小于750Da的分子量。在一些实施方案中，小分子是脂肪族或芳香族碳氢化合物，其每种可选地可包括，以连接寡核苷酸的线状链(linearchain)或附加于其上的形式，一个或多个官能团，其选自羟基、氨基、硫醇、硫醚、醚、酰胺、硫代酰胺、酯、脲(urea)和硫脲(thiourea)组成的组。所述小分子可为环状或非环状的。小分子接头的实例包括，但不限于，氨基酸、碳水化合物、环糊精、金刚烷(adamantane)、胆固醇(cholesterol)、半抗原(hapten)和抗生素(antibiotics)。然而，为了描述非核苷酸接头的目的，术语“小分子”并不意图包括核苷。在一些实施方案中，所述小分子接头是式HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OH的甘油或甘油同源物，其中o和p独立地为1至大约6，1至大约4，或1至大约3的整数。在一些其它实施方案中，所述小分子接头是1，3-二氨-2-羟基丙烷的衍生物。一些所述衍生物具有式HO-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-OH，其中m为0至大约10，0至大约6，2至大约6，或2至大约4的整数。根据本发明的一些非核苷酸接头允许多于两个寡核苷酸的连接，如图1所示。例如，小分子接头甘油具有三个可与寡核苷酸共价连接的羟基。因此，根据本发明的一些致免疫物包含多于两个寡核苷酸，其将它们的3’末端连接于非核苷酸。一些这样的致免疫物包含至少两个免疫刺激性寡核苷酸，每免疫刺激性寡核苷酸具有可接近的5’末端。可使用如图5和6所示并在实施例中进一步描述的自动合成仪和亚磷酰胺方法方便地合成本发明的致免疫物。在一些实施方案中，通过线性合成方法合成致免疫物(参见图5)。如本文所使用的，术语“线性合成”指由致免疫物的一个末端开始呈线性进行到另一末端的合成。线性合成允许将相同的或不相同的(根据长度、碱基组成和/或化学修饰合并的)单体单元掺入致免疫物。合成的可替换模式是“平行合成”，其中合成从中心的接头部分向外进行(参见图6)。如美国专利No.5,912,332所述，附着于固体支持物的接头可以用于平行合成。可替换地，可使用通用的固体支持物(如磷酸盐附着的可控孔度玻璃支持物)。致免疫物的平行合成比线性合成具有几个优势(1)平行合成允许合并相同的单体单元；(2)与线性合成不同，两个(或所有)单体单元同时合成，因而合成的步骤数和合成所需要的时间与单体单元相同；并且(3)减少合成步骤会提高最终致免疫物产物的纯度和收率。通过线性合成或平行合成方案，在合成的最后阶段，致免疫物可方便地用浓缩的氨溶液脱保护，或如亚磷酰胺供应商的推荐，如果合并修饰的核苷。产物致免疫物优选用反相HPLC纯化、脱三苯甲基(detritylate)、脱盐和透析。表4A和4B显示根据本发明的代表性的致免疫物。附加的致免疫物在实施例中描述。表4.致免疫物序列的实例<tablesid="tabl0002"num="0002"></tables>L＝C3-烷基接头；X＝1′，2′-双脱氧核糖核苷；Y＝50HdC；R＝7-脱氮-dG表4B<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="800">SEQIDNO.序列和修饰(5’-3’)1705’-CTGTCRTTCTC-X-CTCTTRCTGTC-5’1715’-TCRTCRTTG-X-GTTRCTRCT-5’1725’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’1735’-TCTGTR’GTTCT-X-TCTTGR’TGTCT-5’1745’-TCRTCRTTG-X-GTTRCTRCT-5’1755’-YYCTGACGTTCTCTGT-X-TGTCTCTTGCAGTCYY-5’</table></tables>X＝甘油接头；R＝阿糖鸟苷；R＝2’-脱氧-7’-脱氮鸟苷，R’＝1-(2’-脱氧-b-D-呋喃核糖基)-2-氧-7-脱氮-8-甲基-嘌呤；Y＝C3-接头在另一个方面，本发明提供了包含至少2个寡核苷酸的免疫刺激核酸，其中该免疫刺激核酸具有二级结构。在该方面，该免疫刺激核酸包含如式(I)详述的结构。A区-B区-C区(I)区域的长度可为大约2至大约12个核苷酸。A区可以是5’-3’或3’-5’或2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它们具有或不具有一个回文区域或自我互补区域，该区域包含或不包含至少一个二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，YpG，YpR，CpR，R*pG和R*pR，其中C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’脱氧鸟苷，Y是胞苷、2′-脱氧胸苷、2′-脱氧胞苷、2’双脱氧-5-卤代胞苷、2’双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2’-脱氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，其它非天然嘧啶核苷，R*是1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧-7-脱氮-8-甲基-嘌呤；R是鸟苷或2′脱氧鸟苷、2′脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2’-脱氧-2’取代的-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷、或其它非天然嘌呤核苷，而p是选自磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯组成的组的核苷间连接。在一些优选的实施方案中，所述免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些实施方案中，A区将具有一个以上二核苷酸，该二核苷酸选自位于A区寡核苷酸的5’端的CpG、YpG、YpR、CpR、R*pG和R*pR。B区是连接A区和C区的接头，其可以是3’-5’连接、2’-5’连接、3’-3’连接，可以是磷酸基团、核苷，或者非核苷接头，所述非核苷接头可为脂肪族的、芳香族的、芳基的、环状的，手性的、非手性的，可以是肽，碳水化合物、脂类、脂肪酸、单-、三-或六聚乙二醇，或者杂环部分。C区可以是5’-3’或3’-5’、2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNAPolyI-PolyC，它们具有或是不具有回文序列或自我互补序列，该序列可具有或不具有二核苷酸，该二核苷酸选自CpG，YqG，YpR，CpR，R*pG和R*pR，其中C是胞苷或2’-脱氧胞苷，G是鸟苷或2’脱氧鸟苷，Y是胞苷、2′-脱氧胸苷、2′-脱氧胞苷、2’双脱氧-5-卤代胞苷、2’双脱氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2’-脱氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，其它非天然嘧啶核苷，R*是1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧-7-脱氮-8-甲基-嘌呤；R是鸟苷或2′脱氧鸟苷、2′脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2’-脱氧-2’取代的-阿糖鸟苷、2′-O-取代-阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷、或其它非天然嘌呤核苷，而p是选自磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯的核苷间连接。在一些优选的实施方案中，所述免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些实施方案中，B区优选为连接A区和C区的寡核苷酸的非-核苷酸接头，其被称为“致免疫物”。在一些优选实施方案中，C区不具有二核苷酸CpG，YpG，YpR，CpR，R*pG或R*pR。在一些实施方案中，式(I)中包含的寡核苷酸的长度是大约2至大约50个核苷酸。在一些实施方案中，式(I)中包含的寡核苷酸的长度是大约12至大约26个核苷酸。通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激核酸会有如式(II)详述的结构。该领域的技术人员将理解，在该分子的3’端有分子内茎环形式的二级结构元件。通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激核酸会有如式(III)详述的结构。式(III)中描述的结构在本文中被称为“末端二聚体(terminaldimer)”，因为两个分子的3’端由于两分子3’端互补允许分子间氢连接结合而封闭。另外，A区和A’区可以相同也可以不相同，B区和B’区可以相同也可以不相同，C区和C’区可以相同也可以不相同。通过非限制性实施例的方式，在该方面的一些实施方案中，免疫刺激核酸将有如式(IV)详细描述的结构。该领域的技术人员将理解，在所描述的分子的3’端有二级结构，这是由于其3’端的互补序列通过氢连接结合在这个区域。在一些实施方案中，分子例如配体可结合在3’-端以利于细胞的摄取或改善分子的稳定性。本发明的一些核酸分子的非限制性的实例显示于表24B-C和25B-C中(参见下文)。在第二个方面，本发明提供致免疫物结合物，其包含如上所述的致免疫物和在除可接近的5’末端以外的位置与致免疫物结合的抗原。在一些实施方案中，非核苷酸接头包含与寡核苷酸结合的抗原。在一些其它的实施方案，所述抗原在除其3’末端以外的位置与寡核苷酸结合。在一些实施方案中，所述抗原产生疫苗效应(vaccineeffect)。抗原优选自与病原体相关的抗原、与癌症相关的抗原、与自身免疫性疾病相关的抗原和与其它疾病，诸如但不限于，兽医的或儿科疾病相关的抗原，或其中所述抗原是变应原。为了本发明的目的，术语“与...相关”的意思是当病原体、癌症、自身免疫性疾病、食物过敏(foodallergy)、皮肤过敏、呼吸过敏(respiratoryallergy)、哮喘或其它疾病存在时，抗原存在，而当病原体、癌症、自身免疫性疾病、食物过敏、皮肤过敏、呼吸过敏或疾病不存在时，抗原也不存在。致免疫物与抗原共价连接，或者它以其它方式与抗原可操作地连接。如本文所使用的，术语“与...可操作连接”指保持致免疫物和抗原两者活性的任何连接。所述可操作连接的非限制性实例包括作为同一脂质体或者其它所述的运载工具(deliveryvehicle)或试剂的一部分。在实施方案中，其中致免疫物与抗原共价连接，所述共价连接优选在致免疫物上除免疫刺激性寡核苷酸的可接近的5′端以外的任何位置。例如，抗原可以附着在核苷间连接上，或连接于非核苷酸接头。可替换地，抗原本身可为非核苷酸接头。在第三个方面，本发明提供药物制剂，其包含本发明的致免疫物或致免疫物结合物和生理上可接受的载体。如本文所使用的，术语“生理上可接受的”指不干扰致免疫物的有效性并与生物系统，诸如细胞、细胞培养物、组织或生物体相容的物质。优选地，所述生物系统是活的生物体，如脊椎动物。如在本文中使用的，术语“载体”包含任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质或本领域已知用于药物制剂的其它物质。可以理解，载体、赋形剂或稀释剂的特性将依赖于具体应用的给药途径。制备包含这些物质的可药用的制剂在例如，Remington’sPharmaceuticalSciences，18thEdition，ed.A.Gennaro，MackPublishingCo.，Easton，PA，1990中描述。在第四个方面，本发明提供了用于在脊椎动物中产生免疫应答的方法，所述方法包括对脊椎动物施用本发明的致免疫物或致免疫物结合物。在一些实施方案中，所述脊椎动物是哺乳动物。为了本发明的目的，术语“哺乳动物”清楚地表示包括人。在优选的实施方案中，对需要免疫刺激的脊椎动物施用所述致免疫物或致免疫物结合物。在根据本发明的该方面的方法中，致免疫物的给药可以通过任何合适的途径，包括，但不限于胃肠外(parenteral)、口服、舌下、经皮、局部、鼻内、肌内、腹膜内(intrperitonal)、皮下、皮内、气溶胶(aerosol)、眼内、气道内、直肠内、阴道、通过基因枪、皮肤贴片或滴眼剂或漱口水形式。致免疫物的治疗组合物的给药可以使用已知的方法以有效减轻疾病的症状或替换性标记的剂量和时间进行。当系统地给药时，所述治疗组合物优选以足够剂量给药以使致免疫物的血浓度(bloodlevel)达到大约0.0001微摩尔至大约10微摩尔。对于局部给药，远远低于此的浓度可为有效的，而高得多的浓度是可以耐受的。优选地，致免疫物的总剂量范围为每位病人每天大约0.001毫克到每公斤体重每天约200毫克。需要同时或顺序地将有效量的本发明的一种或多种治疗组合物给予个人作为单个治疗阶段。在一些优选的实施方案中，根据本发明的致免疫物与疫苗、抗体、细胞毒素剂、变应原、抗生素、反义寡核苷酸、肽、蛋白质、基因治疗载体、DNA疫苗和/或佐剂联合给药以增强免疫应答的特异性或幅度。在这些实施方案中，本发明的致免疫物可不同地作为佐剂和/或产生直接的免疫刺激作用。致免疫物或疫苗，或两者，可选地与免疫原性蛋白质，如钥孔血兰蛋白(keyholelimpethemocyanin)(KLH)、霍乱毒素(choleratoxin)B亚基，或任何其它免疫原的载体蛋白质或非免疫原的载体蛋白质连接。可使用任何适宜佐剂，其包括，但不限于，弗氏完全佐剂(Freund’scompleteadjuvant)、弗氏不完全佐剂(Freund’sincompleteadjuvant)、KLH、单磷酰脂质A(monophosphoryllipidA)(MPL)、明矾(alum)和皂苷(saponins)，其包括QS-21、咪喹莫特(imiquimod)、R848或其组合。Toll-样受体(TLRs)作为感染的传感器起作用并诱导固有的和获得的免疫应答的激活。TLRs识别多种被称为与病原体相关的分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns)(PAMPs)的配体。一旦识别保守的与病原体有关的分子产物，TLRs通过它们细胞内的信号域(signallingdomain)，Toll/白介素-1受体(TIR)域，和下游衔接蛋白质(adaptorprotein)MyD88来激活宿主防御应答(defenseresponse)。树突细胞(Dendriticcell)和巨噬细胞(macrophage)正常地响应Toll-样受体(TLR)配体和细胞因子(例如，白介素-1；IL-6和肿瘤坏死因子(tumournecrosisfactor)，TNF)，它们也产生这些物质；天然杀伤细胞(naturalkiller(NK)cell)和T细胞也参与促炎症回路(pro-inflammatorycircuit)。在通过细菌化合物的TLR刺激之后，先天免疫细胞(innateimmunecell)释放许多(arangeof)细胞因子。TLR配体的一些实例包括，但不限于，脂蛋白；肽聚糖(peptidoglycan)、酵母聚糖(zymosan)(TLR2)、双链RNA、polyI:polyC(TLR3)、脂多糖(lipopolysaccharide)、热休克蛋白质(heatshockprotein)、紫杉酚(taxol)(TLR4)、鞭毛蛋白质(flagellin)(TLR5)和咪唑并喹啉(imidazoquinoline)-R848、瑞喹莫德(resiquimod)、咪喹莫特(imiquimod)；ssRNA(TLR7/8)。为了本发明的此方面的目的，术语“与...联用”是指在治疗相同患者的相同疾病的过程中，并包括以任何顺序施用致免疫物和/或疫苗和/或佐剂，所述顺序包括同时给药，以及相隔多至几天的时间间隔顺序。所述联用治疗也可包括以多于单次的方式给药致免疫物，和/或独立地给药疫苗，和/或独立地给药佐剂。致免疫物和/或疫苗和/或佐剂的给药可通过相同或不同的途径。根据本发明的此方面的方法用于免疫系统的模型研究。所述方法也用于人或动物疾病的预防或治疗处理。例如，所述方法用于儿科和兽医疫苗应用。在第五个方面，本发明提供了用于治疗患有疾病或病症的患者的方法，所述方法包括对所述患者施用根据本发明的致免疫物或致免疫物结合物。在不同的实施方案中，待治疗的疾病或病症是癌症，自身免疫性疾病，气道炎症(airwayinflammation)，炎性疾病、过敏、哮喘或由病原体引起的疾病。病原体包括细菌、寄生虫、真菌、病毒、类病毒(viroid)和蛋白质感染素(prions)。如本发明的第四方面所述进行给药。为了本发明的目的术语“过敏”包括，但不限于，食物过敏、特应性皮炎(atopicdermatitis)、变应性鼻炎(allergicrhinitis)(也称为枯草热(hayfever))、变应性结膜炎(allergicconjunctivitis)、荨麻疹(urticaria)(也称作荨麻疹(hives))、呼吸过敏和对于其它物质如胶乳(latex)、药物和昆虫叮咬的过敏性反应，或通常由过敏性鼻炎-鼻窦炎(allergicrhinitis-sinusitis)和中耳炎(otitismedia)引起的问题。术语“气道炎症”包括，但不限于哮喘。哮喘的具体实例包括，但不限于，变应性哮喘、非变应性哮喘、运动诱发的哮喘(exercised-inducedasthma)、职业性哮喘(occupationalasthma)和夜发性哮喘(nocturnalasthma)。变应性哮喘的特征在于与过敏反应相关并通过称为变应原的物质触发的气道阻塞(airwayobstruction)。变应性哮喘的触发物(trigger)包括，但不限于，空气传播的花粉(airbornepollen)、霉菌(mold)、动物皮屑(animaldander)、屋尘螨(housedustmite)和蟑螂粪(cockroachdropping)。非变应性哮喘由病毒感染、某些药物或空气中存在的刺激物引起，其使鼻子和气道恶化(aggravate)。非变应性哮喘的触发物包括，但不限于，空气传播的粒子(例如，煤、粉笔灰)，空气污染物(例如，烟草烟雾、木头烟雾)，强烈的气味或喷雾(例如，香水(perfume)、家庭清洁剂(householdcleaner)、烹饪烟气(cookingfume)、油漆或清漆(varnish))，病毒感染(例如，感冒、病毒性肺炎(viralpneumonia)、鼻窦炎(sinusitis)、鼻息肉(nasalpolyps))，阿斯匹林敏感性(aspirin-sensitivity)，和胃食管返流疾病(gastroesophagealrefluxdisease)(GERD)。运动诱发的哮喘(EIA)通过激烈的身体活动触发。EIA的症状不同程度地发生在大多数哮喘患者中，并可能作为运动时呼吸寒冷、干燥的空气的结果而被触发。EIA的触发物包括，但不限于，运动时呼吸空气传播的花粉，运动时呼吸空气污染物，患病毒性呼吸道感染时运动，和在寒冷、干燥的空气中运动。职业性哮喘直接与吸入工作场所中存在的刺激物和其它可能有害的物质相关。职业性哮喘的触发物包括，但不限于，烟、化学品、气体、树脂、金属、尘、蒸汽和杀虫剂。如在本文中使用的，术语“自身免疫性疾病”指“自身”蛋白质经受免疫系统攻击的疾病。该术语包括自身免疫性哮喘。不期望受限于任何具体的理论，暴露于细菌的减少可部分地造成变应性疾病，如哮喘、特应性皮炎和鼻炎在发达国家的发病率、严重性和死亡率增加。此假设得到细菌感染或产物能抑制变应性疾病在实验动物模型中的发展的证据和临床研究的支持。在一些序列(CpGDNA)中含有未甲基化的CpG二核苷酸的细菌DNA或合成的寡脱氧核苷酸有力地刺激先天的免疫应答并由此获得免疫性。对于CpGDNA的免疫应答包括先天免疫细胞的激活、B细胞的增殖，Th1细胞因子分泌的诱导，和免疫球蛋白质(Ig)的产生。免疫细胞被CpGDNA激活通过Toll-样受体9(TLR9)发生，所述Toll-样受体9是分子模式识别受体(molecularpatternrecognitionreceptor)。CpGDNAs诱导强的Th1-优势型(dominant)免疫应答，其特征在于IL-12和IFN-γ的分泌。致免疫物(IMOs)单独或作为变应原结合物减少IL-4、IL-5和IgE的产生，并减少变应性哮喘的小鼠模型中嗜酸粒细胞增多。IMO化合物也通过将Th2应答转换为Th1应答来有效地逆转(reverse)确定的特应性嗜酸性粒细胞的气道疾病。含明矾的OVA通常用于在各种小鼠和大鼠模型中建立Th2-优势型免疫应答。所述Th2免疫应答包括增加的IL-4、IL-5和IL-13产生，总的和抗原特异性的IgE，IgG1的血清水平提高，和较低的IgG2a水平。IMO化合物防止并逆转小鼠中确定的Th2-优势型免疫应答。IMO化合物及OVA/明矾对于小鼠的联合-给药减少了IL-4、IL-5和IL-13的产生并诱导在经过抗原再刺激(antigenre-stimulation)的脾细胞培养物中产生IFN-γ。此外，IMO化合物抑制抗原特异性的以及总的IgE并增加这些小鼠中的IgG2a产生。注射OVA/明矾和IMO化合物在小鼠中诱导淋巴细胞抗原-回忆应答(antigen-recallresponse)(Th1-型)，所述小鼠的特征在于低水平的与Th2有关的细胞因子，IgE和IgG1和高水平的与Th1有关的细胞因子和IgG2a。IMO化合物与其它种类抗原，诸如S.masoni卵(egg)和母鸡卵溶菌酶的共同给药(co-administration)在体外和在体内研究中也导致将Th2-响应逆转为Th1-优势型应答。如本文所述，IMO化合物有效地防止了Th2免疫应答的发展并允许强的Th1应答。当Th2细胞因子触发Ig同种型转换为产生IgE和IgG1时，Th1细胞因子IFN-γ诱导B-淋巴细胞产生IgG2a。用OVA/明矾和IMO化合物注射的小鼠比单独用OVA/明矾注射的小鼠，产生较低水平的IL-4、IL-5和IL-13和较高水平的IFN-γ，伴有较低的IgE和IgG1和较高的IgG2a水平。这说明在接受抗原和IMO化合物的小鼠中，Th1-细胞因子诱导和免疫球蛋白质同种型转换(isotypeswitch)之间存在紧密的联系(closelink)。接受OVA/明矾和IMO化合物的小鼠中的血清抗原-特异性的以及总的IgE水平显著低于单独接受OVA/明矾的小鼠中的情况。相比之下，OVA-特异性的IgG1水平与单独用OVA/明矾注射的小鼠(数据未显示)相比无显著地变化，而且总IgG1水平与单独用OVA/明矾注射的小鼠(数据未显示)相比只是轻微地减少。不同的应答可由不同参与控制IgE和IgG1类型转换的机制产生，但两种同种型均受IL-4和IL-13的影响。例如，IL-6在IL-4的存在下促进了B淋巴细胞合成IgG1。在任何根据本发明的方法中，可将致免疫物或致免疫物结合物与任何其它用于治疗疾病或病症的试剂联用给药，所述的疾病或病症不减少致免疫物的免疫刺激作用。为了本发明的此方面的目的，术语“与...联用”是指在治疗相同患者的相同疾病的过程中，并包括以任何顺序施用致免疫物和试剂，所述顺序包括同时给药，以及任何时间间隔顺序，例如从一个紧接着另一个连续给药至相隔多达几天给药。所述联用治疗也可包括以多于单次的方式给药致免疫物，和给药单独的试剂。致免疫物和试剂的给药可通过相同或不同的途径。在任何根据本发明的方法中，用于治疗疾病或病症的试剂包括，但不限于，抗原、变应原或共-刺激分子，诸如细胞因子、趋化因子、蛋白质配体、反式作用因子(trans-activatingfactor)、肽和包含经修饰的氨基酸的肽。此外，所述试剂可包括编码抗原或变应原的DNA载体。本发明提供了包含免疫刺激性寡核苷酸和/或致免疫物的试剂盒，所述致免疫物包含连接在一起的至少两个寡核苷酸，这样所述致免疫物具有一个以上可接近的5’末端，其中至少一个寡核苷酸是免疫刺激性寡核苷酸。在另一个方面，所述试剂盒包含本发明的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫刺激性寡核苷酸结合物和/或致免疫物或致免疫物结合物及生理上可接受的载体。所述试剂盒也将通常包括一套使用说明。下面的实施例旨在进一步说明本发明的一些优选实施方案，而不意味着限制本发明大范围。实施例实施例1合成含有免疫调节部分的寡核苷酸使用自动化DNA合成仪(Expedite8909；PerSeptiveBiosystems，Framingham，MA)，按照图5和6概述的线性合成或平行合成步骤，以1μmol规模合成寡核苷酸。由AppliedBiosystems(FosterCity，CA)得到脱氧核糖核苷亚磷酰胺。由GlenResearch(Sterling，VA)得到1’，2’-双脱氧核糖亚磷酰胺、丙基-1-亚磷酰胺、2脱氧尿苷亚磷酰胺、1，3-双-[5-(4，4’-二甲氧三苯甲基)戊基酰胺基]-2-丙醇亚磷酰胺和甲基亚磷酰胺。由ChemGenes(Ashland，MA)得到β-L-2’-脱氧核糖核苷亚磷酰胺、α-2’-脱氧核糖核苷亚磷酰胺、单-DMT-甘油亚磷酰胺和二-DMT-甘油亚磷酰胺。由Clontech(PaloAlto，CA)得到(4-氨基丁基)-1，3-丙二醇亚磷酰胺。由ReliablePharmaceutical(St.Louis，MO)得到阿糖胞苷亚磷酰胺、阿糖鸟苷、阿糖胸苷和阿糖尿苷。在Hybridon，Inc.(Cambridge，MA)合成阿糖鸟苷亚磷酰胺、阿糖胸苷亚磷酰胺和阿糖尿苷亚磷酰胺(Noronha等(2000)Biochem.，397050-7062)。通过31P和1HNMR光谱表征所有核苷亚磷酰胺。使用正常的偶联循环在具体的位点掺入经修饰的核苷。合成之后，使用浓缩的氢氧化铵使寡核苷酸脱保护并通过反相HPLC纯化，然后是透析。使用之前将钠盐形式的纯化的寡核苷酸冻干(lyophilize)。通过CGE和MALDI-TOFMS检测纯度。实施例2分析脾细胞增殖使用如前所述的标准步骤进行脾细胞增殖的体外分析(参见，例如，Zhao等，BiochemPharma51173-182(1996))。结果显示在图8A中。这些结果说明在较高的浓度，与不具有可接近的5’末端的致免疫物5或具有单一可接近的5’末端的寡核苷酸4相比，具有两个可接近的5’末端的致免疫物6导致更多的脾细胞增殖。致免疫物6也产生比LPS阳性对照更多的脾细胞增殖。实施例3体内脾肿大(Splenomegaly)试验为了测试体外结果到体内模型的可用性，将选择的寡核苷酸给药小鼠并测定脾肿大的程度作为免疫刺激活性水平的指标。将5mg/kg的单剂量腹膜内给药于BALB/c小鼠(雌性，4-6周龄，HarlanSpragueDawleyInc，Baltic，CT)。寡核苷酸给药后72小时处死小鼠，收获脾脏并称重。结果显示于图8B中。这些结果说明，具有两个可接近的5’末端的致免疫物6的免疫刺激作用比寡核苷酸4或致免疫物5大得多。实施例4细胞因子分析通过夹心ELISA测定IL-12和IL-6在脊椎动物细胞，优选BALB/c小鼠脾细胞或人PBMC中的分泌。由PharMingen，SanDiego，CA购实所需的试剂，其包括细胞因子抗体和细胞因子标准物。用PBSN缓冲液(PBS/0.05％叠氮化钠(sodiumazide)，pH9.6)中5μg/mL的适当抗体在4℃过夜温育ELISA平板(Costar)，然后用PBS/1％BSA在37℃封闭30分钟。用PBS/10％FBS适当稀释细胞培养物上清和细胞因子标准，一式三份加入平板中，并在25℃温育2小时。用1μg/mL适当的生物素酰化的(biotinylated)抗体涂覆平板并在25℃温育1.5小时。然后用PBS-T缓冲液(PBS/0.05％Tween20)洗涤平板并在加入抗生蛋白质链菌素结合的过氧化物酶(streptavidinconjugatedperoxidase)(Sigma，St.Louis，MO)之后进一步在25℃温育1.5小时。将该平板用SureBlueTM(Kirkegaard和Perry)显色试剂显色并通过加入终止溶液(StopSolution)(Kirkegaard和Perry)来终止反应。在Ceres900HDISpectrophotometer(Bio-TekInstruments)上测定颜色变化。结果显示于下面的表5A中。从健康志愿者的外周血中通过Ficoll-Paque密度梯度离心(Histopaque-1077，Sigma，St.Louis，MO)分离人外周血单核细胞(Humanperipheralbloodmononuclearcells)(PBMCs)。简言之，将肝素化血(heparinizedblood)铺在圆锥离心机中的Histopaque-1077(等体积)上并在400xg在室温离心30分钟。小心除去含有单核细胞的血沉棕黄层(buffycoat)并用等渗的(isotonic)磷酸盐缓冲盐水(PBS)通过在250xg离心10分钟来洗涤两遍。然后将得到的细胞沉淀在含有L-谷氨酰胺(MediaTech，Inc.，Herndon，VA)的RPMI1640培养基中重悬并补加10％热失活的FCS和青霉素-链霉素(100U/ml)。在24孔板中以1×106细胞/ml/孔，在存在或不存在寡核苷酸的条件将细胞培养不同的时间。在培育期的末尾，收获上清液并在-70℃冷冻保存，直到通过夹心ELISA测定不同的细胞因子，其包括IL-6(BDPharmingen，SanDiego，CA)、IL-10(BDPharmingen)、lL-12(BioSourceInternational，Camarillo，CA)、IFN-α(BioSourceInternational)和-γ(BDPharmingen)和TNF-α(BDPharmingen)。此结果显示于下面的表5和5A中。在所有实例中，细胞培养物上清液中IL-12和IL-6的水平由标准曲线计算，所述标准曲线分别在IL-12和IL-6的相同实验条件下构建。IL-10、IFN-gamma和TNF-α在细胞培养物上清液中的水平由标准曲线计算，所述标准曲线分别在IL-10、IFN-gamma和TNF-α的相同实验条件下构建。表5.人PBMC培养物中的致免疫物结构和免疫刺激活性D1和D2是供体1和2。表5A.BALB/c小鼠脾细胞培养物中的致免疫物结构和免疫刺激活性正体代表硫代磷酸酯连接；斜体代表磷酸二酯连接。此外，图7A-C所示的结果说明，浓度低于分别具有一个或零个可接近的5’末端的寡核苷酸1或3时，具有两个可接近的5’末端的寡核苷酸2使IL-12和IL-6升高，但不使IL-10升高。实施例5链长对于致免疫物的免疫刺激活性的影响为了研究寡核苷酸链的长度的影响，合成了在每条链中含有18、14、11和8个核苷酸的致免疫物并检测了免疫刺激活性，如通过它们诱导细胞因子IL-12和IL-6在BALB/c小鼠脾细胞培养物中分泌的能力(表6-8)所测定的。在此和所有后续的实施例中，如实施例4所述在BALB/c脾细胞培养物中进行细胞因子试验。表6.致免疫物结构和免疫刺激活性表7.致免疫物结构和免疫刺激活性表8.致免疫物结构和免疫刺激活性该结果显示，当寡核苷酸链的长度从18-mers减少到7mers时，致免疫物的免疫刺激活性增加。具有短如6-mers或5mers的寡核苷酸链长的致免疫物显示可与具有单5’末端的18-mer寡核苷酸相当的免疫刺激活性。然而，当接头的长度为大约2埃至大约200埃时，具有短如6-mers或5mers的寡核苷酸链长的致免疫物具有增加的免疫刺激活性。实施例6含有非天然嘧啶或非天然嘌呤核苷的致免疫物的免疫活性如表9-11所示，对于在免疫刺激性二核苷酸基序中具有非天然嘧啶核苷或非天然嘌呤核苷的不同长度的致免疫物而言，免疫刺激活性得以保持。表9.致免疫物结构和免疫刺激活性表10.致免疫物结构和免疫刺激活性表11.致免疫物结构和免疫刺激活性实施例7接头对于免疫刺激活性的影响为了检测连接两个寡核苷酸的接头的长度的影响，合成了含有同样寡核苷酸但含有不同接头的致免疫物并检测了免疫刺激活性。表12所示的结果说明，接头长度在致免疫物的免疫刺激活性中起重要作用。用C3-至C6-烷基接头或具有散布的磷酸盐/酯电荷(interspersedphosphatecharge)的无碱基接头获得最佳的免疫刺激作用。表12.致免疫物结构和免疫刺激活性实施例8寡核苷酸骨架对于免疫刺激活性的影响通常，含有天然磷酸二酯骨架的免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激性比具有硫代磷酸酯骨架的同样长度的寡核苷酸低。此较低程度的免疫刺激活性可部分归因于磷酸二酯寡核苷酸在实验条件下的快速降解。寡核苷酸的降解主要是3′-外切核酸酶(3′-exonuclease)的结果，所述酶从3’末端消化寡核苷酸。此实施例的致免疫物不包含自由的3’末端。因此，具有磷酸二酯骨架的致免疫物在实验条件下应具有比对应的单体寡核苷酸更长的半衰期(halflife)，并由此应显示改进的免疫刺激活性。表13中显示的结果说明了此影响，其中通过BALB/c小鼠脾细胞培养物中的细胞因子诱导测定，致免疫物84和85显示免疫刺激活性。表13.致免疫物结构和免疫刺激活性L＝C3-接头实施例9致免疫物73-92的合成使用自动化DNA合成仪(Expedite8909；PerSeptiveBiosystems，Framingham，MA)，以1μmol规模合成寡核苷酸。由AppliedBiosystems(FosterCity，CA)得到脱氧核苷亚磷酰胺。由GlenResearch(Sterling，Virginia)得到7-脱氮-2’-脱氧鸟苷亚磷酰胺。由ChemGenes(Ashland，MA)得到1，3-双-DMT-甘油-CPG。使用正常的偶联循环在具体的位点掺入修饰的核苷。合成之后，使用浓缩的氢氧化铵使寡核苷酸脱保护并通过反相HPLC纯化，然后是透析。使用之前将钠盐形式的纯化的寡核苷酸冻干。通过CGE和MALDI-TOFMS(BrukerPronexIIIMALDI-TOF质谱仪)检测寡核苷酸的纯度。实施例10致免疫物稳定性将寡核苷酸在含有10％牛血清的PBS中在37℃温育4、24或48hours。通过毛细管凝胶电泳测定完整的寡核苷酸。结果在表14中显示。表14.10％牛血清PBS溶液中消化寡核苷酸X＝C3-接头，U，C＝2’-OMe-核糖核苷实施例11可接近的5’末端对于免疫刺激活性的影响在RPMI完全培养基中培养BALB/c小鼠(4-8周)脾细胞。在补加10％(v/v)FCS和抗生素(100IU/mL的氨苄青霉素G/链霉素)的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(Dulbecco’smoddiedEagle’smedium)中培养鼠科巨噬细胞-样细胞J774(美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，Rockville，MD)。所有其它培养试剂购自Mediatech(Gaithersburg，MD)。对于IL-12和IL-6进行ELISA。在24-孔盘中将BALB/c小鼠脾或J774细胞分别以5×106或1×106细胞/mL的密度铺板。将溶于TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.5，1mMEDTA)的IMO化合物以0.03、0.1、0.3、1.0、3.0或10.0μg/mL的终浓度加入小鼠脾细胞培养物，并以1.0、3.0或10.0μg/mL的终浓度加入J774细胞培养物。然后将细胞在37℃温育24hr并收集上清液用于ELISA试验。对于每种浓度一式三份的每种IMO化合物进行两次或三次实验。通过夹心ELISA测定IL-12和IL-6的分泌。所需的试剂，包括细胞因子抗体和标准物购自PharMingen。用5μg/mL在PBSN缓冲液(PBS/0.05％叠氮化钠，pH9.6)中适当的抗体在4℃过夜温育ELISA板(Costar)，然后用PBS/1％BSA在37℃封闭30分钟。用PBS/1％BSA适当地稀释细胞培养物上清液和细胞因子标准物，一式三份加入平板，并在25℃温育2hr。洗涤平板并用1μg/mL适当的生物素酰化的抗体温育并25℃温育1.5hr。用PBS/0.05％Tween20彻底洗涤平板，在加入抗生蛋白质链菌素(streptavidine)-结合的过氧化物酶(Sigma)之后进一步在25℃温育1.5hr。用SureBlueTM(Kirkegaard和Perry)显色试剂将平板显色，并通过加入StopSolution(Kirkegaard和Perry)来终止反应。在Ceres900HDI分光光度计(Bio-TekInstruments)上在450nm测定颜色变化。由标准曲线计算IL-12和IL-6在细胞培养物上清液中的水平，所述标准曲线是在相同实验条件下分别对于IL-12和IL-6构建的。结果显示于表15中。表15本研究中使用的硫代磷酸酯CpGDNA序列和修饰aa参见图示I的化学结构b-l；5’-CG-3’二核苷酸显示为加下划线图示1表16.通过CpGDNA-结合物在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-12和IL-6分泌a参见表1的序列。总之，目前的结果显示，CpGDNA的可接近的5’-端是最佳的免疫刺激活性所需的，而且较小的基团如硫代磷酸酯、单核苷酸或二核苷酸不有效地封闭CpGDNA的5’-端对于涉及免疫刺激途径的受体或因子的可接近性。然而，和荧光素一样大或更大的分子在CpGDNA的5’-端的结合可去消免疫刺激活性。这些结果对于CpGDNA-抗原/疫苗/单克隆抗体(mAb)结合物的免疫刺激活性的研究具有直接影响。大分子如疫苗或mAbs在CpGDNA的5’-端的结合可导致CpGDNA的亚最佳(suboptimal)免疫刺激活性。功能配体在CpGDNA的3’-端的结合不仅有助于增加核酸酶稳定性，而且有助于在体内增加CpGDNA的免疫刺激效力(potency)。实施例12接头对于细胞因子分泌的影响为此研究合成了如下的寡核苷酸。能将这些修饰的寡核苷酸中的每个掺入致免疫物。表17-显示取代位置的CpGDNA的序列a参见图14取代1-9的化学结构。所有CpGDNAs为硫代磷酸酯骨架修饰的。为了评价用于增强免疫刺激活性的最佳接头大小，测定了BALB/c小鼠脾细胞培养物中由修饰的CpGDNAs诱导的IL-12和IL-6分泌。所有CpGDNAs诱导浓度依赖性IL-12和IL-6分泌。图15显示利用1μg/mL浓度的所选CpGDNAs，116，119，126，130，和134得到的数据，所述的CpGDNA与亲代CpGDNA相比在CpG二核苷酸的5’-侧翼序列中第5个核苷酸位置具有接头。所述CpGDNAs，其含有C2-(1)，C3-(2)，和C4-接头(3)，诱导与亲代CpGDNA4类似的产生IL-12的分泌。在CpG二核苷酸的5’-侧翼序列中第5个核苷酸位置含有C6和C9-接头(4和5)的CpGDNA，诱导比亲代CpG更低水平的IL-12分泌(图15)，这说明取代长于C4-接头的接头导致较低水平的IL-12的诱导。所有五种具有接头的CpGDNAs诱导的IL-6分泌比亲代CpGDNA高两到三倍。这些CpGDNAs中接头的存在相对于不具有接头的CpGDNAs显示对于诱导IL-6的显著作用。然而，我们未观察到对于IL-6分泌的长度-依赖性的接头作用。为了研究含有乙二醇-接头的CpGDNA对于免疫刺激活性的影响，我们合成了CpGDNAs137和138，其中分别将三甘醇(triethyleneglycol)-接头(6)掺入CpG二核苷酸的5’-侧翼序列中第5个核苷酸位置和CpG二核苷酸的3’-侧翼序列中第4个核苷酸位置。类似地，CpGDNAs139和140分别包含掺入CpG二核苷酸的5’-或3’-侧翼序列的六乙烯乙二醇-接头(hexaethyleneglycol-linker)(7)(137-140)与亲代CpGDNA4相比，在BALB/c小鼠脾细胞培养物中测试。所有四种修饰的CpGDNAs对细胞因子(IL-12、IL-6和IL-10)的诱导。所有CpGDNAs在检测的浓度范围(0.03-10.0μg/mL)诱导浓度-依赖性细胞因子产生(数据未显示)。浓度为0.3μg/mL的CpGDNAs137-140所诱导的细胞因子的水平显示于表18。在5’-侧翼序列中具有乙二醇-接头的CpGDNAs137和139，比亲代CpGDNA4诱导更高水平的IL-12(2106±143和2066±153pg/mL)和IL-6(2362±166和2507±66pg/mL)分泌(表18)。在相同浓度，137和139比亲代CpGDNA诱导稍低水平的IL-10分泌(表18)。在3’-侧翼序列中具有较短乙二醇-接头(6)的CpGDNA138，诱导与亲代CpGDNA类似的IL-12分泌，但其诱导的IL-6和IL-10的水平显著较低(表18)。具有较长乙二醇-接头(7)的CpGDNA140与亲代CpGDNA相比，诱导显著较低水平的全部三种受试细胞因子(表18)。虽然三甘醇-接头(6)具有类似于C9-接头(5)的链长，但含有三甘醇-接头的CpGDNA比含有C9-接头的CpGDNA具有更好的免疫刺激活性，如通过在脾细胞培养物中诱导细胞因子分泌所测定的那样。这些结果表明以含有较长烷基-接头(4和5)的CpGDNA观察到的较低的免疫刺激活性可与它们的长度增加无关，但与它们的疏水特性有关。此观察促使我们研究含有亲水官能团的分支的烷基-接头的取代对于免疫刺激活性的影响。表18.由BALB/c小鼠脾细胞培养物中含有乙二醇-接头的CpGDNAs诱导的细胞因子分泌。为了测试含有分支的烷基-接头的CpGDNA对于免疫刺激活性的影响，、将包含羟基(8)或胺(9)官能团的两种分支的烷基接头掺入亲代CpGDNA4中并测定所得经修饰的CpGDNAs对于免疫刺激活性的影响(150-154-表19)。用在不同核苷酸位置含有氨基-接头9的CpGDNAs150-154在BALB/c小鼠脾细胞培养物(增殖)和体内(脾大(splenomegaly))得到的数据显示于表19中。表19.含有氨基丁酰(aminobutyryl)丙二醇-接头的CpGDNA诱导BALB/c小鼠脾细胞培养物中的脾细胞增殖和BALB/c小鼠中的脾大。亲代CpGDNA4在0.1μg/mL的浓度显示3.7±0.8的增殖指数(proliferationindex)。在相同浓度，在不同位置含有氨基-接头9的修饰的CpGDNAs151-154与亲代CpGDNA相比引起更高的脾细胞增殖(表19)。如用其它接头所观察的，当取代发生在CpG二核苷酸(150)附近时，与亲代CpGDNA相比显示了较低的增殖指数(表19)，这进一步证实了将接头取代放置于CpG二核苷酸附近对于免疫刺激活性具有有害影响(detrimentaleffect)。通常，5’-侧翼序列(151和152)中用2’-脱氧核糖核苷的氨基-接头的取代比3’-侧翼序列(153和154)中的所述取代产生更高的脾细胞增殖。在脾大试验中观察到类似的结果(表19)，这证实了在脾细胞培养物中观察到的结果。含有甘油-接头(8)的经修饰CpGDNA显示的免疫刺激活性类似于或稍高于对于含有氨基-接头(9)的经修饰CpGDNA所观察到的活性(数据未显示)。为了比较含有接头8和9的CpGDNA的免疫刺激作用，我们选择了在5’-侧翼序列具有取代的CpGDNA145和152，并测定了它们在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导细胞因子IL-12和IL-6分泌的能力。CpGDNAs145和152两者都诱导浓度-依赖的细胞因子分泌。图4显示与亲代CpGDNA4相比，在小鼠脾细胞培养物中通过145和152以0.3μg/mL浓度诱导的IL-12和IL-6的水平。两种CpGDNAs比亲代CpGDNA4诱导更高水平的IL-12和IL-6。含有甘油-接头(8)的CpGDNA比含有氨基-接头(9)的CpGDNA诱导稍高水平的细胞因子(尤其是IL-12)(图16)。这些结果进一步证实含有亲水基团的接头对于CpGDNA的免疫刺激活性更有利。我们研究了CpGDNA中多接头取代的两个不同方面。在一组实验中，我们将核苷酸序列的长度保持为13-mer，并将一种在5’-端掺入五个C3-接头(2)取代(120-124)。这些修饰的CpGDNAs允许我们研究接头长度增加的影响，而不导致溶解度问题。在第二组实验中，我们在CpG二核苷酸的5’-侧翼序列中的相邻位置掺入两个相同的接头取代(3、4或5)，以研究是否对于免疫刺激活性会有任何附加的效果。与亲代CpGDNA4相比，研究修饰的CpGDNAs诱导BALB/c小鼠脾细胞培养物中的细胞因子产生的能力。所有CpGDNAs诱导浓度-依赖的细胞因子产生。以1.0μg/mL浓度的CpGDNAs得到的数据显示于表20。在此试验中，亲代CpGDNA4以1μg/mL的浓度诱导967±28pg/mL的IL-12、1593±94pg/mL的IL-6和14±6pg/mL的IL-10分泌。表20中提供的数据显示，随着接头取代数目的减少IL-12诱导减少。然而，通过CpGDNAs123和124诱导较低水平的IL-12分泌可为长度较短的CpGDNAs的结果。我们对短于15-核苷酸的未修饰的CpGDNA的研究显示不显著的免疫刺激活性(数据未显示)。长度或接头取代数目都不对IL-6分泌具有更小的影响。虽然IL-10分泌随接头取代增加，但这些CpGDNAs的总IL-10分泌是最少的。对于在CpG二核苷酸的5’-侧翼序列的第四个和第五个位置含有两个接头取代(接头3-127；接头-4-131；接头-5-135)的CpGDNAs和相应的5’-截断变体(version)128，132和136，测定它们在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导细胞因子分泌的能力。以1.0μg/mL浓度分泌的IL-12和IL-6的水平显示于图17。图17提供的结果显示，免疫刺激活性取决于掺入的接头的性质。用C4-接头3(CpGDNA127)取代第四个和第五个核苷与亲代CpGDNA4相比对于细胞因子分泌具有不显著的作用，这说明在这些位置的核碱基和糖环(sugarring)对于受体识别和/或结合不是必需的。接头取代以外的核苷酸缺失(CpGDNA128)产生的IL-12和IL-6分泌比用CpGDNAs4和127得到的更高。正如所料，两个C6-接头(4)的取代导致IL-12分泌低于通过亲代CpGDNA4诱导的水平，而IL-6分泌与通过亲代CpGDNA4诱导的水平类似。5’-截短的CpGDNA132诱导比利用CpGDNA131时更高的细胞因子分泌。具有两个C9-接头(5)的CpGDNAs135和136诱导不显著的细胞因子分泌，这证实了以含有与上述相同的接头的单-取代CpGDNA获得的结果。实施例13磷酸二酯连接对于细胞因子诱导的影响为了测定磷酸二酯连接对于致免疫物-诱导的细胞因子诱导的影响，合成了如下分子。表21PO-致免疫物序列和分析数据a箭头在每个DNA分子中表示CpG二核苷酸的5’-3’方向性，X和Y的结构在方框中显示。b分别代表硫代磷酸酯和磷酸二酯骨架。c如通过MALDI-TOF质谱所测定的。以PO-CpGDNA155作为对照发现PS-CpGDNA4(表21)在小鼠中诱导免疫应答(数据未显示)。PO-致免疫物156和157每个包含两个相同的、截断的亲代CpGDNA155的拷贝，其通过它们的3’-端经甘油基接头X(表21)连接。虽然156和157每个包含相同的14个碱基的寡核苷酸区段，但157的5’-端通过加入两个C3-接头Y(表21)来修饰。所有寡核苷酸4、155-157包含已知可激活小鼠免疫系统的′GACGTT′六聚体基序(hexamericmotif)。PO-致免疫物抗核酸酶的稳定性通过在含有10％胎牛血清(FBS)(非-热-失活)的细胞培养基中在37℃将CpGDNAs4、155-157培养4、24和48小时来进行评估。然后通过CGE测定反应混合物中残留的完整CpGDNA。图18A-D显示在10％FBS保温24hr的CpGDNAs4、155-157的核酸酶消化图谱(digestionprofile)。在每个时间点残留的全-长CpGDNA的量显示于图18E中。正如所料，亲代PS-CpGDNA4对于血清核酸酶是最有抗性的。大约55％的18-mer4在48hr保温后保持不降解。与此相反，在相同实验条件下在4hr后只剩余大约5％的全-长PO-致免疫物155，这证实了含有磷酸二酯连接的DNA经过了快速降解。正如所料，PO-致免疫物156和157对于血清核酸酶的抗性都高于155的所述抗性。4hr后，大约62％的156和73％的157是完整的，与此相比大约5％的155是完整的(图18E)。甚至48hr之后，分别大约23％的156和37％的157保持不降解。也显示3’-3’-连接的PO-致免疫物对于血清核酸酶更稳定，这些研究表明在5’-端的化学修饰可进一步增加核酸酶稳定性。在BALB/c和C3H/HeJ小鼠脾细胞培养物中，通过测定分泌的细胞因子IL-12和IL-6的水平来研究CpGDNAs的免疫刺激活性。所有CpGDNAs在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导浓度-依赖性的细胞因子分泌(图19)。在3μg/mL时，PS-CpGDNA4分别诱导2656±256和12234±1180pg/mL的IL-12和IL-6。除了在10μg/mL的浓度，亲代PO-CpGDNA155不将细胞因子水平提高到背景之上。此观察与核酸酶稳定性试验的结果一致。与此相反，PO-致免疫物156和157在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导IL-12和IL-6两者分泌。图19中提供的结果显示PS-和PO-CpGDNAs的细胞因子诱导谱中的清楚的区别。与PS-CpGDNA4相比，PO-致免疫物156和157在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导更高水平的IL-12(图19A)。相比之下，在浓度高达3μg/mL时，它们产生可忽略量的IL-6(图19B)。甚至在最高浓度(10μg/mL)，PO-致免疫物156诱导的IL-6显著少于PS-CpGDNA4的情况。C3接头在PO-致免疫物157的5’-末端的存在与156相比导致稍高水平的IL-6分泌。然而，重要地，由PO-致免疫物157产生的IL-6的水平比由PSCpGDNA4诱导的水平低得多。图19A的插页(inset)显示以3μg/mL浓度分泌时IL-12对IL-6的比例。除了增加IL-12分泌，与PS-CpGDNA4相比，PO-致免疫物156和157在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导更高水平的IFN-γ(数据未显示)。BALB/c小鼠脾细胞培养物中由PO-和PS-CpGDNAs诱导的不同的细胞因子图谱促使我们研究C3H/HeJ小鼠脾细胞培养物(LPS较低-应答株)中CpGDNAs的细胞因子诱导的模式。在此试验中测试的所有三种CpGDNAs诱导浓度-依赖性的细胞因子分泌(图20A和B)。由于PO-CpGDNA155不能在BALB/c小鼠脾细胞培养物中诱导细胞因子分泌，就没有进一步在C3H/HeJ脾细胞培养物中测试它。PO-致免疫物156和157与PSCpGDNA4相比都诱导更高的IL-12生产(图20A)。然而，在浓度高达3μg/mL时，它们都不诱导IL-6生产。在测试的最高浓度(10μg/mL)，它们诱导的IL-6都显著少于PS-CpGDNA4的情况(图20B)。计算分泌的IL-12对IL-6的比例以区分PS和POCpGDNAs的细胞因子分泌图谱(图20A插页)。此外，C3H/HeJ脾细胞培养物结果显示，以CpGDNAs观察到的应答不是因为LPS污染(contamination)。已显示PS-CpGDNAs在体内诱导强抗癌活性。由于PO-CpGDNAs在体外试验中显示更高的核酸酶稳定性并诱导更高水平的IL-12和IFN-γ分泌，我们想要查看PO-致免疫物的这些所需性质是否改进体内抗癌活性。我们对裸鼠以每隔一天0.5mg/kg的剂量皮下给药PO-致免疫物157，所述裸鼠含有表达野生型p53的MCF-7乳腺癌(breastcancer)细胞，或表达突变p53的DU-145前列腺癌细胞的肿瘤异种移植物(tumorxenograft)。与盐水对照(salinecontrol)相比，PO-致免疫物157在第15天导致MCF-7肿瘤的57％生长抑制(图21A)。它也在第34天产生DU-145肿瘤的52％生长抑制(图21B)。这些抗肿瘤研究显示建议设计的PO-致免疫物在体内显示强抗肿瘤活性。实施例14短致免疫物为了测试短致免疫物对于细胞因子诱导的作用，使用了如下致免疫物。这些结果显示短如每个区段5个核苷酸的致免疫物在诱导细胞因子产生中是有效的。表22.BABL/C小鼠脾细胞培养物中的致免疫物结构和免疫刺激活性正体代表硫代磷酸酯连接。实施例15人B细胞和浆细胞样树突细胞(plasmacytoiddendriticcell)(pDCs)的分离。将来自新鲜抽取的健康志愿者血液的PBMCs(CBRLaboratories，Boston，MA)通过Ficoll密度梯度离心方法(Histopaque-1077，Sigma)进行分离，并从PBMCs中通过阳性选择，根据制造商的说明使用CD19细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)来分离B细胞。实施例16B细胞增殖试验用0.3、1.0、3.0或10.0μg/mL浓度的CpGDNAs刺激总共1×105B细胞/200μl64hr，然后用0.75μCi的[3H]-胸苷脉冲(pulse)并在8h以后收获。使用液体闪烁计数器(liquidscintillationcounter)测定放射性的掺入。表23显示在终浓度10.0μg/mL的6CpGDNAs的B细胞增殖平均值±SD。表23.人B-细胞增殖试验中的致免疫物结构和免疫刺激活性(72hs)正体代表硫代磷酸酯连接；下划线代表2’-OMe核糖核苷酸；斜体代表磷酸二酯连接。实施例17人pDC培养物和IFN-αELISA。根据制造商的说明使用BDCA-4细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)，从人PBMCs中分离pDCs。使用1×106细胞/mL，200μL/孔将pDC铺于96-孔平板。将终浓度为0.3、1.0、3.0或10.0μg/mL的CpGDNAs加入细胞培养物并在37℃保温24hr。然后收获上清液并使用人IFN-aELISA试剂盒(PBL)分析IFN-α。表24A-24C显示在1.0和10.0μg/mL的浓度条件下，6CpGDNAs的IFN-α平均值±SD。表24A.人树突细胞试验中的致免疫物结构和免疫刺激活性(72hs)表24B.人树突细胞试验中的致免疫物结构和免疫刺激活性(24hs)表24C.人树突细胞试验中的致免疫物结构和免疫刺激活性(24hs)实施例18如上面在实施例4中讨论的从健康志愿者的外周血中分离并制备人外周血单核细胞(Humanperipheralbloodmononuclearcell)(PBMCs)。表25A-25C显示在10.0μg/mL的浓度条件下，5IMO化合物的IL-6、L-12和IL-γ的平均值±SD。表25A.人PBMC试验中的致免疫物结构和免疫刺激活性(72hs)表25B.人PBMC试验中的致免疫物结构和免疫刺激活性(24hs)表25C.人PBMC试验中的致免疫物结构和免疫刺激活性(24hs)单独地对表23、24A-24C和25A-25C来说正体代表硫代磷酸酯连接；下划线代表2’-OMe核糖核苷酸；斜体代表磷酸二酯连接，而且R、R1、X和X1定义如下实施例19脾细胞研究由Taconic农场(Germantown，NY)得到5-6周龄的雌性BALB/c小鼠并保持无-OVA的饮食。将五只小鼠的组用于免疫研究。如上所述合成、纯化和分析IMO化合物(图22)。将每只小鼠通过在第0和14天皮下(s.c.)注射与等体积明矾溶液(Imject-Alum，Pierce，Rockford，IL)混合的100-μlPBS中的10-μg鸡卵清蛋白质(chickenovalbumin)(OVA；V级，Sigma，St.Louis，MO)来致敏，并用40-μlPBS中的20-μgOVA在第28、29和30天进行鼻内(i.n.)攻击(challenge)(图2)。在第33、37、40和43天将溶于200μlPBS的IMOs1和2(30或60μg)皮下注射入小鼠。在第33天通过眶后穿刺(retro-orbitalpuncture)首次注射IMO化合物2h后收集来自麻醉中的小鼠的血样，并收获血清用于细胞因子试验。在第44天用40-μlPBS中的10-μgOVA鼻内攻击每只小鼠。使小鼠出血并在最后的OVA攻击24h后移除肺和脾。在冷的RPMI1640培养基(Sigma)中制备单个脾-细胞的悬浮液并对于每个实验组以5×106细胞/ml收集到含有10％FCS(HyClone，Logan，UT)和100-μg/ml青霉素和100-U/ml链霉素(HyClone)的RPMI1640培养基中。将脾细胞(0.2ml/孔)在96-孔平底培养平板(Costar，Cambridge，MA)中在100-μg/mlOVA存在的条件下，在37℃在5％CO2气氛中培养。72-h培养后，收获培养上清液用于细胞因子试验。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)用来自BDBiosciences(SanDiego，CA)的小鼠抗体测定IL-5、IL-10、IL-12和IFN-γ的水平。根据制造商的说明，用小鼠DuoSetELISA试剂盒(R&DSystem，Minneapolis，MN)评估IL-6和IL-13的水平。通过ELISA在小鼠血清中评价OVA-特异性的以及总的IgE和IgG2a的水平。对于OVA-特异性的Ig检测，用PBS，pH9.6中的10-μg/mlOVA涂覆96-孔ELISA平板(Immulon2；Dynatech，Chantilly，VA)。对于总Ig检测，用1-μg/ml抗-小鼠IgE(克隆R35-72)和1-μg/ml抗-小鼠IgG2a(克隆R11-89)涂覆平板。在4℃培养过夜之后，用1％BSA/PBS，pH7-4在室温封闭平板1h。将连续稀释的血清(对于IgE为1∶10，对于IgG2a为1∶100)加入平板，并在室温培养2h。洗涤平板并将100μl/孔的生物素酰化的抗-小鼠IgE(克隆R35-116)以0.25μg/ml，或IgG2a(克隆R19-15)以0.25μg/ml加入平板，并在室温保温2h。所有抗体都从BDBiosciences获得。洗涤平板并加入100μl/孔的0.25-μg/ml抗生蛋白质链菌素-过氧化物酶(Sigma)在室温保温1-h。试验在100μl/孔的TMBSubstrateSolution(KPL，Gaithersburg，MD)中显色，然后加入100μl/孔的StopSolution(KPL)。使用绘图酶标仪(microplatereader)(Bio-TekInstruments，Inc.Winooski，VT)测定A450(与OD450一样？)，并用KCJunior软件(HighPoint，NC)分析数据(参见图24)。实施例20肺组织学将在第45天移除的肺在中性福尔马林中固定并送到MassHistologyService(Warwick，RI)用于加工以及苏木精与伊红(hematoxylin&eosin)(HE)和过碘酸-希夫(periodicacidSchiff)(PAS)染色。在光显微镜下观察肺组织切片并用数码相机拍照。使用方差分析(ANOVA)进行统计学分析。使用Student氏t检验(Student’st-test)比较OVA-免疫的和IMO-处理的组。结果表示为平均数±SEM。所有比较是双尾的(twotailed)而且统计显著性(statisticalsignificance)显示为*p＜0.05。实施例21预防模型的研究。检测了IMO化合物在小鼠中防止OVA-诱导的变应性炎症的能力。将每只小鼠在第0、7和14天通过皮下(s.c.)注射与等体积明矾溶液(Imject-Alum，Pierce，Rockford，IL)混合的100-μlPBS中的20-μg鸡卵清蛋白质(OVA；V级，Sigma，St.Louis，MO)来致敏。初次接受试验组(navegroup)的小鼠只接受明矾注射。将溶于OVA/明矾混合物的IMO化合物(10μg)在第0、7和14天给药小鼠。最后免疫14之后，将以异氟烷(isoflurane)(AbbottLaboratories，NorthChicago，IL)麻醉的小鼠通过眶后穿刺放血，然后处死以移除脾。实施例22在抗原-特异性回忆免疫应答中IMO化合物对于Th2细胞因子、IL-4、IL-5、IL-12和IL-13的抑制的影响。为了测定IMO化合物在用OVA/明矾注射的小鼠中改变Th2-优势免疫应答的能力，在第0和14天注射IMO化合物连同OVA/明矾。在第28天从小鼠中分离脾细胞并与OVA保温72hrs(抗原回忆)。来自用OVA/明矾注射的小鼠的脾细胞与首次接受实验的小鼠相比，只产生更高水平的与Th2相关的细胞因子，诸如IL-4(～2-倍)、IL-5(130-倍)和IL-13(28-倍)(参见图23A和23B)。来自接受CpGDNA或IMO化合物和OVA的小鼠的脾细胞分泌显著较少的这些细胞因子，尤其是IL-5和IL-13；IL-5减少20％至97％而IL-13减少60％至95％。这些结果显示IMO化合物对于与Th2有关的细胞因子分泌具有抑制作用。实施例23IMO化合物在抗原-特异性回忆免疫应答中对于IFN-γ产生的影响。在同样的抗原-回忆实验中，来自用OVA/明矾和IMO化合物注射的小鼠的脾细胞与来自首次接受实验的或OVA/明矾-注射的小鼠的细胞相比产生显著较高水平的Th1细胞因子IFN-γ(参见图23A和23B)。来自用OVA/明矾和常规CpGDNA1注射的小鼠的脾细胞产生的IFN-γ水平可与由初始脾细胞产生的所述水平相当。这些结果说明，用IMO化合物处理OVA/明矾-注射的小鼠可将免疫应答从Th2-优势的改变为主要为Th1型，如通过由脾细胞产生的细胞因子所反映的。实施例24IMO化合物对于OVA-特异的和总的IgE产生的影响。为了评价IMO化合物对于IgE产生的影响，检测了最后的OVA/明矾注射14天后OVA-特异的和总的IgE的血清水平。用OVA/明矾的致敏导致小鼠中OVA-特异性IgE的高水平产生；OVA-特异性的IgE水平的水平显著低于(可与在首次接受实验的小鼠中存在的水平相比较)接受IMO化合物连同OVA/明矾的小鼠中的水平(参见图24A和24B)。在用OVA/明矾和IMO化合物注射的小鼠中总血清IgE水平也是低的。实施例25IMO化合物对于OVA-特异的和总的IgG1和IgG2a产生的影响为了评价IMO化合物对于IgG1和IgG2a产生的影响，检测了OVA-特异的和总的IgG1和IgG2a的血清水平。接受OVA/明矾注射的动物产生高水平OVA-特异性的IgG1和不显著水平的OVA-特异性的IgG2a(参见图24A和24B)。与OVA/明矾-注射的小鼠中存在的水平相比，对小鼠注射IMO化合物不影响或降低OVA-特异性的IgG1水平。在接受IMO化合物的小鼠血清中，OVA-特异性的IgG2a抗体水平显著高于在那些只接受OVA/明矾的小鼠中的水平。在用OVA/明矾加IMO化合物注射的小鼠中，这些IgG1和IgG2a水平被转化为比只接受OVA/明矾的小鼠中更高的OVA-特异性的IgG2a/IgG1比例。类似的结果见于血清总Ig生产。来自用OVA/明矾和IMO化合物注射的小鼠的血清，比只接受OVA/明矾的小鼠的血清具有更低水平的总IgG1和更高水平的总IgG2a。实施例26治疗模型的研究。在哮喘的小鼠模型中，测试了IMOs1和2的治疗效力(therapeuticpotential)。用OVA致敏并和激发小鼠，并如前面规程所述用IMOs1和2处理。为了测定IMOs1和2处理对于局部免疫应答的作用，在最后注射IMOs1和2之后48小时，对用或不用IMOs1和2处理的、首次接受实验的和OVA/明矾-致敏-并-激发的小鼠的肺进行了组织学检测。不用IMOs1和2处理的OVA-致敏并激发的小鼠与首次接受实验的小鼠相比显示严重的炎症细胞浸润(inflammatorycellinfiltration)和气道上皮细胞增生(airwayepithelialhyperplasia)(数据未显示)。正相反，IMOs1和2-处理的小鼠与未处理的小鼠相比具有较少的炎症细胞浸润和较少的气道增生(数据未显示)。这些结果说明IMOs1和2在用OVA致敏并激发的小鼠中逆转OVA-诱导的肺炎症的能力。实施例27IMOs1和2处理在抗原-特异的回忆免疫应答对于Th2和Th1细胞因子的影响。为了测定IMOs1和2在用OVA致敏并激发的小鼠中逆转Th2-优势型免疫应答的能力，我们在第45天从小鼠中分离了脾细胞并与OVA一起培养72hr。在用OVA重-刺激脾细胞之后，我们在处理的组中观察到Th2细胞因子(IL-5和IL-13)产生中的显著差异。来自只用OVA注射的小鼠的脾细胞产生高水平与Th2-有关的细胞因子(图25)。用IMOs1和2处理的小鼠产生显著较少的OVA-诱导的Th2细胞因子(图25)。在抗原-回忆实验中，在来自首次接受实验的和OVA/明矾-致敏-并-激发的小鼠的脾细胞培养物中只诱导低水平的IL-12和IFN-γ。来自用IMOs1和2处理然后OVA激发的小鼠的脾细胞产生显著较高水平的IFN-γ(图25)。实施例28用IMOs1和2的处理在OVA-致敏并攻击的小鼠中对于OVA-特异的和总的血清IgE生成的影响。为了评价IMOs1和2对于IgE产生的影响，我们检测了OVA-特异的和总的IgE的血清水平。用OVA致敏并攻击但不用IMOs1和2处理的小鼠在血清中具有高水平的OVA-特异性的IgE(图26)，而用IMOs1和2处理的小鼠具有显著较低水平的OVA-特异性IgE。总血清IgE水平在接受IMOs1和2处理的小鼠中也是低的(图26)。实施例29IMOs1和2处理在OVA/明矾-致敏-并-攻击的小鼠中对于OVA-特异的和总的IgG2a产生的影响。为了评价IMOs1和2处理对于IgG2a产生的影响，我们检测了OVA-特异的和总的IgG2a的血清水平。不用IMOs1和2处理，用OVA致敏并激发的小鼠具有显著水平的OVA-特异性IgG2a(图26)。用IMOs1和2处理的OVA-致敏并-激发的小鼠具有增加的OVA-特异性IgG2a抗体水平(图26)。类似的结果见于血清总Ig生产(图26)用OVA致敏并激发而且用IMOs1和2处理的小鼠，比不用IMOs1和2处理的小鼠具有更高水平的总IgG2a。实施例30单次高剂量的IMO化合物相对于多次低剂量的IMO化合物在首次接受实验的小鼠中对于局部和系统Th1细胞因子水平的影响为了测定剂量对于IMO处理的影响，用33μg的IMO1或3在第1、2和3天经鼻内处理小鼠或用单次鼻内给药100μug的IMO1或3处理小鼠。在最后处理后5小时将小鼠放血并移除肺。单次100μg剂量诱导较高水平系统的细胞因子应答，然而，三次较小剂量(3×33μg)诱导较高的局部(BALF)细胞因子应答(图27)。为了测定低量多次给药IMO化合物在首次接受实验的小鼠中对于局部和系统细胞因子水平的剂量-依赖性影响，在第1、2和3天用2.5μg、10.0μg或40.0μg的IMO1经鼻内处理小鼠。在最后处理5小时后将小鼠放血并移除肺。当以小剂量多次给药时，IMO化合物在小鼠中增加局部(BALF)细胞因子水平而不是系统细胞因子水平(图28)。此影响是剂量依赖性的(dosedependant)。实施例31比较IMO化合物和皮质类固醇(corticosteriod)在体外的影响通过在第0和14天经腹腔内(intraperitonal)(i.p.)注射10mgOVA将小鼠致敏并在第28天用40-μPBS中的10μgOVA进行经鼻内激发。在第30天收集脾细胞并用100μg/mOVA，用或不用1μg/ml至10μg/mlIMO化合物或布地奈德(budesonide)保温72小时。IMO1和布地奈德抑制OVA诱导的Th2细胞因子分泌(IL-5，ILB)(图29)。然而，只有IMO1显示强的Th1细胞因子诱导(IL-12，FN-8)。等效物虽然为了清楚和理解的起见已经详细描述了上述本发明，但本领域的技术人员通过阅读本公开可以理解的是，在不背离本发明的真实范围和所附的权利要求的情况下，可进行形式和细节上的各种改变。权利要求1.免疫刺激性寡核苷酸致免疫物，其包含SEQIDNO170的序列。2.免疫调节性组合物，其包含权利要求1的免疫调节性寡核苷酸致免疫物；而且还包含共-刺激分子，所述共-刺激分子选自细胞因子、趋化因子、蛋白质配体、反式-活化因子、肽和包含经修饰的氨基酸的肽组成的组。3.权利要求2的免疫调节性组合物，其中所述共-刺激分子与所述免疫调节性寡核苷酸致免疫物相结合。4.权利要求2的免疫调节性组合物，其还包含佐剂。5.权利要求2的免疫调节性组合物，其还包含可药用的载体。6.免疫调节性组合物，其包含权利要求1的免疫调节性寡核苷酸致免疫物；而且还包含抗原。7.权利要求6的免疫调节性组合物，其中所述抗原选自肽、糖蛋白、脂蛋白，多糖和脂质组成的组。8.权利要求6的免疫调节性组合物，其中所述抗原是变应原。9.权利要求6的免疫调节性组合物，其还包含佐剂。10.权利要求6的免疫调节性组合物，其还包含可药用的载体。11.免疫刺激性寡核苷酸致免疫物，其包含SEQIDNO171的序列。12.免疫调节性组合物，其包含权利要求11的免疫调节性寡核苷酸致免疫物；而且还包含共-刺激分子，所述共-刺激分子选自细胞因子、趋化因子、蛋白质配体、反式-活化因子、肽和包含经修饰的氨基酸的肽组成的组。13.权利要求12的免疫调节性组合物，其中所述共-刺激分子与所述免疫调节性寡核苷酸致免疫物相结合。14.权利要求12的免疫调节性组合物，其还包含佐剂。15.权利要求12的免疫调节性组合物，其还包含可药用的载体。16.免疫调节性组合物，其包含权利要求11的免疫调节性寡核苷酸致免疫物；而且还包含抗原。17.权利要求16的免疫调节性组合物，其中所述抗原选自肽、糖蛋白、脂蛋白，多糖和脂质组成的组。18.权利要求16的免疫调节性组合物，其中所述抗原是变应原。19.权利要求16的免疫调节性组合物，其还包含佐剂。20.权利要求16的免疫调节性组合物，其还包含可药用的载体。21.治疗患有如下病症的患者的方法气道炎症、炎性疾病、过敏症或哮喘，所述方法包含对所述患者施用致免疫物。22.权利要求21的方法，其中所述致免疫物包含通过非核苷酸接头连接并具有多于一个5’末端的至少两个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中至少一个是具有可接近的5’末端并包含免疫刺激性二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸。23.权利要求21的方法，其中所述免疫刺激性二核苷酸选自CpG、C*pG、CpG*和C*pG*组成的组，其中C是胞苷或2′-脱氧胞苷，C*是2′-脱氧胸苷、阿糖胞苷、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-脱氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或其非天然嘧啶核苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，G*是2′脱氧-7-脱氮-鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷、2’-脱氧-2’取代的-阿糖鸟苷、2’-O-取代的-阿糖鸟苷，或其它非天然嘌呤核苷。24.权利要求21的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO170的序列。25.权利要求21的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO171的序列。26.权利要求21的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO172的序列。27.权利要求21的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO173的序列。28.权利要求21的方法，其还包含施用与所述疾病或病症有关的抗原。29.权利要求21的方法，其中所述致免疫物和/或抗原连接于免疫原性蛋白质或非免疫原性蛋白质。30.权利要求21的方法，其还包含施用佐剂。31.调节患有气道炎症、炎性疾病、过敏症或哮喘的患者中的免疫应答的方法，所述方法包含对所述患者施用致免疫物。32.权利要求31的方法，其中所述免疫应答是Th1免疫应答。33.权利要求31的方法，其中所述免疫应答是Th2免疫应答。34.权利要求31的方法，其中所述致免疫物包含通过非核苷酸接头连接并具有多于一个5’末端的至少两个寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中至少一个是具有可接近的5’末端并包含免疫刺激性二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸。35.权利要求31的方法，其中所述免疫刺激性二核苷酸选自CpG、C*pG、CpG*和C*pG*组成的组，其中C是胞苷或2′-脱氧胞苷，C*是2′-脱氧胸苷、阿糖胞苷、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-甲基-嘌呤、2’-脱氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脱氧-5-羟基胞苷、2′-脱氧-N4-烷基-胞苷、2′-脱氧-4-硫代尿苷，或其非天然嘧啶核苷，G是鸟苷或2’-脱氧鸟苷，G*是2′脱氧-7-脱氮鸟苷、2′-脱氧-6-硫代鸟苷、阿糖鸟苷、2′-脱氧肌苷、2’-脱氧-2’取代的-阿糖鸟苷、2’-O-取代的-阿糖鸟苷。36.权利要求31的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO170的序列。37.权利要求31的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO171的序列。38.权利要求31的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO172的序列。39.权利要求31的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO173的序列。40.权利要求31的方法，其还包含施用与所述疾病或病症有关的抗原。41.权利要求31的方法，其中所述致免疫物和/或抗原连接于免疫原性蛋白质或非免疫原性蛋白质。42.权利要求31的方法，其还包含施用佐剂。全文摘要虽然为了清楚和理解的起见已经详细描述了上述本发明，但本领域的技术人员通过阅读本公开可以理解的是，在不背离本发明的真实范围和所附的权利要求的情况下，可进行形式和细节上的各种改变。文档编号A01N43/04GK101094594SQ200480041479公开日2007年12月26日申请日期2004年5月24日优先权日2003年12月8日发明者苏迪尔·阿格拉瓦尔,朱富刚,埃卡姆巴·R·坎迪马拉申请人:海布里顿公司