专利名称：茶树顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的新的基因序列的克隆的制作方法
技术领域：
本发明涉及Camellia sinensis L.(O.)Kuntze(以下称作茶)树的顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的新的基因序列的克隆。尤其是，本发明涉及茶的冬眠顶端幼芽中所表达和阻抑的基因[本发明基因是指脱氧核糖核酸(以下叫做DNA)]序列的新的引物3(以下称作3’)末端的鉴别、克隆和分析。3’末端是指在DNA分子的碳水化合物部分的第3位置具有游离羟基的DNA的末端。
背景技术：
茶树(Camellia sinensis L.(O.)Kuntze)是一种生长位于在45°N-30°S和150°E-60°W的31个国家的多年生植物。由于是多年生的，该植物经受了数个夏季、冬季和雨季的轮回。顶端幼芽和相连的两片叶子(以下称作BATS)被用于制茶。根据它们的可用性，在频繁的间隙期收获BATS。通常的环境条件(例如温度、太阳光照时间以及土壤和大气湿度等)和茶纯系决定收获的BATS的可用性。
一般认为30℃的温度和13小时的白天时间对于植物的生长是理想的。当温度下降低于13℃且白天时间短于11小时15分钟时，BATS的生长和发育就停止了。BATS的这种生长暂停现象就叫做冬眠。与叶子凋落的植物不同，茶树不会脱落任何叶子、并且休眠期间保持绿色[Barua，D.N.1989.《茶树栽培的科学和实践》(Science and practice in tea culture).茶研究委员会，加尔各答，印度.第509页]。冬眠是出现在生长于上述环境条件下的茶树作物中的一种普遍现象(Barua，D.N.1989.《茶树栽培的科学和实践》.茶研究委员会，加尔各答，印度.第509页)。
下表1举例说明了生长在全球国家的各种茶树的冬眠期
表1
(数据来自Barua，D.N.1989.《茶树栽培的科学和实践》.茶研究委员会，加尔各答，印度.第509页；Dudeja，V.1992.《今日茶树》131-5)。
生长临时暂停或休眠不仅限于茶树的顶端幼芽、而且在下列其它小块(plats)和系统中普遍可见a)紫杉属种的顶端幼芽(Janes；Harry，W.；Gore；Gerald，E.；Wittman；Wayne，K.；Romen；Harry，T.1997.6.1；美国专利#5642587)、山毛榉树(Fagus sylvatica；Heide，O.M.1993.《植物生理学》(Physiol.Plant)89187-191)；葡萄树(Vitus vinifera；Nir，G.，Shulman，Y.，Fanberstein，L.和Lavee，S.1986.《植物生理学》811140-1142；Or，E.，Vilozny，I.，Eyal，Y.和Ogrodovitch，A.2000.《植物分子生物学》(Plant Mol. Biol. 43483-494)；桃树(Marquat，C.，Vandamme，M.，gendraud，M.和Petel，G.1999.《科学园艺(Hort.)》79151-162；Faye，F.和Floc’h，F.L.J.1999.《植物生理学》154471-476)；蔷薇属(Rosa hybrida；Bris，M.L.，Michaux-Ferrière，N.，Jacob，Y.，Poupet，A.，Barthe，P.，Guigonis，J-M.和Page-Degivry，M-T.L.1999.8月.《植物生理学杂志》26273-281)；杨属(Populus)(Rohde，A.，Montagu，M.V.和Boerjan，W.1996(在Ahuja，M.R.，Boerjan，W.和Neale，D.B.编辑的《树的体细胞遗传学和分子遗传学》(Somatic Cell Genetics and Molecular Genetics of Trees)中，Kluwer研究院出版，荷兰，第183-188页)；Jian，L-c.，Li，P.H.，Sun，L-h和Chen，T.H.H.1997.《实验植物学杂志》(J.Exp.Bot.)481195-1207)。
b)道格拉斯枞树的种子(Pseuditsuga menziesii；Taylor，M.A.，Davies，H.V.，Smith，S.B.Abruzzese，A.和Gosling，P.G.1993.《植物生理学杂志》142120-123；Jarvis，S.B.，Taylor，M.A.，Bainco，J.，Corbineau，F.和Davies，H.V.J.1997.《植物生理学》151457-464)；大麦(Hordeum vulgare；Aalen，R.B.Opsahl-Ferstad，H-G.，Linnestad，C.和Olsen，O-A.1994.《植物杂志》5385-396；Stacy，R.A.P.，Munthe，E.，Steinum，T.，Sharma，B和Aalen，R.B.1996.《植物分子生物学》311205-1216)；野燕麦(Avenafatua；Li，B.和Foley，M.，E.1995.《植物分子生物学》29823-831)；番茄(Groot，S.P.C.和Karssen，C.M.1992.《植物生理学》99952-958)；雀麦(Bromus secalinus；Goldmark，P.J.，Curry，J.，Morris，C.，F.和Walker-Simmons，M.K.1992.《植物分子生物学》19433-441)；拟南芥属(Arabidopsis thaliana；Leon-Kloosterziel，K.M.，Gil，M.A.，Ruijs，G.J.，Jacobsen，S.E.，Olszewski，N.E.，Schwartz，S.H.，Zeevaart，J.A.D.和Koornneef，M.1996.《植物杂志》10655-661；Haslekas，C.，Stacy，R.A.P.，Nygaard，V.，Culiánez-Macià和Aalen 1998.《植物分子生物学》36833-845)；小麦(Triticum aestivum；Morris，C.F.，Anderberg，R.，J.，Goldmark，P.J.和Walker-Simmons，M.K.1991.《植物分子生物学》1995814-821)；
c)马铃薯的块茎(Solanum tuberosum；Macdonald，M.M.和Osborne，D.J.1988.《植物生理学》73392-400)；d)gradiolus球茎(Gladious grndiflorus；Ginzberg，C.1973.《实验植物学杂志》24558-566)，藏红花粉(saffron crocus)(Crocus sativusL.；Chrungoo，N.K.和Farooq，S.1988，Acta Physiol Plant，10247-255)；e)洋葱的球茎(Abdel-Rahman，M.和Isenberg，F.M.R.1974，J.agric.Sci.camb.，82113-116)；晚香玉(Polyanthus tuberosaL，Nagar，P.K.1995.《科学园艺》6377-82)；郁金香(Reea，A R.1981.《应用生物学年刊》98544-548)；薯蓣(Dioscorea spp；Hasegawa，K.和Hashimoto，T.1973.《植物细胞生理学》14369-377).
因此，在内部或外部的不利条件下通过具有分生组织的植物部分表现出休眠。
在农业体系中休眠的调节已经且将要持续成为一个关键的话题。例如，如果种子或块茎或球茎减少了休眠期，超前发芽将导致生长物损失，本发明就是用它们作为播种物。如果打算为人或动物消耗所用，则在营养和加工质量方面会有损失。在任一情况中，均没有认识到经济利益。与此相反，延长的休眠期可导致晚发芽或生长物地中的晚抽芽，这将影响农作物性能和农作物产量。
还有，茶工业的一个主要需求是在休眠普遍可见的地区需要没有休眠期或至少是休眠期缩短的茶树。Nakayama，A.和Harada，S.(《茶研究所公报》日本，1962.128-39)和Barua，1969(Two and A Bud.1641-45)指出低温与短白天时间对诱导茶树冬眠起作用。因此，建议使用一种植物生长调节剂——赤霉酸以阻断休眠。但是赤霉酸的作用不是持久性的。而且，结果随纯系的不同而改变(Das，S.1997.博士论文，Gauhati University，Assam；Rustogi，P.N.1980.Two and A Bud.2133)。种子、块茎和球茎中的研究也得到了同样的结论(Aalen，R.B.，Opsahl-Ferstad，H-G.，Linnestad，C.和Olsen，O-A，1994，《植物杂志》5385-396；Bagni，N.，Malucelli，B.和Torrigiana，P.1980.《植物生理学》49341-345；DeBottini，G.A.，Bottini，R.和Tizio，R.1982.Oyton。42115-121；Bewley，J.D.和Black，M.1985.《发育和发芽的生理学》Plenum出版，纽约，190-192；Delvallee，I.，Paffen，A.，和deKlerk，G.J.1990.《植物生理学》80431-436；Djilinov，D.，Gerrits，M.，Ivanova，A.，Van Onikelen，H.A.和Dc Klerk，G.J.1994.《植物生理学》91639-644；Ginzberg，C.1973.《实验植物学杂志》24558-566；Kurashi，S.，Daisuki，Y.，Naoki，S.和Shigeki，H.1998《植物生长调节杂志》83-10)。
上述结果描述了分子方法的使用。使用示差筛选已经从Bromus和Hordeum vulgare的种子克隆了与cDNA相关的一些休眠(Goldmark，P.J.，Curry，J.，Morris，C.F.和Walker-Simmons，M.K.1992《植物分子生物学》19433-441；Aalen，R.B.，Opsahl-Ferstad，H-G.，Linnestad，C.和Olsen，O-A.1994《植物杂志》5385-396)。克隆pBS128是从休眠的Bromus种子分离的，对无休眠种子使用ABA导致这种转录的增强表达(Goldmark，P.J.，Curry，J.，Morris，C.F.和Walker-Simmons，M.K.1992《植物分子生物学》19433-441)。已证实这种来自Bromussecalinus的pBS128，它在休眠的而不是无休眠的水合种子中保持高水平，在维持胚芽休眠中起作用。序列分析揭示了编码蛋白质属于新近发现的叫做peroxiredoxin的抗氧化剂(Li，B.和Forey，M.E.1997.《植物科学趋势》2384-389)。序列分析没有显示其它报道基因的同源性。有趣的是，存在于发育的大麦种子的胚芽中的转录B15C显示了与克隆pBS12895％的同源性(Aalen，R.B.Opsahl-Ferstad，H-G.，Linnestad，C.和Olsen，O-A.1994《植物杂志》5385-396)。
已经从休眠和无休眠的野燕麦胚芽中克隆了差异表达的部分cDNA片段(Johnson，R.R.，Cranston，H.J.，Chaverra，M.E.和Dyer，W.E.1995.《植物分子生物学》28113-122)。在这几种克隆之外，发现叫做AFD4和AFN5的两种克隆非常有趣。推测AFD4(蛋白质Z类似物)编码的蛋白质是保持种子休眠状态的发芽阻抑物。AFN5，它在吸入的非常早期已被表达，它可能编码为信号或发芽的早期初始步骤所需的蛋白质(Johnson，R.R.，Cranston，H.J.，Chaverra，M.E.和Dyer，W.E.1996.《植物休眠、生理学、生物化学和分子生物学》，CAB International，Wallingford，UK.第293-300页)。也已经鉴定了其它通过使用ABA而诱导的胚芽特异性基因(Hatzopoulos，P.，Fong，F.和Sung，Z.R.1990《植物生理学》94690-695；Vance，V.B.和Huang，A.H.C.1998.《生物化学杂志》2631476-1481)，但还未确定它们与休眠的关系。
下表2举例说明了有关植物的休眠现象可获得的信息的情况
已经尝试按以下方法调节休眠过程(1)Bruce，D.；Eaton，C.D.；Schafer；Ronald，K.和Boise，I.D.在1998年9月22日提交的美国专利#5811372中描述了一种通过延长冷藏时的马铃薯的休眠而控制马铃薯抽芽形成的方法。在大约16.6ppm的块茎上使用了某些化学药品例如chloropham、香芹酚和苯并噻唑(bezothiazole)和一般有效的CIPC(异丙基3-氯苯基氨基甲酸酯)残基。
(2)Lulai；Edward，C.Orr；Paul，H.，Glynn；Martin，T.在1995年7月25日提交的美国专利#5436226中提出通过使用一种天然的植物生长物质茉莉酮酸酯抑制冷藏条件下的马铃薯的抽芽。
(3)Barry；Gerard Francis；Kishore；Ganesh Murthy；Stark；David Martin；Zalewaski；James Conrad在1997年7月15日提交的美国专利#5648249中描述了一种提高贮存在降低的温度下的马铃薯的质量的方法和一种延长贮存的马铃薯球茎的休眠的方法。通过用重组的双链DNA分子转化马铃薯植物而生产转基因马铃薯，该DNA分子包括启动子(来自马铃薯或拟南芥属的冷诱导启动子)、结构DNA序列(它编码了一种融合多肽，该多肽包括氨基末端质粒转运肽和大肠杆菌glgC ADP葡萄糖焦磷酸化酶)和3’末端非翻译DNA序列(引起翻译终止和在RNA序列的3’末端加入聚腺苷酸化核苷酸)。起作用的启动子导致冷藏期间产生块茎RNA序列、结构DNA序列导致产生RNA序列。已证实这些转基因马铃薯块茎具有延长的休眠期且可抑制低温时抽芽。
(4)Kawchuk，L.M.；Armstrong，J.D.；Lynch，D.R.；Knowles，N.R(1998)在1998年8月13日提交的专利#WO9835051 A1中公开了通过抑制基因表达提高低温贮存的马铃薯的质量。发明人用贮存在低温下的马铃薯块茎生产了具有葡聚糖L型磷酸化酶(GLTP)或葡聚糖H型磷酸化酶(GHTP)酶活性水平下降的转基因马铃薯。
(5)Khan，A.A.(1994)在1994年3月15日提交的美国专利#5294593中讨论了在蔬菜、草、树以及灌木和花的无休眠种子中引入休眠的方法，即通过用赤霉素生物合成抑制剂tetcyclasis对它们进行处理。
(6)Janes，H.W.，Gore，G.E.，Wittman，W.K.和Romen，H.T在1997年7月1日提交的美国专利#5642587中公开了通过增加生物质的生产来增加产量和回收紫杉酚和taxotrene的方法。通过抑制休眠过程和增加温室中的生长循环数来实现此目的。为了阻断休眠，将植物在无光线和85％相对湿度的条件下于低温房中放置30天，然后转移至温室(55-80°F，即13℃和27℃；相对湿度75％-80％)中放置40天以进行生长。将所有植物进行冷处理显示了发育更充沛的幼芽和全部植物生长。未处理的植物停止了生长且一段时间后没有再生长。
(7)Rieder，G.L.(1984年12月11日提交的美国专利#4487625)讨论了一种中断多年生农作物——葡萄树的幼芽休眠的方法，即用0.1-10wt％氨腈水溶液喷射，得到了伴有农作物产量增加的花和果实的均相发育。
(8)Illingworth，J.(1997，12，2)在美国专利#5693592中公开了某些含调节生长的化合物(选自脂肪酸酯、脂肪酸酰胺、脂肪醇、脂肪醇盐、邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸酰胺和酰亚胺以及其两种或更多的混合物)、用于控制休眠终止和休眠的多年生植物的盛开的组合物，这些多年生植物例如有核果(李子、樱桃、桃等)、梨果(苹果和梨)、蔓生植物、葡萄、橄榄、温和果(猕猴桃、无花果)、浆果(草莓、覆盆子、越橘、黑莓和罗苷莓)和坚果(杏树、胡桃、栗子)，这些植物需要必需的冷刺激以终止幼芽休眠。于期望的幼芽断裂前的60天的休眠季节中，上述生长调节化合物的不同组合物的不同浓度(0.5wt％至50wt％)被用于不同的植物种类中。本发明可用于提前或推后果树的幼芽休息的时间。
下面特别给出了有关植物的顶端幼芽的休眠相关性基因的已知技术的情况参考文献(1)Or，E.，Vilozny，I.，Eyal，Y.和Ogrodovitch，A.2000《植物分子生物学》43483-494，其中描述了葡萄休眠阻断相关性蛋白激酶(以下称作GDBRPK)转录的鉴别，此转录通过氢氨腈对休眠释放的化学诱导向上调节。GDBRPK含有编码325个氨基酸的976个碱基对(此后称为bp)开放读框。此后是241 bp 3’-非翻译区域。GDBRPK，大概是作为应激信号的传感器。
参考文献(2)Rohde，A.，Montagu，M.V.和Boerjan，W.1996(在Ahuja，M.R.，Boerjan，W.和Neale，D.B.编辑的《树的体细胞遗传学和分子遗传学》中，Kluwer研究院出版，荷兰，第183-188页中)，其中得出的结论是幼芽和种子休眠的过程可以具有相似的结果。应注意到此工作不包括任何差异基因表达类型或蛋白质分布研究。该结论是根据在细胞循环特异性启动子的控制下、对包含嵌合β-葡糖醛酸酶基因的转基因Populus的研究得出的。因此，这些研究没有揭示幼芽休眠本身的任何机制或者产生任何与幼芽休眠有关的基因。
现有技术的缺陷为(a)通过将植物暴露于低温条件下努力较早调节休眠不可能使植物在田地中立住。尤其是，对于例如紫杉、李子、苹果、无花果、桑属、杏、核桃和茶树等植物，由于它们是树、不可能在罐中生长。
(b)通过喷射化学制剂而努力较早调节休眠将对环境不利，因此会产生环境污染。
(c)至今仍没有在天然条件下从休眠或无休眠幼芽克隆出基因。仅有一项分离从葡萄树(Vitis vinfera cv.Perlette)的幼芽克隆的基因的报道。然而，克隆的基因是由于使用氢氨腈而诱导的(Or，E.，Vilozny，I.，Eyal，Y.和Ogrodovitch，A.2000.《植物分子生物学》43483-494)。
(d)在一些情况下，已经从将要置于转基因植物中的微生物获得了特殊酶的基因。这引起了关于环境问题和危害。理想的是从生长在本身用于调节休眠现象的相似生态系统中的植物系统获得相关基因。
(e)没有休眠过程中所表达和阻抑的基因光谱。
(f)早期发明没有考虑到的重要之处是用于鉴定和克隆差异表达基因的相同基因控制组成和被处理的树种。
本发明第一次用一种简单且可靠的方法避免了上述缺陷，这对于本领域技术人员来说不是显而易见的。
发明内容
本发明的主要目的是克隆生长在野外田间条件下的茶树(Camelliasinensis L.(O.)Kuntze)的顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的新的DNA序列。
本发明另一个目的是确保用于鉴定和克隆生长在野外田间条件下的茶树(Camellia sinensis L.(O.)Kuntze)的顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的新的DNA序列的植物的同样基因组成。
本发明还有一个目的是产生生长在野外田间条件下的茶树(Camelliasinensis L.(O.)Kuntze)的顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的基因光谱。
本发明的另一个目的是鉴定生长在野外田间条件下的茶树的顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的基因的3’末端。
本发明的另一个目的是证实用于确立生长在野外田间条件下的茶树的顶端幼芽中冬眠期间的差异表达的差异表达基因的已鉴定3’末端。
本发明还有一个目的是克隆已鉴定的差异表达基因的3’末端。
本发明仍有一个目的是对已鉴定的克隆基因的3’末端进行测序。
附图的简要说明
图1代表从茶树的无休眠(ND)和休眠(D)幼芽分离的RNA，M代表RNA标记；图2代表从茶树的ND和D幼芽分离的总RNA合成的DNA，T11A、T11C和T11G代表用于用三种分离反应中的总RNA合成cDNA的引物，M泳道包含DNA分子重量标记；图3代表使用每一泳道底部所示的引物组合在茶树的ND和D顶端幼芽中所表达和阻抑的基因的3’末端的光谱，每一泳道顶部的数目代表泳道数，箭头表示差异表达；图4代表使用每一泳道底部所示的引物组合在茶树的ND和D顶端幼芽中所表达和阻抑的基因的3’末端的进一步光谱，每一泳道顶部的数目代表泳道数，箭头表示差异表达；图5代表使用每一泳道底部所示的引物组合在茶树的ND和D顶端幼芽中所表达和阻抑的基因的3’末端的进一步光谱，每一泳道顶部的数目代表泳道数，箭头表示差异表达；图6代表使用每一泳道底部所示的引物组合在茶树的ND和D顶端幼芽中所表达和阻抑的基因的3’末端的进一步光谱，每一泳道顶部的数目代表泳道数，箭头表示差异表达；图7代表使用每一泳道底部所示的引物组合在茶树的ND和D顶端幼芽中所表达和阻抑的基因的3’末端的进一步光谱，每一泳道顶部的数目代表泳道数，箭头表示差异表达；图8代表使用每一泳道底部所示的引物组合在茶树的ND和D顶端幼芽中所表达和阻抑的基因的3’末端的进一步光谱，每一泳道顶部的数目代表泳道数，箭头表示差异表达；图9代表使用每一泳道底部所示的引物组合在茶树的ND和D顶端幼芽中所表达和阻抑的基因的3’末端的进一步光谱，每一泳道顶部的数目代表泳道数，箭头表示差异表达；
图10代表使用每一泳道底部所示的引物组合在茶树的ND和D顶端幼芽中所表达和阻抑的基因的3’末端的进一步光谱，每一泳道顶部的数目代表泳道数，箭头表示差异表达；
图11代表从图3-10所示的测序(变性聚丙烯酰胺)凝胶洗脱后基因的差异表达的3’末端的扩增，每一泳道的顶部的第一个数代表图3-10所示的泳道数，点后的第二个数代表从图3-10所示的各自泳道的顶部计数的差异表达的条带数，M代表DNA大小标记；
图12代表从图3-10所示的测序(变性聚丙烯酰胺)凝胶洗脱后基因的差异表达的3’末端的进一步扩增，每一泳道的顶部的第一个数代表图3-10所示的泳道数，点后的第二个数代表从图3-10所示的各自泳道的顶部计数的差异表达的条带数，M代表DNA大小标记；
图13代表从图3-10所示的测序(变性聚丙烯酰胺)凝胶洗脱后基因的差异表达的3’末端的进一步扩增，每一泳道的顶部的第一个数代表图3-10所示的泳道数，点后的第二个数代表从图3-10所示的各自泳道的顶部计数的差异表达的条带数，M代表DNA大小标记；
图14代表从图3-10所示的测序(变性聚丙烯酰胺)凝胶洗脱后基因的差异表达的3’末端的进一步扩增，每一泳道的顶部的第一个数代表图3-10所示的泳道数，点后的第二个数代表从图3-10所示的各自泳道的顶部计数的差异表达的条带数，M代表DNA大小标记；
图15代表
图11-14所示基因的洗脱的差异表达的3’末端克隆后的扩增，每一泳道的顶部的第一个数代表图3-10所示的泳道数，点后的第二个数代表从图3-10所示的各自泳道的顶部计数的差异表达的条带数，M代表DNA大小标记；
图16代表
图11-14所示基因的洗脱的差异表达的3’末端克隆后的扩增，每一泳道的顶部的第一个数代表图3-10所示的泳道数，点后的第二个数代表从图3-10所示的各自泳道的顶部计数的差异表达的条带数，M代表DNA大小标记；
图17代表
图11-14所示基因的洗脱的差异表达的3’末端克隆后的扩增，每一泳道的顶部的第一个数代表图3-10所示的泳道数，点后的第二个数代表从图3-10所示的各自泳道的顶部计数的差异表达的条带数，M代表DNA大小标记；
图18代表通过Northern杂交证实基因的克隆3’末端的差异表达；
图19代表通过使用两个以上克隆的Northern杂交进一步证实基因的克隆3’末端的差异表达；图20代表来自ND、D和强制ND顶端幼芽的基因数31.2的已鉴定的克隆3末端的表达(冬季将赤霉酸用于D幼芽以强制幼芽进入非休眠期)。
因此，本发明提供了(a)生长在野外田间条件下的Camellia sinensis L.(O.)Kuntze(茶)灌木的顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的新的DNA序列；(b)从相同基因组成的茶树克隆这些序列；(c)生长在野外田间条件下的无休眠和休眠茶树的顶端幼芽中所表达和阻抑的基因的3’末端的光谱；(d)证实用于确立生长在野外田间条件下的茶树的顶端幼芽中冬眠期间的差异表达的差异表达基因的已鉴定3末端；(e)使已鉴定基因与生长在野外田间条件下的茶树幼芽的休眠相关联的方法；和(f)根据迄今在数据库中未存放的新序列，对差异表达基因的克隆3’末端进行测序具有单一性。
因此，本发明提供了Camellia sinensis L.(O.)Kuntze(茶树)灌木或树种的顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的新的DNA序列，所述的序列包括以下所示的序列ID1一4SEQ ID NO15′-ATCGCCGTAA TTGCCATGTT TTCCCTCTCA CCGGAATCCT ACGTTATCC CCTTACCTTC GTGAACATTA CAGTAGGAAT CGGTGGTCCAATTATCAACT TAATTTTGGG CGCATCTGTT CGTGTTAACT AGAAGCCATGTATACATACA ATACAACATG GTTCACTCCT CCTACAGATT ATGAGTTGAACTTTTATAAT AAGTTGTAAT AATGGCTTCT GAATAAGGAG AAGAGGAGCCTCTGTTTGTT TTACTTATTA CAGATGTGAT ATCGTTCAAC AACTTTGATTCTGCGAAAAA AAAAA-3′SEQ ID NO25′- AGAAGTACCT GAAAGGAAGC TTAACGAGGT GAACATCCATTGCAGCCAGC CCTGGAATCT GTACAGGGCA ACTCTGAACC GGAATTATTTTAATAACCCG TGGGCAATGA TTGCAATTAT GGCTCGTTTG GTATTACTTCTACTCACTTA GACACAACTG TATTTACGGT TTTCGCTGGA ATTGTAATTGTTGGAGCGAC AAAATAGATG GTCACAACTT ATTGGTGAGA GTATCAGTGTGCTCTTCTTT ATCGTCTTTA ACTCTCCGTG GTAATTACTT TGACAATATTCATACAT-3′SEQ ID NO35′-GAGACTCAGC TCAGCAATCA TGTTCTAAGT GAATGTCACT CTATCGCCTTCTTGTCCCTC TTAGACATAC TACATCCTCA TTCTGCTAGA AATGAACTCATGTAGGTTTT GAAGTTGGGA ACTTTTGAAA CTGTGTTGTT TGGGTGCTGTCTGTTATACA ATTCTCTCAA CTGCGGAGAA TTGACGTTGG TTGTAGTGGAATTCAACACT TGGGTTTTGT TCTTAGTTAA AAAAAAAAA-3′SEQ ID NO45′-ATAGCTTAGT CACGTGTCTC TTGAGAATGG ACTACGTAGT TGTTAAGTTGGGTGATCAGA AGGCGTTGAT GATGAATGTA TGAAGCAGAG ACTACTGAATGTAATTTTGT TGTTGAAAGA TGAATGATTT ATTAATGCCT GCATATCTTTCTATTGTTTG ATGCCAAACC TTTGGGCACA TTTTTTCTTT CTTTTTGTGATAATGTTCTC TTCTTGCAAA AAAAAAAA-3′
在本发明的一个实施方式中，新的DNA序列是从具有同样基因组成的茶树中克隆的。
在本发明的另一个实施方式中，新的DNA序列是从生长于野外田间条件下的具有同样基因组成的茶树中克隆的。
本发明的另一个新的DNA序列与茶的冬眠有关。
在本发明的另一个实施方式中，新的DNA序列，是通过任何但不限于扣除杂交法和差示筛选法的方法克隆的。
在本发明的另一个实施方式中，DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO1中所示。
在本发明的另一个实施方式中，在SEQ ID NO1中给出的DNA的核苷酸序列仅在茶树的无休眠顶端幼芽中超量表达。
在本发明的另一个实施方式中，DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO2中所示。
在本发明的另一个实施方式中，在SEQ ID NO2给出的DNA的核苷酸序列仅在茶的无休眠顶端幼芽中表达。
在本发明的另一个实施方式中，DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO3中所示。
在本发明的另一个实施方式中，在SEQ ID NO3中给出的DNA的核苷酸序列仅在茶的无休眠顶端幼芽中表达。
在本发明的另一个实施方式中，DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO4中所示。
在本发明的另一个实施方式中，在SEQ ID NO4中给出的DNA的核苷酸序列仅在茶的休眠顶端幼芽中表达。
在本发明的另一个实施方式中，新的序列能够被克隆成全长cDNA。
在本发明的另一个实施方式中，新的序列能够被克隆成全长基因组DNA。
在本发明的另一个实施方式中，新的序列能够被克隆成重要的序列，例如，但不限于，启动子序列和调节序列等。
选择生长和培养于Palampur(32°04’N，76°29’E；海拔高1300m)、Himalayan Bioresoure技术研究所的茶农场、属于悬铃木(chinary)型的茶树。也可以选择其它类型茶树即assamica和combad。但是，由于Himachal Pradesh的Kangra地区的悬铃木(chinary)型的优势，因此选择这种特殊纯系。
在本发明的一个优选实施方式中，确保了用于鉴定和克隆生长在野外田间条件下的茶树(Camellia sinensis L.(O.)Kuntze)灌木的顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的新的DNA序列的植物的基因组成相同。这对于茶之类的植物是很重要的。茶树是一种高度异花受粉植物、且由种子生长而成。由于不同的基因组成导致了植物与植物的巨大异种性。长成茶树的每一种子被认为是其自身的一个克隆。尤其是，对于涉及比较用于克隆受环境条件改变影响的差异表达基因的基因表达类型的发明，例如本发明的目的是比较和克隆从控制且冬眠植物所表达和阻抑的基因，经受环境条件改变的植物具有相同的基因组成是绝对必要的。认识到这一重要方面，就只能选择一种属于悬铃木(chinary)型的茶树。
在本发明的另一个实施方式中，在无休眠季节(4月)的早晨10点仅从一种灌木收集测量值为1.2-1.5(长)、0.5-0.6cm(周长)的茶树顶端幼芽。无休眠季节的顶端幼芽生长张开成叶子。这些称作无休眠幼芽(以下叫做ND)、并且被认为是“控制”在本发明的范围之内。该灌木产生了数量约100的顶端幼芽。用焦碳酸二乙基酯(以下叫做DEPC)处理的水[为了制备DEPC处理的水，将DEPC加入蒸馏水中至最终浓度为0.1％，接着培养过夜后进行高压灭菌(即在1.1kg/cm2的压力下于121℃加热)]洗涤顶端幼芽、收获并立即浸入液氮中以冷冻中止细胞活性的细胞成分。
茶树从11月之前开始休眠。此时期的顶端幼芽不会长大张开成叶子，这被称作休眠(以下叫做D)幼芽。从收集了ND幼芽的同一种灌木中收集D幼芽。基本上按与ND幼芽相同的方法采集和贮存D幼芽，其测量与ND幼芽大小相似。
从同样的灌木收集ND和D幼芽保证了所考虑的组织的基因组成相同。
在本发明的另一个实施方式中，分离来自ND和D幼芽的总RNA，采用“差异显示技术”(Liang，P.，Zhu，W.，Zhang，X.，Guo，Z.，O’Connell，R.，Averboukh，L.，Wang，F.和Pardee，A.B.1994.《核酸研究》221385-1386)以产生茶树的ND和D幼芽中的表达和阻抑基因的3’末端的光谱。
在本发明的一个优选实施方式中，将茶树的ND和D幼芽中的表达和阻抑基因的3’末端与一种载体连接得到重组质粒，它转化成形成一种克隆的适合的大肠杆菌宿主。载体，在本发明中是指能接受外源DNA的DNA序列、并且呈环状质粒DNA的形式，对所用的抗生素具有抗性。
在本发明的另一个实施方式中，对克隆的基因在茶树的ND和D幼芽中的表达或阻抑进行测试、以确定克隆的基因与休眠过程之间的联系。
在本发明的另一个实施方式中，用双脱氧链终止法(Sanger，F.S.，Nicklen，S.和Coulson，A.R.1997.Proc.Natl.Acad.Sci.美国745463-5467)对基因进行测序、以确定基因的单一性。
本发明还有一个实施方式，其中序列数据是用于获得有关基因调节的重要信息。
在本发明的另一个实施方式中，采用以下技术、例如但不限于农杆菌属介导的转化和Biallistic介导的转化，转移这些基因后，将新的基因用于调节植物的冬眠。
在本发明的另一个实施方式中，采用以下技术、例如但不限于农杆菌属介导的转化和Biallistic介导的转化，转化这些基因后，用植物中的新基因调节冬眠是可能的，该植物例如但不限于，茶树、李树、樱桃树、桃树、紫杉属、苹果树、梨树、藤本植物、葡萄树、橄榄树、猕猴桃果树、无花果树、桑属、草莓树、覆盆子树、越橘树、黑莓树、罗苷莓树、杏树、胡桃树和栗树。
在本发明的另一个实施方式中，新基因的序列数据可用于获得有关基因调节的重要信息以用于调节转基因中的基因表达。
在本发明的另一个实施方式中，涉及cDNA和基因组DNA用于合成单一蛋白质和单一蛋白质用于产生抗体的其它应用。
在本发明的另一个实施方式中，涉及本发明抗体用作找寻在其它植物、动物和/或微生物系统或类似系统中的相似蛋白质的探针。
在本发明的另一个实施方式中，涉及本发明的新序列、cDNA和基因组DNA用作找寻在其它植物、动物和/或微生物系统和类似系统中的核苷酸序列的探针。
在本发明的另一个实施方式中，涉及本发明的新序列、cDNA和基因组DNA用作找寻在其它植物、动物和/或微生物系统和类似系统中的这些核苷酸序列的表达的探针。
在本发明的另一个实施方式中，涉及一种使已鉴定的基因与如序列ID1所述的茶幼芽的休眠过程相互关联的方法，它是唯一的。
在本发明的另一个实施方式中，涉及一种可也用于其它序列ID的方法。
在本发明的另一个实施方式中，涉及一种可用于其它农作物的方法，该农作物例如但不限于，李树、樱桃树、桃树、紫杉属、苹果树、梨树、藤本植物、葡萄树、橄榄树、猕猴桃果树、无花果树、桑属、草莓树、覆盆子树、越橘树、黑莓树、罗苷莓树、杏树、胡桃树和栗树，和用于使相似的基因相互关联的方法。
通过下列实施例将对本发明更详细地举例说明。这些实施例仅仅是为了举例说明本发明目的，而不应视为对本发明进行限定，权利要求书中对本发明进行了恰当的描述。
具体实施例方式
实施例1RNA分离、使用DN酶1的RNA的消化、RNA的量化和凝胶电泳为了保证从茶树的ND和D幼芽得到高质量的核糖核酸(以下叫做RNA)，使用RN酶(RNeasy)植物小试剂盒(从德国的M/s.Qiagen购得)。根据厂家的说明分离RNA。通过在260nm测定吸光度来使RNA量化，并通过计算在260nm和280nm所测得的吸光度之比来监测纯度。一般认为在260/280nm的值＞1.8是本研究的目的所需。用于计算RNA浓度和产量的等式如下RNA的浓度(μg/ml)＝A260(260nm的吸光度)×40×稀释因子总产量(μg)＝浓度×备用的RNA样品的体积为了检验RNA的完整性，用15.5μl的M1溶液(2μl的5X MOPS缓冲液，3.5μl甲醛和10μl甲酰胺[5X MOPS缓冲液300mM醋酸钠、10mM MOPS(3-{N-吗啉}丙磺酸)、0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA))稀释4.5μl中的5-6λg的RNA，并在65℃培养15分钟。加入2μl甲醛-凝胶加样缓冲液[50％甘油、1mM EDTA(pH 0.8)、0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯氰FF]后，将RNA加样在1.5％甲醛琼脂糖凝胶上，并在1X MOPS缓冲液(60mM醋酸钠、2mM MOPS、0.1mM EDTA)中于72伏进行电泳(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.1989《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室出版，Plainview，纽约)。
为了除去剩余的DNA，在1X反应缓冲液[10X反应缓冲液100mMTris-Cl(pH 8.4)、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％明胶]中于37℃用10单位的DN酶I消化RNA(10-50λg)30分钟(从美国M/s.GenHunter公司购得的)。通过加入PCI(比例为25∶24∶1的酚、氯仿、异戊基醇)沉淀DN酶I、并通过加入0.3M醋酸钠中的3体积乙醇沉淀含水相中的RNA。于-70℃培养3小时后，沉淀RNA，用冷冻的70％乙醇冲洗，最后溶解在10μl无RN酶的水中。对如此获得的无DNA的RNA进行量化，并按上述检验完整性。
图1描述了RNA的质量。虽然我们采用了德国M/SQuiagen的Rneasy柱，但其它方法也可用于分离茶的顶端幼芽。
实施例2通过逆转录(以下叫做RT)使mRNA转化成互补DNA(以下叫做cDNA)用一种已知酶作为逆转录酶、将0.2μg休眠和无休眠样品的无DNA的RNA在分离反应中进行逆转录。用0.2μM的T11M引物(T11M中M可以是T11A、T11C或T11G)、20μM的dNTP、RNA和RT缓冲液[25mM Tris-Cl(pH8.3)、37.6mM KCl、1.5mM MgCl2、和5mM DTT]完成该反应。在本发明中，dNTP是指脱氧腺苷三磷酸(以下叫做dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(以下叫做dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(以下叫做dCTP)和脱氧胸苷三磷酸(以下叫做dTTP)。对三种RT反应设定对应于T11M引物的每个RNA样品。在热循环器(thermocycler)(M/s Perkin-Elmer 480型)中完成这些反应。所选择的用于转录的热循环器参数为65℃、5分钟→37℃、60分钟→75℃、5分钟→4℃。于37℃培养10分钟后，在每一反应中加入100单位逆转录酶，然后继续反应50分钟。这样得到图2所示的cDNA。两种不同RNA(ND和D)与3种T11M引物结合得到总共6种反应，该反应描述了6种不同类型的cDNA。用3种不同的T11M引物将全部RNA群分成由锚式碱基M而确定的3个亚类，可以是A、C或G(逆转录系统是美国M/s.GenHunter公司的RNA显象试剂盒的一种成分)。
实施例3通过差异显示技术产生差异表达基因的光谱差异表达基因的鉴定将实施例2所获得的休眠和无休眠RT产品的不同cDNA亚类在放射性标记的dNTP中扩增、以通过聚合酶链反应(以下叫做PCR；PCR方法为Hoffman-La Roche公司拥有的专利所保护)标记扩增的产品。在20μl反应混合物中完成放射性PCR，该反应混合物包括(1)反应缓冲液[10mM Tris-Cl(pH 8.4)、50mM KCl、1.5mMMgCl2、0.001％明胶]，(2)2μMdNTP，(3)0.2μM T11M和(4)0.2μM任意引物(化学试剂1-4是作为RNA显象试剂盒的一部分从美国Nashville的M/s.GenHunter公司购买的)、0.2μl α[33P]dATP(约2000 Ci/mmole，从印度JONAKI中心、CCMB campus Hyderabad购得)、和1.0单位栖热水生菌(以下叫Taq)DNA聚合酶(从德国M/S.Qiagen购得)。将30μl高压灭菌的矿物油覆盖在每一反应的顶部、以避免因蒸发而导致体积改变。每一反应中的T11M引物是用于合成cDNA的同样引物。所选择的参数为94℃、30秒→40℃、2分钟→72℃、30秒，共进行40个循环；以及72℃、5分钟1个循环，最后在4℃培养。
在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上将扩增产品分级。为了此目的，将每3.5μl扩增产品与2μl加样染料[95％甲酰胺、10mM EDTA(pH 8.0)、0.09％二甲苯氰FF和0.09％溴酚蓝]混合，于80℃培养2分钟，并在6％变性聚丙烯酰胺凝胶[变性聚丙烯酰胺凝胶15ml丙烯酰胺(20∶1的丙烯酰胺和双丙烯酰胺的40％贮备液)、10ml的10X TBE、40ml蒸馏水和50g尿素]上加样。用1X TBE缓冲液[10 X TBE108g Tris碱、55g硼酸和40ml0.5M EDTA(pH 8.0)]作为流动缓冲液在60瓦特进行电泳直至二甲苯氰(移动较慢染料)达到玻璃平板的较低端。测序(变性聚丙烯酰胺)凝胶装置的较大平板的大小为13×16英寸。电泳后，去除一个玻璃平板、将凝胶转移至3MM Whattman滤纸上。在80℃将凝胶干燥过夜、并暴露于Kodak X-线薄膜2-3天。在暴露于X-线薄膜之前，为了进一步排列用放射性墨水标记干凝胶的角。图3-11显示了展开薄膜后所见的茶树的ND和D顶端幼芽中的差异表达基因的光谱。展开凝胶后，分析薄膜的ND和D信号之间的差异表达条带。
用于差异显示的引物的序列(作为RNA显象试剂盒的一部分，从美国M/s.GenHunter公司购得)如下T11M(锚式)引物 引物序列T11A 5’-AAGCTTTTTTTTTTTTTA-3’T11C 5’-AAGCTTTTTTTTTTTTTC-3’T11G 5’-AAGCTTTTTTTTTTTTTG-3’任意引物 引物序列AP1 5’-AAGCTTGATTGCC-3’AP2 5’-AAGCTTCGACTGT-3’AP3 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’AP4 5’-AAGCTTCTCAACG-3’AP5 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’AP6 5’-AAGCTTGCACCAT-3’AP7 5’-AAGCTTAACGAGG-3’AP8 5’-AAGCTTTTACCGC-3’AP33 5’-AAGCTTGCTGCTC-3’AP34 5’-AAGCTTCAGCAGC-3’AP35 5’-AAGCTTCAGGGCA-3’AP36 5’-AAGCTTCGACGCT-3’
AP37 5’-AAGCTTGGGCCTA-3’AP38 5’-AAGCTTCCAGTGC-3’AP39 5’-AAGCTTTCCCAGC-3’AP40 5’-AAGCTTGTCAGCC-3’AP65 5’-AAGCTT CAAGACC-3’AP66 5’-AAGCTT GCCTTTA 3’AP67 5’-AAGCTT TATTTAT-3’AP68 5’-AAGCTT CTTTGGT-3’AP69 5’-AAGCTT AATAACG-3’AP70 5’-AAGCTT TCATATG-3’AP71 5’-AAGCTT GTAGTAA-3’AP72 5’-AAGCTT TCAAAGA-3’实施例-4cDNA探针的再扩增克隆差异表达带需要从变性聚丙烯酰胺凝胶的同样洗脱和进一步扩增以得到足够量用于克隆的DNA。放射自显影图(展开的X线薄膜)用加有放射性墨水的干凝胶定位、并用无菌的锋利剃刀切下已鉴定的差异表达条带(随同凝胶和滤纸)。通过在微量离心管中的100μl无菌水中培养10分钟洗脱DNA，接着煮沸10分钟。通过于10,000rpm下旋转2分钟使纸和凝胶残渣沉淀、将含DNA的上清液转移至一新试管中。用10μl的3M醋酸钠、pH 5.5、5μl糖原(储备液；10mg/ml)和450μl的乙醇沉淀DNA。在-70℃培养过夜后，在10,000rpm下于4℃离心10分钟，再用85％乙醇冲洗沉淀的DNA。将DNA沉淀溶解在10μl无菌蒸馏水中。用同一套T11M和用于进行如实施例3所示的差异显示的任意引物扩增洗脱的DNA。还有，除了dNTP浓度为20μM而不是2μM、不加入同位素外，PCR条件相同。将反应升高至40μl并在PCR结束后，30μl的PCR样品在置于TAE缓冲液(TAE缓冲液0.04M Tris-醋酸、0.002 EDTA，pH 8.5)中的1.5％琼脂糖凝胶上流动，该缓冲液包含溴化乙锭(最终浓度0.5μg/ml)。将剩余的扩增产品贮存于-20℃以为克隆所用(见
图11-14)。
实施例5再扩增的PCR产品的克隆用1X连接缓冲液(10X连接酶缓冲液500mM Tris-Cl pH 7.8、100mMMgCl2、100mM DTT、10mM ATP、500μg/ml BSA)中的200单位的T4DNA连接酶将实施例4所获得的再扩增PCR成品连接在300ng叫做PCR-TRAP载体的插入型载体中。载体和所需的其它化学试剂是从美国Nashville的M/s.GenHunter公司以PCR-TRAP克隆系统的名称购买的。在美国M/s.Perkin Elmer的480型热循环器中于16℃连接16小时。PCR产品与上述载体连接得到环化质粒。本发明中，诸如本发明的PCR产品的外源DNA与适合的载体例如PCR-TRAP载体的这种连接过程就叫做克隆。还有其它市售的载体或者适合PCR产品的克隆的其它载体，因此也可以使用。质粒，如所定义的，它是一种封闭的环状DNA分子、存在于诸如不依赖于染色体的DNA的大肠杆菌(以下称E.coli)的适合的宿主细胞中，它具有对抗抗生素的抗性。PCR-TRAP载体产生的质粒对四环素具有抗性。
连接产品或质粒需要置于适当的大肠杆菌宿主中，该宿主通过一种叫做转化的方法进行繁殖和增殖。将如上所得到的连接产品(10μl)用于转化100μl大肠杆菌细胞成分(从美国M/s.GenHunter公司以PCR-TRAP克隆系统的名称购得)。成分意指能接受质粒DNA的大肠杆菌细胞。为了此目的，混合连接产品和细胞成分，在冰上放置45分钟，热激2分钟，再在0.4ml的LB培养基(LB∶1l∶10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠)中培养4小时。将200μl转化细胞在LB-四环素(对1l添加10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和四环素，得到20μg/ml的最终浓度)平板上进行平板接种、并在37℃生长过夜。标记克隆、并将单分离的克隆在LB-四环素平板上再划线以得到同种克隆。四环素能抗大肠杆菌细胞显然提示已经克隆了PCR产品即鉴定基因。
在整个上述方法中，选择T11M引物可扩增mRNA的多A尾区。多A尾总是与基因的3’端相连，因此T11M引物与任意引物结合总是得到基因的3’区。
实施例6检测PCR产品的大小一旦基因被克隆且大肠杆菌被转化后，就有必要检测质粒是否接受了恰当大小的PCR产品。通过进行集落PCR完成此检测，其中集落被裂解、裂解物随后用于进行采用适当引物的PCR。然后将扩增产品在琼脂糖凝胶上分析。
从再划线的平版(实施例5)收起单分离克隆并在50μl集落裂解缓冲液(集落裂解缓冲液TE(Tris-HCl 10mM，1mM EDTA，pH 8.0)和0.1％吐温20)中通过沸腾10分钟进行裂解。沉淀细胞残渣，将上清液或含模板DNA的集落裂解物用于PCR。PCR成分基本上与实施例4相同，除外使用了T11M和任意引物Lgh(5’-CGACAACACCGATAATC-3’)和Rgh(5’-GACGCGAACGAAGCAAC-3’)引物，以及在洗脱DNA中使用了2μl集落裂解物。反应体积也减至20μl。用于集落PCR的PCR条件94℃、30秒→52℃、40秒→72℃、1分钟，共进行了30个循环；接着进行72℃、5分钟的1个循环，最后浸泡成4℃。扩增产品与分子重量标记在1.5％琼脂糖凝胶上流动，并分析校正插入片段的大小。当使用Lgh和Rgh旁侧引物，由于旁侧载体序列被扩增，克隆的PCR产品的大小增大了120bp(见
图15-17)。
实施例7通过Northern印迹法证实差异表达上面克隆的PCR产品代表差异表达基因的3’末端。在本发明中，将这些克隆的DNA片段叫做基因。由于差异显示总是引起假象(falsepositives)即显著差异表达基因(Wan，J.S.和Erlander，M.G.1997.“通过采用差异显示和扣除杂交法克隆差异表达基因”，在《分子生物学方法》85卷“差异显示方法和策略”中，Liang，P.和Pardee，A.B.编辑，Humana出版公司，Totowa，NJ，第45-48页)，必须用通过Northern分析的证实试验确定ND和D顶端幼芽之间的差异表达。Northern分析需制备放射性标记探针、然后用印迹在一种膜上的变性RNA进行杂交。
在Northern分析中将实施例6的扩增产品用作探针。在1.5％琼脂糖凝胶上将扩增产品显色后，从凝胶中切下，根据厂商说明使用德国M/s.Qiagen的QIAEX II凝胶提取试剂盒从凝胶中洗脱DNA。
根据厂商说明使用美国Nashville的M/s.GenHunter公司的HotPrime试剂盒、用α[32P]dATP(4000 Ci/mmole)对纯化片段进行放射性标记。用QIA快速核苷酸去除试剂盒(QIAGEN，德国)纯化放射性标记探针、以去除未结合的放射性核苷酸，为了印迹，基本上按实施例1所述使20μl的RNA在1.0％甲醛琼脂糖凝胶上流动。一旦流动完成后，在DEPC处理的高压灭菌水中洗涤凝胶两次共20分钟、每次同时振荡。然后在10X SSPE(1.5M氯化钠、115mMNaH2PO4、10mM EDTA)中洗涤凝胶两次共20分钟、每次同时振荡。同时将尼龙膜(boehringer mannheim cat.no.#1209272)在DEPC水中浸湿、然后在10X SSPE(1.5M氯化钠、115mM NaH2PO4、10mM EDTA)中浸泡5分钟、并轻轻振荡。然后用DEPC处理的10X SSPE(1.5M氯化钠、115mMNaH2PO4、10mM EDTA)作为转移基质、将凝胶中的DNA在尼龙膜上进行真空印迹(采用的压力为40mbar)。进行4小时转移。将压力增至70mbar共15分钟、之后才从真空印迹装置中放出凝胶。转移后，去除凝胶，在紫外光源下于尼龙表面上标记RNA标记的定位。将膜干燥、并在80℃烘烤45分钟。在5X SSPE(20X SSPE3M氯化钠、230mM磷酸钠、20mM EDTA)中简单冲洗后，将膜浸在预杂交液(50％甲醛、0.75M氯化钠、50mM磷酸钠、pH 7.4、5mM EDTA、0.1％Ficoll-400、0.1％BSA、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％SDS溶液和150μg/ml新鲜煮沸的鲑精液DNA)中5小时。
通过煮沸10分钟使较早合成的放射性探针变性、然后加入预杂交液浸渍印迹膜。进行16小时杂交。去除溶液、并用含0.1％SDS的1X SSC(20X SSC；3M氯化钠和0.3M柠檬酸钠二水合物、pH 7.0)于室温下洗涤此膜两次、每次15分钟。在50℃用含0.1％SDS的预温0.25X SSC进行最后洗涤15分钟。除去膜、将其包裹在莎纶包中、并根据信号的强度将其暴露于X线薄膜12-240小时。
进行Northern杂交时，将ND和D顶端幼芽的RNA在膜上进行印迹并测试选择的探针。
图18-19显示了4个这种探针的结果、并证实了ND和D顶端幼芽之间的差异表达。
31.2(T11C，AP37)主要是基因的3’末端区域，如
图19所示它在Northern印迹上杂交成0.96kb大小的转录物。
21.2(T11C，AP7)主要是基因的3’末端区域，如
图18所示它在Northern印迹上杂交成0.96kb大小的转录物。
53.1(T11A，AP34)主要是基因的3’末端区域，如
图19所示它在Northern印迹上杂交成0.95kb大小的转录物。
44.3(T11G，AP33)主要是基因的3末端区域，如
图18所示它在Northern印迹上杂交成1.75kb大小的转录物。
实施例8使鉴定基因与茶树幼芽的休眠相关联的方法我们克隆了上面实施例6所鉴定的4种差异表达基因。为了进一步使这些差异表达基因与休眠现象相关联，用植物生长调节剂赤霉酸(以下称GA3)使冬季休眠灌木终止幼芽休眠。将GA3溶解在5％乙醇中至最终浓度为5μM。在12月期间的同一天，用植物刷将这种溶液用于每一休眠幼芽上涂刷至少4次。有规律地记录幼芽长度及其周长、作为其生长的指征。从20个幼芽中仅10个幼芽显示了与GA3对应的生长增强(休眠停止)。将这些称作强制ND顶端幼芽。收集这些幼芽并按实施例1所述贮存，它们可用于Northern分析中的RNA分离。
关于这样一种实验，在尼龙膜上将ND、D和强制ND的RNA进行印迹、并用ND(31.2)探针探测。所涉及的各种方法在实施例6中已经进行了描述。
从图20可见，与ND相比，D顶端幼芽中的用于探测的基因表达呈现下调(即显示较少表达)。而在强制ND中基因出现上调(即显示超量表达)。因此，证实了基因31.2(序列ID No.1，本发明在实施例8中进行了详细说明)确实是一种休眠相关性基因。相似的方法也可适用于其它基因。
实施例9对鉴定的克隆测序用从美国M/s.Amersham Pharmacia Biotech购买的T7测序酶版本2测序试剂盒对每个克隆进行手工测序。所用的测序引物为[Lgh(5’-CGACAACACCGATAATC-3’)或Rgh(5’-GACGCGAACGAAGCAAC-3’)](1)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度305碱基对(B)类型核酸(C)链双(D)拓扑结构环状(i)分子类型cDNA(ii)序列说明SEQ ID NO1Seq ID No.1#3 1.2克隆的序列5′-ATCGCCGTAA TTGCCATGTT TTCCCTCTCA CCGGAATCCT ACGTTATCC CCTTACCTTC GTGAACATTA CAGTAGGAAT CGGTGGTCCAATTATCAACT TAATTTTGGG CGCATCTGTT CGTGTTAACT AGAAGCCATGTATACATACA ATACAACATG GTTCACTCCT CCTACAGATT ATGAGTTGAACTTTTATAAT AAGTTGTAAT AATGGCTTCT GAATAAGGAG AAGAGGAGCCTCTGTTTGTT TTACTTATTA CAGATGTGAT ATCGTTCAAC AACTTTGATTCTGCGAAAAA AAAAA-3′(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度297碱基对(B)类型核酸(C)链双(D)拓扑结构环状(ii)分子类型cDNA(iii)序列说明SEQ ID NO2
Seq ID No.1#21.2克隆的序列5′- AGAAGTACCT GAAAGGAAGC TTAACGAGGT GAACATCCATTGCAGCCAGC CCTGGAATCT GTACAGGGCA ACTCTGAACC GGAATTATTTTAATAACCCG TGGGCAATGA TTGCAATTAT GGCTCGTTTG GTATTACTTCTACTCACTTA GACACAACTG TATTTACGGT TTTCGCTGGA ATTGTAATTGTTGGAGCGAC AAAATAGATG GTCACAACTT ATTGGTGAGA GTATCAGTGTGCTCTTCTTT ATCGTCTTTA ACTCTCCGTG GTAATTACTT TGACAATATTCATACAT-3′(3)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度239碱基对(B)类型核酸(C)链双(D)拓扑结构环状(ii)分子类型cDNA(iii)序列说明SEQ ID NO3Seq ID No.1#53.1克隆的序列5′-GAGACTCAGC TCAGCAATCA TGTTCTAAGT GAATGTCACT CTATCGCCTTCTTGTCCCTC TTAGACATAC TACATCCTCA TTCTGCTAGA AATGAACTCATGTAGGTTTT GAAGTTGGGA ACTTTTGAAA CTGTGTTGTT TGGGTGCTGTCTGTTATACA ATTCTCTCAA CTGCGGAGAA TTGACGTTGG TTGTAGTGGAATTCAACACT TGGGTTTTGT TCTTAGTTAA AAAAAAAAA-3′(4)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度228碱基对(B)类型核酸(C)链双(D)拓扑结构环状(ii)分子类型cDNA(iii)序列说明SEQ ID NO4
Seq ID No.1# 44.3克隆的序列5′-ATAGCTTAGT CACGTGTCTC TTGAGAATGGACTACGTAGTTGTTAAGTTG GGTGATCAGA AGGCGTTGAT GATGAATGTA TGAAGCAGAGACTACTGAAT GTAATTTTGT TGTTGAAAGA TGAATGATTT ATTAATGCCTGCATATCTTT CTATTGTTTG ATGCCAAACC TTTGGGCACA TTTTTTCTTTCTTTTTGTGA TAATGTTCTC TTCTTGCAAA AAAAAAAA-3′实施例10序列分析将每个克隆进行BLAST分析，发现这些克隆是单一的。
本发明的主要优点为(a)克隆了生长在野外田间条件下的Camellia sinensis L.(O.)Kuntze(茶)灌木或树种的顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的新的DNA序列；(b)已经具有从同样基因组成的茶树中克隆了这些序列；(c)已经得到了生长在野外田间条件下的茶树的无休眠和休眠顶端幼芽中的表达和阻抑基因的3’末端的光谱；(d)已证实了用于确立生长在野外田间条件下的茶树的顶端幼芽中冬眠期间的差异表达的差异表达基因的已鉴定3’末端；(e)已描述了使已鉴定基因与生长在野外田间条件下的茶树幼芽的休眠相关联的方法；(f)根据迄今未在数据库中所存放的新序列，对差异表达基因的克隆3’末端进行测序具有单一性。
附录1下列数据库站点的结果http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.maphttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.map序列ID1的结果(31.2，T11CAP37)查寻序列所得到的14个胚胎细胞的分布 {PRIVATE} 分数产生显著性排列的序列 (位数)E值gi|4156134 gb|AC005091.1|AC005091Homo sapiens BAC clone CT...420.17gi|21O61799|emb|AL237127.7|AL137127Human DNA sequence from...420.17gi|9186966|emb|AL161744.7|AL161744Human DNA sequence from...400.69gi|5001496|gb|AC007319.2|AC007319Homo sapiens BAC clonc RP...382.7gi|3850563|gb|AC005943.1|AC005943Homo sapiens chromosome l...382.7gi|11121047|emb|AL356787.11|AL356787Human DNA sequence fro...382.7gi|8216586|emb|AL139195.3|CNS01DXCHuman chromosome 14 DNA ...382.7gi|3650382|emb|AL030995.1|HS1170D6Human DNA sequence from ...382.7gi|854638|emb|X87335.1|XXEVCGEncephalomyocarditis virus co...382.7gi|44207|emb|X06414.1|MCRPCLUSMycoplasma capricolum riboso...382.7gi|323856|gb|M37588.1|EMCDIABEncephalomyocarditis virus， d...382.7gi|323854|gb|M22458.1|EMCDCGEncephalomyocarditis (EMC) vir...382.7gi|323852|gb|M22457.1|EMCBCGEncephalomyocarditis (EMC) vir...382.7gi|1212874|emb|X87215.1|CLC3GENEC.limosum C3 gene382.7Alignmcnts>gi|4156134|gb|AC005091.1|AC005091Homo sapiens BAC clone CTA-318C11 from7p14-p15，complete sequenceLength＝110535Score＝42.1 bits (21)，Expect＝0.17Identities＝21/21 (100％)Strand＝Plus/MinusOuery158tggttcactcctcctacagat 178|||||||||||||||||||||Sbjct87291 tggttcactcctcctacagat 87271>gi|11061799 emb|AL137127.7|AL137127Human DNA sequence from clone RPS-1126H10 on chromosome lp34.3-35.3，complete sequence(Homo sapiens)Length＝98832
27-MAR-01 0032ID91+11+6533889 K AND SSTART TIME 27-MAR-01 0022TELEPHONE NUMBER 0017132202302NAME(ID NUMBER) Akin，GumpTRANSMISSION MODE SECMRESOLUTION STDPAGES TRANSMITTED 026CONFIDENTIALOFFSECURITYOFFINFORMATION CODEOKREDIALING TIMES 00MACHINE ENGAGED 09·15JOB NUMBERTHIS XMT IS COMPLETED.
LAST SUCCESSFUL PAGE026
附录2下列数据库站点的结果http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.maphttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.map序列ID2的结果(21.2，T11CAP7)查寻序列所得到的4个胚胎细胞的分布 {PRIVATE} 分数产生显著性排列的序列 (位数)E值gi|13324737|gb|AC009457.8|AC009457Drosophila melanogaster，...382.6gi|13122705|gb|AC009904.6|AC009904Drosophila melanogaster，...382.6gi|7299945|gb|AE003707.1|AE003707Drosophila melanogaster g...382.6gi|2393736|gb|AC002540.1|AC002540Human BAC clone GS1-25M2...382.6Alignments>gi|13324737|gb|AC009457.8|AC009457Drosophila melanogaster，chromosome 3R，region 88E-88E，BAC cloneBACR25A06，complete sequenceLength＝170163Score＝38.2 bits(19)，Expect＝2.6Identities＝19/19 (100％)Strand＝Plus/MinusQuery106aatgattgcaattatggct 124|||||||||||||||||||Sbjct120373 aatgattgcaattatggct 120355>gi|13122705|gb|AC009904.6|AC009904Drosophila melanogaster，chromosome 3R，rcgion 88E-88E，BAC cloneBACR32A03，complete sequenceLength＝182602Score＝38.2 bits(19)，Expect＝2.6Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/Minus
附录3下列数据库站点的结果http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.maphttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.map序列ID3的结果 (53.1，T11AAP34)查寻序列所得到的42个胚胎细胞的分布 {PRIVATE} 分数产生显著性排列的序列 (位数) E值gi|12740602|gb|AC005079.6|AC005079Homo sapiens clone CTA-2...400.53gi|3819275|emb|AJ234492.1|HVU234492Hordeum vulgare genomic...400.53gi|10440603|gb|AC020914.7|AC020914Homo sapiens chromosome...382.1gi|9630683|ref|NC 001934.1|Potato yellow mosaic virus A co...382.1gi|5731403|gb|AC007870_3|AC007870Genomic sequence for Homo...382.1gi|4206727|gb|AF096911.1|AF096911Agaricus benesi mitochond...382.1gi|4206726|gb|AFC96910.1|AF096910Agaricus subfloccosus mit...382.1gi|4206724|gb|AF096909.1|AF096909Agaricus subrutilescens R...382.1gi|4206722|gb|AF096908.1|AF096908Agaricus bitorquis RNA po...382.1gi|11121078|emb|AL391385.8|AL391385Human DNA sequence from...382.1gi|1067078|emb|Z35604.1|CEZK1058Caenorhabditis elegans cos...382.1gi|6967817|emb|AL139075.2|CJ11168X2Campylobacter jejuni NC...382.1gi|2931|emb|X63075.1|MIABDRNAgaricus bitorquis mitochondri...382.1gi|644777|gb|U19744.1|CEU19744Caenorhabditis elegans integ...382.1gi|222458|dbj|000940.1|PYVVAPotato yellow mosaic virus (PY...382.1gi|11417453|ref|XM 004088.1|Homo sapiens mitogen-activated...368.3gi|12408747|gb|AC021640.7|ATAC021640Arabidopsis thaliana c...368.3gi|12408741|gb|AC015985.10|ATAC015985Arabidopsis thaliana...368.3gi|11497621|ref|NC 000917.1|Archaeoglobus fulgidus，comple...368.3gi|12000466|gb|AC073936.11|AC073936Mus musculus 11 BAC RP2...368.3gi|6466296|gb|AF022186.2|AF022186Cyanidium caldarium strai...358.3gi|11465393|ref|NC001840.1|Cyanidium caldarium chloroplas...368.3gi|4503068|ref|NM 001315.i|Homo sapiens mitogen-activatcd...368.3gi|9558585|gb|AC020967.2|AC020967Mus musculus chromosome l...368.3gi|2734100|gb|AC003009.1|UUAC003009Homo sapiens Chromoeomc...368.3gi 6249676|gb|AC005660.3|AC005660Cirb_163_9_10，complete s...368.3gi 5031218|gb|AF105034.1|AFi05034Arabidopsis thaliana delt...368.3gi 4234767|gb|AF069466.1|AF069468Arabidopsis thaliana ster...368.3gi|4731431|gb|AF061787.1|AF061787Escherichia coli plasmid...368.3
附录4下列数据库站点的结果http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.maphttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast form.map序列ID4的结果 (44.3，T11g，AP33)查寻序列所得到的312个胚胎细胞的分布
分数产生显著性排列的序列 (位数)E值gi|4630763|gb|AC007350.1|AC007350Homo sapiens clone RP11-2...460.008gi|12545293|gb|AC034226.5|AC034226Homo sapiens chromosome...420.13gi|1628081|emb|Z81107.1|CER07H5Caenorhabditis elegans coam...420.13gi|4775629|emb|AL035416.7|HS782L23Human DNA sequence from ...420.13gi|2969943|emb|AL022148.1|HS435A7Homo sapiens DNA sequence...420.13gi|3087791|emb|Y15155.1|HSY15155Homo sapiens PHKB gene，ex...420.13gi|3892723|emb|AJ012821.1|CAR012821Cicer arietinum mRNA fo...420.13gi|8748927|gb|AC012502.3|AC012502Homo sapiens BAC clone RP...400.51gi|1679964|gb|S43579.1|S43579c-scr-pp60c-src，sdr-src down...400.51gi|4662612|gb|AC006582.13|AC006582Pan troqlodytes 12cp12 B...400.51gi|9988323|emb|AL354984.17|AL354984Ruman DNA sequence from...400.51gi|11907388|emb|AL445675.9|AL445675Human DNA sequence from...400.51gi|11137694|emb|AL162414.11|AL162414Human DNA sequence fro...400.51gi|886464|emb|Z49969.1|CEW01C9Caenorhabditis elegans cosmi...400.51gi|6983473|emb|AL133216.10|AL1332l6Human DNA sequence from...400.51gi|9367248|emb|AL389890.1|NCB24P7Neurospora crassa DNA lin...400.51gi|397651|gb|U01148.1|CHKSRC3Gallus gallus c-src protein(...400.51gi|13435608|gb|BC004681.1|BC004681Mus musculus，clone MGC...382.0gi|13096025|gb|AC011253.4|AC011253Drosophila melanogaster，...382.0gi|13096038|gb|AC008312.4|AC008312Drosophila melanogaster，...382.0gi|12831408|gb|AC009237.3|AC009237Homo sapiens clone RP11-...382.0gi|12739794|gb|AC087731.2|AC087731Felis catus clone RP86-4...382.0gi|11434370|ref|XM 003123.1|Homo sapiens ATPase，Ca++ tran...382.0gi|12583768|gb|AC008779.5|AC008779Homo sapiens chromosome...382.0gi|11094957|gb|AC084507.1|CBRG15B09Caenorhabditis briggsae...382.0gi|7656909|ref|NM 014382.1|Homo sapiens ATPase，Ca++ trans...382.0gi|10727101|gb|AE003671.2|AE003671Drosophila melanogaster...382.0gi|7684378|gb|AC022336.12|AC022336Homo sapiens 3 BAC RP11-...382.0gi|6826913|gb|AF189723.2|AF189723Homo sapiens calcium tran...382.0gi|6598643|gb|AC006951.5|AC006951Arabidopsis thaliana chro...382.0gi|2323254|gb|AC002407.1|AC002407Human Chromosome X，compl...382.0gi|6715130|gb|AF181120.1|AF181120Homo sapiens chromosome 3...382.0gi|4960088|gb|AF149981.1|AF149981Nicotiana tabacum sucrose...382.0gi|4699959|gb|AC006014.2|AC006014Homo sapiens PAC clone RP...382.0gi|5836194|gb|AC005468.2|AC005488Homo sapiens clone NH0313...382.0gi|2935483|gb|AF048727.1|AF048727Homo sapiens minisatellit...382.0gi|4309859|gb|AC005543.2|AC005543Homo sapiens chromosome 4...382.0gi|13276603|emb|AL121972.17|HSJ397H23Human DNA aequence fr...382.0gi|3646133|emb|AJ010953.1|HSA010953Homo sapiens mRNA for p...382.0gi|3970929|gb|AC006133.1|AC006133Homo sapiens Chromosome l...382.0
SEQUENCE LISTING<110>科学与工业研究委员会<120>茶树顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的新的基因序列的克隆<130>PIF050654C<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>297<212>DNA<213>Camellia sinensis<400>1agaagtacct gaaaggaagc ttaacgaggt gaacatccat tgcagccagc cctggaatct60gtacagggca actctgaacc ggaattattt taataacccg tgggcaatga ttgcaattat 120ggctcgtttg gtattacttc tactcactta gacacaactg tatttacggt tttcgctgga 180attgtaattg ttggagcgac aaaatagatg gtcacaactt attggtgaga gtatcagtgt 240gctcttcttt atcgtcttta actctccgtg gtaattactt tgacaatatt catacat 29权利要求
1.Camellia sinensis L.(O.)Kuntze茶树或树种的顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的新的DNA序列，所述的序列为以下所示的序列IDNO25′-AGAAGTACCT GAAAGGAAGC TTAACGAGGT GAACATCCATTGCAGCCAGC CCTGGAATCT GTACAGGGCA ACTCTGAACC GGAATTATTTTAATAACCCG TGGGCAATGA TTGCAATTAT GGCTCGTTTG GTATTACTTCTACTCACTTA GACACAACTG TATTTACGGT TTTCGCTGGA ATTGTAATTGTTGGAGCGAC AAAATAGATG GTCACAACTT ATTGGTGAGA GTATCAGTGTGCTCTTCTTT ATCGTCTTTA ACTCTCCGTG GTAATTACTT TGACAATATTCATACAT-3′。
2.SEQ ID NO2的DNA用于表征植物处于休眠期和非休眠期状态。
全文摘要
本发明涉及Camellia sinensis L.(O.)Kuntze茶树的顶端幼芽中冬眠期间所表达和阻抑的新的基因序列的克隆，尤其是，涉及茶的冬眠顶端幼芽中所表达和阻抑的基因(本发明基因是指脱氧核糖核酸DNA)序列的新的引物3(以下称作3’)末端的鉴别、克隆和分析。3’末端是指在DNA分子的碳水化合物部分的第3位置具有游离羟基的DNA的末端。
文档编号A01H1/00GK1664102SQ20051006512
公开日2005年9月7日 申请日期2001年3月30日 优先权日2001年3月30日
发明者桑贾伊·库马尔, 拉赫维尔·拉尔, 帕拉姆威尔·辛格·阿胡贾 申请人:科学与工业研究委员会