专利名称：一种提高组培植物材料生根率和移栽成活率的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高组培植物材料生根率和移栽成活率的方法，特别适宜不易生根植物和珍稀植物材料的组培，属生物技术领域。
背景技术：
植物组织培养的成功例子最早可以追述到1934年White培养番茄离体根尖成功；随着植物生长所需各种物质的确定，越来越多的植物被成功培养，这项技术的应用也越来越广泛。植物组织培养一方面可为遗传工程提供理想的受体材料，另一方面又可为常规的植物改良程序提供一种新的手段。例如，无论转基因受体还是转化细胞的筛选和再生，都需要有组织培养技术作为支撑；石刁柏等雌雄异株的植物可以利用花药培养获得单性群体；利用原生质体融合技术获得有性杂交难以获得的杂种；利用茎尖培养获得脱病毒苗；利用组培快繁技术生产花卉苗木等等。无论是那种方式的应用，一般组培最终都需要获得完整的植株。大部分组培材料，特别是通过丛生芽快繁的植物体，一般需要将无根小苗切下，植入生根培养基诱导产生不定根后获得完整植株，多数植物利用常规的生根方法都可以获得长有不定根根系的再生植株，但是有的植物，由于基因型或其他方面的影响，常规方法生根非常困难，成为研究和应用的瓶颈。另外由于常规的生根方法是在含有大量水分、养分的培养基中生根，再生的植株可以不通过根系，仅需通过小苗的切口就可获得营养，所以形成的根常常是没有功能的，出瓶前往往需要较长时期的炼苗，移栽成活率也不高，对于原生质体融合杂种这类非常珍贵的材料来说，这是致命的缺憾。
不定根的生长一般是根原基首先被诱导发生，然后继续发育长大形成完整的根。常规方法和后来改进的各种方法如滤纸桥等方法都是在同一种环境介质中，使无根小苗的基部产生根原基并继续发育生长，常常有一些物种无法得到理想的结果，因此开发一种利用植物不定根发育的两个阶段，给予不同的条件，使得难于生根的植物种类，得以生根原本可以生根的植株能够获得更加强壮、有功能的根系，提高移栽成活率是非常有意义的。
发明内容
本发明是通过改进常规一直在培养基上生根的过程，在含有生长素的固体培养基上诱导根原基的产生，然后将以产生根原基的切段移入保持一定湿度的培养罐促进根原基的继续发育和生长，待幼根伸出后，切口及附近的愈伤组织也基本干燥，伤口得以封闭，此时，直接将小苗移入培养介质中或是继续转入壮苗培养基中壮苗，壮苗时，只将幼根插入培养基，而切口不接触培养基，养分不会由切口向上输送，切口也进一步愈合，大量的根会迅速伸向培养基，同时这些再生的不定根的功能得以建立。这样，就可以提高组培植物材料生根率和移栽成活率的方法。
本发明是这样实现的本发明的培养基为常规的根原基诱导固体培养基和壮苗固体培养基；采用的容器还包括气相培养罐；其中根原基诱导固体培养基为1/2浓度的Ms培养基附加萘乙酸0.01-1.0mg/L、蔗糖20g/L、琼脂0.7％，用1N的NaOH将pH调节至5.8-6.5，按照常规方法装瓶灭菌后备用。
促根原基生长气相培养罐为将一小张滤纸(三角瓶约需1cm×4cm，小罐头瓶约需1.5cm×6cm)用蒸馏水完全浸湿后贴容器内侧壁上，封口后维持压力0.1-0.15Mpa，温度121℃，灭菌20分钟后备用；壮苗培养基为1/2浓度的Ms培养基，蔗糖20g/L、琼脂0.7％，用1N的NaOH将pH调节至5.8-6.5，按照常规方法装瓶灭菌后备用。
本发明的方法，包括在固体培养基中诱导组培带芽茎段的根原基产生；气相培养罐中促进根原基生长、切口封闭；气相罐中促进根原基生长、切口封闭步骤；固体培养基上壮苗、幼根功能建立的步骤；其中(1)在固体培养基中诱导组培带芽茎段的根原基产生步骤中，培养条件为在室温下培养10-15天；(2)气相培养罐中促进根原基生长、切口封闭步骤为将产生根原基的切段放入气相罐中，在室温下培养2-5天，直至切口处的愈伤组织开始发白变干、并有幼根开始伸出；气相罐为容器内壁上贴有用蒸馏水完全浸湿后的滤纸，封口后维持压力0.1-0.15Mpa，温度121℃，灭菌20分钟后备用；(3)固体培养基上壮苗、幼根功能建立的步骤中移入壮苗培养基时，只将幼根插入培养基，而切口不接触培养基，待大量根系产生后再移栽。
本发明的方法具体如下根原基的固相诱导步骤将从生芽或带芽小茎段切下，将切口端插入根原基诱导培养基中，在室温下培养10-15天，直至观察到切口处包含多个根原基的愈伤组织产生(如图1所示)。
气相法促进伤口封闭、根原基继续发育形成幼根的步骤将已经产生根原基的切段放入带滤纸条的气相培养罐中，在室温下培养2-5天，直至切口处的愈伤组织开始发白变干，并有幼根开始伸出(如附图2所示)。
壮苗、移栽步骤已生幼根的茎段可以直接出瓶移入灭菌的常规的培养介质中，也可以也可以根据需要将其先转入壮苗培养基中壮苗；移入壮苗培养基时，将幼根插入培养基，而切口不接触培养基，防止切口接触培养基吸收养分，确保小苗继续生长发育的养分完全是由新形成的这些根吸收，待大量根系产生后再移栽。
本发明与常规生根方法及滤纸桥法的比较指标为表1.利用不同生根方法对材料茎段的生根效果比较
表1中的指标为几种珍贵又较难生根的植物材料，如小麦与高冰草原生质体杂交再生苗、小麦与燕麦原生质体杂交再生苗等。
从表1中的指标可以明显地看到，本发明对于那些极宝贵又难生根的植物材料具有明显的促进生根、提高移栽成活率的作用。
本发明具有方法简单、效果佳、有广泛应用领域等优点，特别适宜于较为珍稀或难于生根的植物材料的组培。
图1为丛生芽切段基部在固相培养基中培养8-15天的组织切片观察结果。
图中A为培养15天后的切段基部愈伤组织横切面，示愈伤组织团块中的根原基；B为培养8天的切段基部愈伤组织纵切面，示根原基原始细胞；D、E为培养15天后发育到一定程度的根原基。
图2为气相培养过程中，幼根形成，在壮菌培养基上，大量的根继续长出。
图中A为气相培养2天后，切口处愈伤组织的纵切面，可见到幼根开始伸出；B为气相培养4天后，切段基部愈伤组织干燥发白，幼根伸出。C为小心将已生根材料移入壮苗培养基，仅将幼根插入培养基，切口不接触培养基，根系大量发育。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一1、游离具有胚性的小麦品种济南177、高冰草的原生质体，利用常规的PEG法诱导融合，在等渗液体培养基上使得杂种细胞再生细胞壁，恢复分裂形成小细胞团；其中一个克隆在添加BA0.5-1.5mg/L的Ms培养基上分化形成丛生无根苗5株，将带芽小茎段切下，将切口端插入根原基诱导培养基中，在室温下培养10天左右切口基部可见愈伤组织出现。
2、将1中的切段放入带滤纸条的气相培养罐中，室温下培养2天，切口处的愈伤组织开始发白变干，有一株开始伸出幼根，至第5天，5株均有幼根伸出，生根率达到100％。
3、已生幼根的茎段移入壮苗培养基，仅将幼根插入培养基，而切口不接触培养基，防止切口接触培养基吸收养分，确保小苗继续生长发育的养分完全是由新形成的这些根吸收，待大量根系产生后再移栽。移栽成活率达到100％。
4、移栽成活并收获种子，在这些后代中已经分别筛选到具有高抗盐性、高耐早、具有新麦谷蛋白亚基的多个株系。新的麦谷蛋白亚基基因已经成功克隆。
实施例二基本同实施例一。不同之处为1、参与体细胞融合的双亲为小麦品种济南177和燕麦的原生质体，其中一个克隆在添加BA0.5-1.5mg/L的Ms培养基上分化形成丛生无根苗16株，将带芽小茎段切下，将切口端插入根原基诱导培养基中，在室温下培养12天切口基部可见愈伤组织出现。
2、在室温下气相培养罐中培养4天，11株无根苗均形成幼根，生根率达到87％。
3、11株已生根小苗移栽，成活9株成活率达到82％。
4、移栽成活并收获种子，分子标记、基因组原位杂交表明这些小苗为杂种细胞后代。
实施例三基本同实施例一。不同之处为1、红叶石楠组培形成的从生芽，室温下在根原基诱导培养基上，带芽小茎段15天切口基部可见愈伤组织形成。
2、在室温下气相培养罐中培养3天，使得120株无根苗均形成幼根，生根率达到100％。
3、不经壮苗，直接移栽至蛭石/珍珠岩培养介质中成活率达到92％。
权利要求
1.一种提高组培植物材料生根率和移栽成活率的方法，包括在固体培养基中诱导组培带芽茎段的根原基产生；固体培养基上壮苗、幼根功能建立步骤；其特征在于该方法还包括气相培养罐中促进根原基生长、切口封闭步骤；其中(1)在固体培养基中诱导组培带芽茎段的根原基产生步骤中，培养条件为在室温下培养10-15天；(2)气相培养罐中促进根原基生长、切口封闭步骤为将产生根原基的切段放入气相培养罐中，在室温下培养2-5天，直至切口处的愈伤组织开始发白变干、并有幼根开始伸出；气相培养罐为容器内壁上贴有用蒸馏水完全浸湿后的滤纸，封口后维持压力0.1-0.15Mpa，温度121℃，灭菌20分钟后备用；(3)固体培养基上壮苗、幼根功能建立的步骤中已生幼根的茎段移入壮苗培养基时，只将幼根插入培养基，而切口不接触培养基，待大量根系产生后再移栽。
全文摘要
本发明涉及一种提高组培植物材料生根率和移栽成活率的方法，属生物技术领域。本方法包括在固体培养基中诱导组培带芽茎段的根原基产生；气相培养罐中促进根原基生长、切口封闭；固体培养基上壮苗、幼根功能建立的步骤。其中根原基产生步骤中，培养条件为在室温下培养10－15天；气相培养罐中培养条件为在室温下培养2－5天，气相培养罐为容器内壁上贴有用蒸馏水完全浸湿后的滤纸，封口灭菌后用；已生幼根的茎段移入壮苗培养基时，只将幼根插入培养基，而切口不接触培养基，待大量根系产生后再移栽。本发明具有方法简单、效果佳、有广泛应用领域等优点，特别适宜于较为珍稀或难于生根的植物材料的组培。
文档编号A01H4/00GK1709043SQ20051001082
公开日2005年12月21日 申请日期2005年5月24日 优先权日2005年5月24日
发明者陈穗云, 肖春杰 申请人:云南大学