繁殖去除构筑体的制作方法

专利名称：：繁殖去除构筑体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及繁殖发育的调控。具体说来，本发明涉及被子植物和裸子植物中繁殖组织的基因去除。本发明提供繁殖优选启动子(Reproductive-preferredpromoter)、调控元件和细胞毒素核苷酸序列。本发明中还包括基因去除的构筑体和方法。
背景技术：
：随着植物基因工程技术的发展，基因修饰作物的生态学含义关系极其重大，尤其当不存在固有屏障通过有性繁殖散布转基因时更是这样。尤其，在可通过杂交将转基因从转基因植物散布到杂草物种或作物本身以杂草形式存在的情况下已出现问题。Bergelson等人，Nature395:25(1998)。一种解决所述问题的方式是通过完全去除繁殖结构以基因工程设计使植物不育。近来，使用去除系统控制植物的繁殖发育已引起广泛关注。已通过基因去除在多种植物中达成繁殖控制，所述基因去除使繁殖优选启动子与细胞毒素基因连接以去除繁殖细胞。举例来说，己使用一种来自解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquifacien)的胞外核糖核酸酶barmase诱导雄性不育。Paddon等人，J.Bacteriol.171:1185-1187(1989)。欧洲专利第344,029号描述在绒毡层特异性启动子控制下通过用DNA编码的baraase转化植物产生雄性不育植物的系统。用所述启动子-基因构筑体转化烟草和油菜植物以防止所述植物产生可育花粉。Mariani等人，Nature347:737-741(1990)。表达APETALA3(AP3)启动子和白喉毒素A链(DTA)基因的融合构筑体的转基因拟南芥(Arabidopsisthaliana)植物的花缺乏花瓣和雄蕊，表明转基因表达已去除花瓣和雄蕊细胞。在LEAFY启动子控制下表达DTA基因的转基因拟南芥不开花。经驱动baraase基因的烟草柱头特异性启动子转化的烟草植物缺乏柱头分泌区且为雌性不育。尽管已有效实施基因去除，但一般用于去除的启动子并不适于组织特异性表达。因此，漏出基因的表达可显著降低并破坏植物的营养生长。视植物的种类而定，去除可使营养生长降低80%。Strauss,S.H.禾口Meilan，R.TGERCAnnualReport(1998)。就对林业经济有益的基因去除来说，破坏营养组织的量必须最小化至标称水平。尽管多项专利和专利申请公开案中公开使用多种启动子和细胞毒素基因进行基因去除，但极少有公开内容解决去除对植物营养生长和发育的影响。己将在花分生组织中强烈表达而在叶发育时微弱表达的拟南芥LFY启动子用于制造己去除花的植物。Nilsson等人，PlantJ.15:799-804(1998)。然而，经LFY转化的极少数植物己去除花而未危及营养发育。由于制造许多转基因树、使其生长并进行测试以鉴别具有不育性和正常营养生长的少数树将耗费数年时间，所以对树种使用类似繁殖去除方法将是不切实际的。基因去除繁殖器官需要启动子活性与去除基因毒性之间的微妙平衡。尽管barnase基因广泛用于植物的去除，但barnase诱导的毒性常常会对植物生长和发育造成有害影响。因此，可能需要降低barnase的毒性，从而在对植物营养生长不造成有害和不可恢复的损害的情况下发生繁殖去除。制造具有降低的毒性的突变体bamase的同时，也可能需要使植物营养组织中繁殖去除构筑体的漏出表达减至最少。通过使植物中繁殖去除构筑体的漏出或异常表达减至最少，所述植物归因于减弱的去除而可能较好地耐受营养组织中突变体barnase基因的表达，此视barnase突变体中启动子活性和RNA酶活性而定。因此，需要在植物营养组织中具有降低的barnase诱导毒性和最小漏出表达的繁殖去除系统。
发明内容本发明提供一种选自由SEQIDNO:1-8和13-17组成的群组的经分离聚核苷酸，以及包含SEQIDNO:18-27中任一者中所述的序列的质粒。本发明还提供一种质粒，其包含图1(即，SEQIDNO:18)、图2(即，SEQIDNO:19)、图3(即，SEQIDNO:20)、图4(即，SEQIDNO:21)、图5(即，SEQIDNO:22)、图6(即，SEQIDNO:23)、图7(即，SEQIDNO:24)、图8(即，SEQIDNO:25)、图9(即，SEQIDNO:26)或图19(即，SEQIDNO:27)中任一者中所述的序列。还提供一种经分离的聚核苷酸，其使得植物细胞中的繁殖优选基因能够表达，其中所述聚核苷酸包含SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者所述的序列。在一实施例中，所述聚核苷酸使植物细胞中雄性优选的基因能够表达。还提供一种启动子，其包含SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者所述的序列。在一实施例中，SEQIDNO:1-8的聚核苷酸在成熟前雄性(pre-male)繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构中表达或具活性。还提供一种经分离的聚核苷酸，其与SEQIDNO:l、2、3、4或16中任一者的序列具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%的序列同一性。在另一实施例中，提供一种聚核苷酸，其具有选自由以下序列组成的群组的序列(i)与SEQIDNO:1-8禾卩16-17中任一者的聚核苷酸互补的序列；(ii)作为SEQIDNO:1-8禾n16-17中任一者的聚核苷酸的反向序列的序列；和(iii)作为SEQIDNO:1-8禾口16-17中任一者的聚核苷酸的反向补体的序列。还提供一种经分离的聚核苷酸，其与根据权利要求1所述的聚核苷酸在严格条件下杂交，其中所述经分离的聚核苷酸在其全长序列范围内与SEQIDNO:1-26中任一者的聚核苷酸杂交。还提供一种经分离的聚核苷酸，其包含SEQIDNO:17中所述的序列。在一实施例中，提供一种具有SEQIDNO:1-4和16中任一者的序列的聚核苷酸，其能够实现(i)与核酸分子结合或(ii)调控双子叶植物中可操作地连接的基因的表达的至少一者。在另一实施例中，提供一种具有SEQIDNO:1-4和16中任一者的序列的聚核苷酸，其能够实现(i)与核酸分子结合或(ii)调控裸子植物中可操作地连接的基因的表达的至少一者。在一实施例中，提供一种具有SEQIDNO:1-4和16中任一者的序列的聚核苷酸，其能够上调或下调植物中可操作地连接的基因的表达。在本发明的一方面中，提供一种构筑体，其包含可操作地连接到所需核酸的选自SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的经分离聚核苷酸和其功能性变异体，其中所述启动子调控经所述构筑体转化的植物细胞中所述所需核酸的表达。在一实施例中，聚核苷酸上调或下调所述所需核酸的表达。在另一实施例中，所需核酸编码能够破坏植物繁殖发育的表达产物。本发明提供一种经本文所公开的任何构筑体转化的植物。在一实施例中，所述经转化植物的表型表达与未经所述构筑体转化的相同种类植物相比的繁殖发育差异。在一实施例中，繁殖发育差异出现在雄性繁殖结构中。在另一实施例中，繁殖发育差异出现在花药、花丝、绒毡层、花粉、小孢子叶或雄球花中的任一者中。在替代性实施例中，繁殖发育差异出现在雌性繁殖结构中。在这一情况下，在一实施例中，繁殖发育的差异出现在柱头、花柱、子房、大孢子、胚珠中的任一者中。在又一实施例中，繁殖发育差异出现在成熟前雄性繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构中。-方面，所需核酸可产生RNA转录本，在一实施例中，其可包含植物细胞内源基因的反义序列。在一实施例中，RNA转录本诱导在植物细胞中正常表达的基因的RNA干预。还提供一种包含构筑体的植物细胞，所述构筑体包含(i)具有SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的序列的聚核苷酸或其功能性变异体；和(ii)所需核酸；其中所述聚核苷酸可操作地连接到所述所需核酸。还提供一种包含所述植物细胞的转基因植物。一方面，本发明提供一种用于制造转基因植物的方法，其包含(a)用构筑体转化植物细胞，所述构筑体包含(i)至少一种具有SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的序列的聚核苷酸或其功能性变异体，和(ii)所需核酸，其中所述聚核苷酸调控所述所需序列的活性；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的表型的转基因植物。在一实施例中，与不含有构筑体的相同种类植物相比，经转化植物的表型的特征在于繁殖发育的差异。在另一实施例中，与不含有构筑体的相同种类植物相比，经转化植物的表型的特征在于雄性繁殖发育的差异。或者，与不含有构筑体的相同种类植物相比，经转化植物的表型的特征在于雌性繁殖发育的差异。在另一实施例中，与不含有构筑体的相同种类植物相比，经转化植物的表型的特征在于成熟前雄性繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构的差异。另一方面，提供一种赋予植物繁殖不育性的方法，其包含(a)将构筑体引入植物细胞，所述构筑体包含(i)具有SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性变异体的启动子，和(ii)编码能够去除繁殖发育的基因的核酸，其中所述核酸相对于所述启动子有义，且其中所述启动子调控所述基因的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的表型的转基因植物；和(c)选择繁殖不育的植物。另一方面为一种去除植物中的繁殖结构的方法，其包含(a)将构筑体引入植物细胞，所述构筑体包含(i)具有SEQIDNO:l、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性变异体的启动子，和(ii)编码能够去除繁殖发育的基因的核酸，其中所述启动子调控所述基因的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的表型的转基因植物；和(c)选择具有已去除的繁殖结构的植物。在一实施例中，所述植物是选自被子植物或裸子植物种类。还提供一种变化花粉育性的方法，其包含(a)将构筑体引入木本植物的植物细胞，所述构筑体包含(i)具有SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性变异体的启动子，和(ii)和所需核酸，其中所述启动子调控所述所需核酸的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞；和(c)获得具有变化的花粉育性的植物。在一实施例中，木本植物是选自桉树属或松属。本文还提供一种选自SEQIDNO:5-8中任一者的经分离聚核苷酸和其变异体。在一实施例中，这些聚核苷酸中的任一者编码突变体barnase酶。在一实施例中，所述聚核苷酸编码相比野生型barnase酶具有减弱的活性的突变体barnase酶。在一实施例中，变异体与SEQIDNO:5-8中任一者的序列具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%的序列同一性。还提供一种经分离的聚核苷酸，其具有选自以下序列的序列(i)与SEQIDNO:5-8中任一者的聚核苷酸互补的序列；(ii)作为SEQIDNO:5-8中任一者的聚核苷酸的反向序列的序列；和(iii)作为SEQIDNO:5-8中任一者的聚核苷酸的反向补体的序列。在另一实施例中，经分离的聚核苷酸与SEQIDNO:5-8中任一者的聚核苷酸在严格条件下杂交，其中所述经分离的聚核苷酸在其全长序列范围内与SEQIDNO:5-8中任一者的聚核苷酸杂交。另一方面，提供一种赋予植物繁殖不育性而不干扰营养生长的方法，其包含(a)将构筑体引入植物细胞中，所述构筑体包含(i)具有繁殖优选活性的启动子，(ii)编码能够去除繁殖发育的基因的核酸，其中所述启动子调控所述基因的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的表型的转基因植物；和(c)选择具有繁殖不育性和未受干扰的营养生长的植物。还提供一种去除植物的繁殖发育而不干扰营养生长的方法，其包含(a)将构筑体引入植物细胞中，所述构筑体包含(i)具有SEQIDN0:1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性变异体的启动子，(ii)编码能够去除繁殖发育的基因的核酸，其中所述启动子调控所述基因的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的表型的转基因植物；和(c)选择具有己去除的繁殖发育和未受干扰的营养生长的植物。还提供一种赋予植物雄性不育性而不干扰营养生长的方法，其包含(a)将构筑体引入植物细胞中，所述构筑体包含(i)具有繁殖优选表达的启动子，(ii)编码突变体barnase的核酸，其中所述突变体barnase与野生型barnase相比具有减弱的活性；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的繁殖表型的转基因植物；和(c)选择具有雄性不育性和未受干扰的营养生长的植物。在一实施例中，启动子具有选自由SEQIDNO:1、2、3、4和16组成的群组的序列。在另一实施例中，启动子为选自由SEQIDNO:1、2、3、4和16组成的群组的序列中任一者的功能性变异体。在一实施例中，上述(ii)中的核酸具有SEQIDNO:5-8中任一者的序列。在一实施例中，本发明还提供一种具有已去除的繁殖发育和未受影响的营养生长的植物。在另一实施例中，本发明还提供一种具有己去除的繁殖发育和正常营养生长的木本植物。另一方面，提供一种获得木材的方法，其包含(a)将构筑体引入木本植物的植物细胞中，所述构筑体包含(i)具有SEQIDNO:l、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性变异体的启动子，和(ii)和所需核酸，其中所述启动子调控所述所需核酸的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞；和(c)从所述植物获得木材。另一方面为一种获得木浆的方法，其包含(a)将构筑体引入木本植物的植物细胞中，所述构筑体包含(i)具有SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性变异体的启动子，和(ii)和所需核酸，其中所述启动子调控所述所需核酸的表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞；和(c)从所述植物获得木浆。还提供一种去除植物中的繁殖结构的方法，其包含(a)将选自由SEQIDNO:13-15组成的群组的质粒引入植物细胞中；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述质粒的相同种类植物不同的表型的转基因植物；和(c)选择具有已去除的繁殖结构的植物。在另一实施例中，可将选自由SEQIDNO:18-26组成的群组的质粒引入上述步骤(a)中的植物细胞中。还提供一种赋予植物繁殖不育性的方法，其包含(a)将选自由SEQIDNO:13-15组成的群组的质粒引入植物细胞中；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述质粒的相同种类植物不同的表型的转基因植物；禾Q(c)选择具有已去除的繁殖结构的植物。在另一实施例中，可将选自由SEQIDNO:18-26组成的群组的质粒引入上述步骤(a)中的植物细胞中。在另一实施例中，提供一种经本文所公开的任何质粒稳定转化的植物。在一实施例中，己稳定引入植物中的质粒具有SEQIDNO:13-15或18-26中任一者的序列。本发明还提供一种赋予转基因植物繁殖不育性的方法，其包含(a)用构筑体转化植物细胞，所述构筑体具有繁殖优选的启动子和非繁殖优选的启动子，所述繁殖优选的启动子可操作地连接到细胞毒素基因，所述非繁殖优选的启动子可操作地连接到编码抑制所述细胞毒素基因的蛋白质的基因；其中所述繁殖优选启动子在被子植物或裸子植物繁殖结构中具活性，且所述非繁殖优选启动子在被子植物或裸子植物繁殖结构中不具活性；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化的植物细胞；和(c)选择具有已去除的繁殖结构的转基因植物。在一实施例中，繁殖优选启动子是选自由SEQIDNO:1、2、3、4或16组成的群组。在另一实施例中，非繁殖优选的启动子是选自由SEQIDNO:3和SEQIDNO:17组成的群组。还提供一种多肽，其包含SEQIDNO:9-12中任一者所述的氨基酸序列或其变异体。在一实施例中，所述多肽变异体与SEQIDNO:9-12中任一者的序列具有大于或等于99%、98%、97%、％%、95%、94%、93%、92%、91%、卯％、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%的序列同一性。本发明还涵盖一种包含启动子的构筑体，所述启动子包含可操作地连接到包含SEQIDNO:5-8中任一者的序列的聚核苷酸的SEQIDNO:1或2中任一者的序列。在一实施例中，聚核苷酸包含SEQIDNO:5中所述的序列。在一实施例中，聚核苷酸包含SEQIDNO:6中所述的序列。在另一实施例中，聚核苷酸包含SEQIDNO:7中所述的序列。在另一实施例中，聚核苷酸包含SEQIDNO:8中所述的序列。还提供一种经这一构筑体转化的植物。还提供一种包含启动子的构筑体，所述启动子包含可操作地连接到编码多肽的聚核苷酸的SEQIDNO:1或2中任一者的序列，所述多肽包含SEQIDNO:9-12中任一者中所述的氨基酸序列。还提供一种经这一构筑体转化的植物。在一实施例中，这些构筑体中的一者也可包含可操作地连接到barstar基因的非繁殖优选启动子。本文所公开的非繁殖优选启动子可包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:17中所述的序列。还提供一种诱导松属中球花形成的方法，其包含(a)从刚松松属(Rrigida)北美油松(pitchpine)与火炬松松属(P.taeda)火炬松(loblollypine)杂交获得杂交后代植物；(b)用所需可操作地连接到繁殖组织优选的启动子的聚核苷酸转化杂交植物；(c)由经转化的杂交植物再生转基因杂交植物；和(d)回收球花。在一实施例中，繁殖组织优选的启动子包含SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者所述的序列。在另一实施例中，杂交植物是通过农杆菌(Agrobacterium)或基因枪(biolistics)介导的转化进行转化。在一实施例中，球花为雄性或雌性。在另一实施例中，球花是由转基因杂交植物在1至3年的转化期内产生。另一方面，提供一种测试裸子植物繁殖组织中候选启动子的活性的方法，其包含(a)获得候选启动子序列；(b)使所述候选启动子可操作地连接到报告基因；(c)将所述可操作地连接到报告基因的候选启动子引入植物材料中；和(d)鉴别植物材料中报告基因的表达。在本方法中，报告基因为GUS。在一实施例中，植物材料为植物外植体或植物细胞。在另一实施例中，报告基因的表达己经鉴别的植物材料是选自由花瓣、雄蕊、心皮、茎尖、花药、绒毡层、胼胝体和胚组成的群组。本发明还提供一种杂交后代植物，其包含可操作地连接到所需聚核苷酸的繁殖组织优选启动子，其中所述杂交后代植物是由刚松松属北美油松与火炬松松属火炬松杂交获得。在一实施例中，繁殖组织优选的启动子包含SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者所述的序列。在一实施例中，所需聚核苷酸包含SEQIDNO:5-8中任一者所述的序列。在另一实施例中，所需聚核苷酸编码包含SEQIDNO:9-12中任一者所述的氨基酸序列的多肽。还提供一种经包含SEQIDNO:13-15中任一者的序列的构筑体转化的杂交后代植物，其中所述杂交后代植物是由刚松松属北美油松与火炬松松属火炬松杂交获得。本发明还提供一种测试假定的开花控制构筑体延迟裸子植物繁殖的活性的方法，其包含(i)用可操作地连接到所需聚核苷酸的启动子转化刚松松属与火炬松松属杂交体的体细胞胚培养物(somaticembryogenicculture);(ii)从经转化的培养物中选择转基因细胞；(iii)培养转基因细胞以获得至少一种体细胞胚；(iv)使所述胚发芽以获得转基因植物；(v)使植物生长；和(vi)检查植物球花的形成。在一实施例中，启动子为选择用于测试植物繁殖组织中启动子活性的聚核苷酸。在另一实施例中，所述培养是通过农杆菌介导的转化或基因枪转化进行转化。在另一实施例中，所需聚核苷酸为报告基因或去除构筑体。就这一点来说，在一实施例中，去除构筑体具有SEQIDNO:13-15中任一者所述的核酸序列。在另一实施例中，构筑体可包含SEQIDNO:18-26中任一者所述的序列。在一实施例中，上述步骤(v)的植物生长1至3年。一般说来，可操作地连接到启动子或并入本文所公开的质粒或构筑体中的本发明的所需核酸或所需聚核苷酸可包含SEQIDNO:5-8中任一者的序列。在一实施例中，所需核酸或所需聚核苷酸为己突变的barnase基因序列。在优选实施例中，繁殖优选的启动子可操作地连接到促进被子植物和裸子植物中繁殖组织基因去除的聚核苷酸。在优选实施例中，聚核苷酸为突变体barnase基因。在一实施例中，启动子包含SEQIDNO:1-4或16中任一者所述的序列。在另一实施例中，barnase基因具有SEQIDNO:5-8中任一者所述的序列，或编码包含SEQIDNO:9-12中任一者所述的序列的多肽。任何构筑体都可包含所述启动子-所需聚核苷酸表达盒。图1-pWVR220[PrMC2.400::barnaseH102E](SEQIDNO.18)。图2-pWVCZ20[(AtAGenh)PrAG::GUS(内含子)](SEQIDNO.19)。图3-pWVCZ23[PrAG::barnaseE73G](SEQIDNO.20)。图4—pWVCZ24[(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G](SEQIDNO.21)。图5-pARB599B[PrMC2::bamaseH102E](SEQIDNO.22)。已公开的短核苷酸序列按出现的次序分别为SEQIDNO:22的残基10431-10442、10261-10271、9885-9896和9569-9581。图6-pARB639B[(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G](SEQIDNO.23)。图7-pAGF243[PrMC2.400-3::barnaseH102E](SEQIDNO.24)。图8-pABDPO10[CZ28-bstar+UBQ10::NPTII::E9/LPAGld4::bstar::NOST的互补拷贝](SEQIDNO.25)。图9-pABDP04[CZ28-bstar+UBQ10::NPTII::E9/LPAGld4::bstar::NOST的互补拷贝](SEQIDNO.26)。图10-pWVR220的质粒图谱。图11-pWVCZ20的质粒图谱。图12-pWVCZ23的质粒图谱。图13-pWVCZ24的质粒图谱。图14-pARB599B的质粒图谱。图15-pARB639B的质粒图谱。图16-pAGF243的质粒图谱。图17-pABDPO10的质粒图谱。图18-pABDP04的质粒图谱。图19-pARB1005L[(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G]。具体实施例方式本发明涉及一种经分离的核酸分子，其包含与选自由下文所述的聚核苷酸序列(即，SEQIDNO:1-26以及图1至9中所述的那些序列和其部分)中的任一者组成的群组的序列具有至少95%序列同一性的聚核苷酸。本发明还提供本文所公开的聚核苷酸序列的功能性片段。本发明另外提供与本文所揭示的任何聚核苷酸序列互补的核酸或其片段；以及包含至少15个相邻碱基的核酸，其与本文所公开的任何聚核苷酸序列杂交。本发明还涉及一种经分离的聚核苷酸序列，其包含具有选自本文所述序列(诸如SEQIDN09至12中所述的那些序列)的序列的多肽。本发明使用所属领域技术人员众所周知的术语和短语。除非另作定义，否则本文所使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常了解的含义相同的含义。一般说来，本文所使用的命名法和本文所述的细胞培养、分子遗传学和核酸化学反应与杂交反应的实验室程序为众所周知和此项技术中常用者。重组核酸方法、聚核苷酸合成、微生物培养、细胞培养、组织培养、转化、转染、转导、分析化学、有机合成化学、化学合成、化学分析和医药调配和传递中都使用标准技术。一般说来，酶反应和纯化和/或分离步骤是根据制造商的说明书进行。技术和程序一般是根据常规方法进行。例如参看Sambrook&Russel,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001。农杆菌如所属领域众所周知，用于转化植物细胞的农杆菌为通常含有载体的根癌农丰干菌(Agrobacteriumtumefacien)或发木艮农杆菌(Agrobacteriumrhizogene)的隹卩甲(disarmed)和剧毒衍生物。载体通常含有位于T-DNA边界之间的所需聚核苷酸。被子植物子房中封闭有种子的维管植物。被子植物是能够开花结果的种子植物。被子植物可细分成双子叶植物和单子叶植物。被子植物繁殖结构包括包含花的雄性和雌性组织。通常，被子植物的花具有四种不同的花器官萼片(花萼)、花瓣(花冠)、雄蕊(雄蕊群(androcecium))和雌蕴(雌蕊群)。被子植物繁殖结构也包含成熟前雄性繁殖结构和成熟前雌性繁殖结构。成熟前雄性繁殖结构和成熟前雌性繁殖结构包含在雄性组织和雌性组织发育和分化前形成的细胞和组织。所需聚核苷酸本发明的所需聚核苷酸为基因元件，诸如启动子、增强子或终止子；或基因组中包含所需聚核苷酸的经转化细胞中待转录和/或待翻译的基因或聚核苷酸。如果所需聚核苷酸包含编码蛋白质产物的序列，那么可使编码区可操作地连接到引起相关信使RNA转录本和/或由所需聚核苷酸编码的蛋白质产物表达的调控元件，诸如启动子和终止子。因此，"所需聚核苷酸"可包含以5'-至3'-方向可操作地连接的基因、启动子、编码蛋白质的基因和终止子。另外，所需聚核苷酸可包含"反义(antisense)"方向的基因或其片段，所述基因或其片段的转录产生可形成影响植物细胞中内源基因表达的二级结构的核酸。转录后所需聚核苷酸还可得到起始与所需聚核苷酸有关的基因的RNA干预的双链RNA产物。本发明的所需聚核苷酸可定位于T-DNA内，从而使左侧与右侧的T-DNA边界序列侧面相接，或位于所需聚核苷酸的任一侧上。本发明预期将一种或一种以上所需聚核苷酸稳定整合到至少一种植物细胞的基因组中。所需聚核苷酸可经突变或可为其野生型序列的变异体。应了解，可将所有或部分所需聚核苷酸整合到植物基因组中。还应了解，术语"所需聚核苷酸"涵盖一种或一种以上所述聚核苷酸。因此，本发明的T-DNA可包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或十种以上所需聚核苷酸。双子叶植物(dicot):胚中具有两半种子或子叶、分枝叶脉和四朵或五朵的花部分的有花植物。双子叶植物的实例包括(但不限于)桉树、杨树、枫香属、金合欢、柚木、桃花心木、棉、烟草、拟南芥、番茄、马铃薯、甜菜、椰菜、木薯、甘薯、胡椒、猩猩木、菜豆、紫花苜蓿、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、栎树、槭树、胡桃、蔷薇、薄荷、南瓜、雏菊、老獾草、鳄梨、仙人掌和马蹄金属。内源是指植物基因组的天然基因。雌性繁殖组织包括(例如)柱头、花柱、子房、大孢子、雌球花(胚珠)、雌配子、雌合子、大孢子母细胞和成熟前雌性繁殖结构。雌性不育性基因是指编码破坏雌配子体、雌配子、雌合子、种子、胚珠或成熟前雌性繁殖结构的生长和发育的RNA、蛋白质或多肽的核酸分子。表达雌性不育性基因的植物产生不具生育力的种子。存在许多可导致雌性不育性的不同突变，涉及雌性繁殖器官或成熟前雌性繁殖结构的特定组织发育的所有阶段。雌性不育性基因的实例包括(但不以任何方式限制)编码催化植物激素合成的酶，诸如异戊烯基转化酶，其为一种催化细胞分裂素生物合成的第一步骤且由农杆菌T-DNA的基因4编码的酶；或一种或两种涉及生长素合成且由农杆菌T-DNA的基因1和基因2编码的酶。雌性不育性基因的其他实例编码葡聚糖酶；脂酶，诸如磷脂酶A2(Verheij等人，Rev.Blochem.Pharmacol.91:92-203(1981));脂质过氧化物酶；或植物细胞壁抑制剂。雌性不育性基因的其它实例编码对植物细胞有毒的蛋白质，诸如细菌毒素(例如，白喉毒素或肉毒杆菌毒素的A片段)。雌性不育性基因的另一实例为反义核酸，或RNA干预(RNAi)中涉及的RNA(诸如小干预RNA(siRNA))，其可用于抑制或完全阻断目标基因的表达。举例来说，本发明的反义或RNAi分子编码与植物繁殖细胞中在内源启动子控制下天然转录的链互补的核酸链，举例来说，所述内源启动子如欧洲专利公开案0,223,399中所述。所述反义核酸或RNAi分子能够与繁殖细胞中天然产生的RNA的编码和/或非编码部分结合，从而抑制天然产生的RNA的翻译。在一实施例中，可在植物的花、胚珠、种子、胚、雌配子、雌配子体、大孢子母细胞和成熟前雌性繁殖结构中于植物的互补内源DNA链(或基因)的内源启动子控制下表达本发明的反义核酸和RNAi分子。所述反义核酸的实例为以下基因的反义DNA序列STMG型基因，诸如STMG07、STMG08、STMG4B12和STMG3C9基因。Jofuku和Goldberg.ThePlantCell1:1079-1093(1989)。使用RNAi抑制基因表达一般描述于Paddison等人，Genes&Dev.16:948-958(2002)中，且使用RNAi抑制植物基因的表达特别描述于WO99/61631中，两篇专利文献都以引用的方式并入本文。雌性不育性基因的另一实例编码特定RNA酶(即，"核糖酶")，其能够高度特异性裂解给定目标序列，如Haseloff和Gerlach等人.Nature334,585-591(1998)所述。纤维组成如本文所使用，纤维组成是指可经修饰以改变纤维的结构、外观或用途的特质。确定纤维组成的特质包括(但不限于)纤维长度、粗糙度、强度、颜色、横截面、宽度和纤维密度。举例来说，已知纤维长度给予强度，而纤维粗糙度确定结构和弹性。在被子植物中，花分生组织起始具有四种不同类型花器官的花结构萼片(花萼)、花瓣(花冠)、雄蕊(雄蕊群)和雌蕊(雌蕊群)。每一花器官都是以轮生体起始，包含围绕花分生组织侧翼的同心环。花结构是由花柄或花梗支撑。有花植物产生为小孢子(雄性)或大孢子(雌性)的减数孢子。外来就核酸来说，"外来"的意思是所述核酸是得自非植物有机体，或得自与待转化的植物种类不同的植物，或得自与待转化的植物混种繁殖的植物，或不属于目标植物种类。根据本发明，外来DNA或RNA可包括天然存在于真菌、细菌、病毒、哺乳动物、鱼或鸟类的基因组成中但并非天然存在于待转化的植物中的核酸。因此，外来核酸为编码(例如)不是由经转化植物天然产生的多肽的核酸。外来核酸无需编码蛋白质产物。基因基因为含有合成产物、多肽链或RNA分子所需的所有信息且包括编码与非编码序列的DNA分子的区段。基因元件"基因元件"为任何不连续的核苷酸序列，包括(但不限于)启动子、基因、终止子、内含子、增强子、间隔子、5'-未翻译区、3'-未翻译区或重组酶识别位点。基因修饰通过应用分子生物学和细胞生物学方法将DNA稳定引入某些有机体的基因组中。裸子植物如本文所使用，其是指具有种子而无子房的种子植物。裸子植物的实例包括松类、苏铁类、银杏属和麻黄属。在裸子植物中，繁殖芽原体(reproductiveshootprimordia)发育成雄球花(malecone/staminatecone)或雌球花(femalecone/ovulatecone)。裸子植物繁殖结构包括包含雄性花粉球(雄球花)的雄性组织和包含雌球花(femalecone/ovulatecone)的雌性组织。裸子植物繁殖结构还包含成熟前雄性繁殖结构和成熟前雌性繁殖结构。成熟前雄性繁殖结构和成熟前雌性繁殖结构包含在雄性组织和雌性组织发育和分化前形成的细胞和组织。引入如本文所使用，其是指通过包括感染、转染、转化或转导的方法将核酸序列插入细胞中。木质素如本文所使用，其是指由类苯丙醇(phenylpr叩anoid)单元构成的聚合组合物，包括单木质醇松柏醇、香豆醇和芥子醇的聚合衍生物。木质素的品质是指木质素组合物给予细胞壁基质强度、辅助水运输和/或阻止细胞壁多醣降解的能力。可通过变化每一单木质醇(monolignol)的相对量或变化木质素类型来改变木质素组成或木质素结构。举例来说，愈创木基木质素(衍生自阿魏酸)在软木种类中占优势，而愈创木基-紫丁香基木质素(衍生自阿魏酸和芥子酸)为硬木种类的特性。与移除硬木中的木质素相比，降解软木(诸如松树)中的木质素实质上需要较多的碱和较长的培育时间。可通过上调或下调木质素生物合成中所涉及的酶来调控木质素组成。举例来说，木质素生物合成的关键酶包括(但不限于)4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)、苯丙烯醇脱氢酶(CinnamylAlcoholdehydrogenase,CAD)禾口芥子醇脱氢酶(SinapylAlcoholDehydrogenase,SAD)。在被子植物中，雄性配子体或花粉粒在花药中发育，且由雄蕊产生花药。花药的发育出现于两个与花粉发育相关的阶段。第I阶段，花药中的造孢细胞经历小孢子发生；非造孢细胞形成表皮和绒毡层。绒毡层为包围造孢细胞并向花粉发育提供营养物质的组织。此外，绒毡层分泌酶过氧化氢酶。第II阶段，花药扩大且花丝伸长。此时，花粉粒形成，出现开裂，并释放出花粉粒。在裸子植物(诸如松类)中，雄性花粉球是由具有一连串鳞苞的茎轴和每一鳞苞下表面上的两个花粉囊组成。雄球花是由在能育枝茎轴(fertileshootaxis)上以螺旋排列紧密丛集的大量小孢子叶组成。每一小孢子叶在其底部、离茎侧都具有两个小孢子囊，也称为花粉囊。每一小孢子囊内都存在造孢组织。造孢组织是由大量经历减数分裂的二倍体细胞(称为小孢子母细胞)组成。每一小孢子囊的周围都存在绒毡层。在小孢子囊内，小孢子都经历有丝分裂，且在两次有丝分裂后，产生四室雄性配子体。花粉粒包含小孢子壁和所含的雄性配子体。在裸子植物中，雌球花是由大量经高度修饰的能育枝融合形成。举例来说，在松树中，雌球花包含连接到单一、中央茎轴的个体单元。个体单元是由珠鳞(ovuliferousscale)(具有胚珠)和几乎完全融合至珠鳞的苞片(subtendingbract)组成。每一珠鳞都是由大孢子叶与其它能育枝组件融合形成。在顶部，每一珠鳞的离茎表面都具有两个胚珠。胚珠以其珠孔朝向中央锥形茎轴(coneaxis)定向且部分埋入珠鳞组织中。每一胚珠都具有完全包围除珠孔外的大孢子囊的珠被(一种多细胞层)。珠被或珠心起到营养组织的作用，且每一珠心都具有单一大孢子母细胞。大孢子母细胞为经历减数分裂的二倍体细胞。珠孔室是位于每一胚珠内珠心与珠孔之间。雄性繁殖组织包括(例如)花粉粒、绒毡层、花药、花丝、花粉母细胞、小孢子、小孢子母细胞、雄性花粉球(雄球花)、花粉囊和成熟前繁殖结构。雄性不育性基因是指编码干扰表达雄性不育性基因的任何繁殖细胞中适当代谢、功能和/或发育且由此导致任何所述繁殖细胞死亡和/或破坏的RNA、蛋白质或多肽的核酸分子。存在许多可导致雄性不育性的不同突变，涉及雄性繁殖器官或成熟前雄性繁殖结构特定组织发育的所有阶段。举例来说，雄性不育性基因的表达使植物无法产生可育花粉。经转化植物中雄性不育性基因的表达可导致植物产生花粉，但花粉可能对于传粉来说为异常且无功能的。举例来说，非功能性花粉可能无法使花粉管发芽。并非出于限制，雄性不育性基因的实例编码RNA酶，诸如RNA酶T1(其通过水解任何鸟嘌呤残基后的键降解RNA分子)和Barnase;DNA酶，诸如核酸内切酶(例如，EcoRI);或蛋白酶，诸如木瓜蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶酶原和木瓜蛋白酶活性蛋白)。其它雄性不育性基因编码催化植物激素合成的酶。举例来说，可使用异戊烯基转移酶(一种催化细胞分裂素生物合成的第一步骤的酶)，且生长素合成所涉及的酶可用于诱导雄性不育性。其它雄性不育性基因编码葡聚糖酶；脂酶，诸如磷脂酶A2(Verheij等人.Rev.Biochem.Pharmacol.91:92-203(1981));脂质过氧化物酶；或植物细胞壁抑制剂。雄性不育性基因的其它实例编码对植物细胞有毒的蛋白质，诸如细菌毒素(例如，白喉毒素或肉毒杆菌毒素的B片段)。雄性不育性基因的另一实例为反义核酸，或RNA干预(RNAi)中涉及的RNA(诸如小干预RNA(siRNA))，其可用于抑制或完全阻断目标基因的表达。举例来说，本发明的反义或RNAi分子编码与植物繁殖细胞中在内源启动子控制下天然转录的链互补的核酸链，举例来说，所述内源启动子如欧洲专利公开案0，223，399中所述。所述反义核酸或RNAi分子能够与繁殖细胞中天然产生的RNA的编码和/或非编码部分结合，从而抑制天然产生的RNA的翻译。在一实施例中，可在花粉粒、绒毡层、花粉囊、花丝、花粉母细胞、小孢子、小孢子母细胞、雄性花粉球(雄球花)、花粉囊和成熟前雄性繁殖结构中表达本发明的反义核酸和RNAi分子。小孢子发生是二倍体细胞、即小孢子母细胞经历减数分裂分离而产生四个单倍体小孢子(小孢子四分体)的过程。小孢子四分体是封闭于胼胝质细胞壁中。在被子植物中，小孢子发生出现于雄蕊(即花的雄性繁殖组织)中。每一雄蕊都具有花丝和花药。每一花药都具有一到四个室，称为花粉囊或花药囊。每一花药囊产生多个小孢子母细胞，也称为花粉母细胞。在裸子植物中，小孢子发生出现于小孢子叶的小孢子囊或花粉囊中。在小孢子囊内，小孢子经历有丝分裂并产生四室雄性配子体。裸子植物的花粉粒包含小孢子壁和所含的雄性配子体。单子叶植物(monocot):具有含一个子叶(cotyledon或seedleaf)的胚、平行叶脉和三朵花部分的有花植物。单子叶植物的实例包括(但不限于)草坪草、玉米、稻子、燕麦、小麦、大麦、高粱、兰花、鸢尾属植物、百合花、洋葱和棕榈。草坪草的实例包括(但不限于)翦股颖属(Agrostisspp.)(包括细弱翦股颖(colonialbentgrass)和匍蔔翦股颖(creepingbentgrasses)的剪股颖属)、草地早熟禾(Poapratensis/kentuckybluegrass)、黑麦草属(Loliumspp.)(包括一年生黑麦草(annualryegrass)和多年生黑麦草(perennialryegrass)白勺黑麦草属)、高羊茅(Festucaarundinacea/tallfescue)、丛生型紫羊茅(Festucarubracommutata)(细羊茅(finefescue))、狗牙根(Cynodondactylon)(包括Tifgreen、TifwayII禾卩SantaAna的常见狗牙根品种和其杂交体)、东非狼尾草(Pennisetumclandestinum)(克育草(kikuyugrass))、钝口十草(Stenotaphrumsecundatum)(圣奥古斯丁草(St.augustinegrass))、纟吉缕草(Zoysiajaponica/zoysiagrass)禾口马蹄金(Dichondramicrantha)。可操作地连接以使两个或两个以上分子的组合在植物细胞中适当起作用的方式组合所述两种或两种以上分子。举例来说，当启动子控制结构基因的转录时，启动子可操作地连接到结构基因。表型表型为植物可辨识的特征或特性，可根据本发明通过将一种或一种以上"所需聚核苷酸"和/或可筛选/可选择的标记整合到经转化植物的至少一个植物细胞的基因组中来变化所述特征或特性。"所需聚核苷酸"和/或标记可通过改变经转化植物细胞或植物整体的多个遗传、分子、生物化学、生理学、形态学或农艺学特性或性质中的任一个来使经转化植物的表型改变。因此，植物基因组中一个或一个以上稳定整合的所需聚核苷酸的表达可得到选自由(例如)以下表型组成的群组的表型增加的耐旱性、增强的耐寒和耐冻性、改良的活力、增强的颜色、增强的健康和营养特性、改良的储存、增强的产量、增强的耐盐性、增强的对重金属的耐受性、增加的对疾病的耐受性、增加的对昆虫的耐受性、增加的对水压的耐受性、增强的甜味、改良的活力、改良的味道、改良的结构、降低的磷酸盐含量、增加的发芽率、增加的微量营养素摄取、改良的淀粉组成和改良的花期。植物组织"植物"是特性上产生胚、含有叶绿体且具有纤维素细胞壁的植物界王国中多种光合成、真核、多细胞有机体中的任一种。可根据本发明的方法转化植物的一部分(即"植物组织")以制造转基因植物。许多适当的植物组织可根据本发明加以转化，且包括(但不限于)体细胞胚、花粉、叶、杆、胼胝体、匍匐茎、微管和枝条。因此，本发明预期被子植物和裸子植物的转化，所述植物诸如草坪草、小麦、玉米、稻子、大麦、燕麦、甜菜、马铃薯、番茄、烟草、紫花苜蓿、莴苣、胡萝卜、草莓、木薯、甘薯、老獾草、大豆、栎树、苹果、葡萄树、松树、冷杉、金合欢、桉树、胡桃和棕榈。根据本发明，"植物组织"也涵盖植物细胞。植物细胞包括悬浮培养物、胼胝体、胚、分生组织区、胼胝体、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉、种子和小孢子。植物组织可处于成熟期的各个阶段，且可生长于罐、温室或田间的液体或固体培养物中或土壤中或适当培养基中。植物组织也是指无性繁殖或有性繁殖产生的所述植物、种子、后代、繁殖体的任何克隆，和任何所述植物组织的子孙后代，诸如插枝或种子。特别引人关注的为松类，诸如松树、冷杉和云杉；单子叶植物，诸如草地早熟禾、匍匐翦股颖、玉米和小麦和双子叶植物，诸如棉、番茄、莴苣、拟南芥、烟草、苹果和老獾草。植物转化和细胞培养广义上是指基因修饰植物细胞并将其转移至适当的植物培养基中以供维持、进一步生长和/或进一步发育的方法。所属领域技术人员众所周知所述方法。花粉是指种子植物的小孢子且小孢子的粉末状块是从花药和雄球花中流出的。成熟前雌性繁殖结构是指在被子植物和裸子植物种类中的雌性组织发育和分化前形成的细胞和组织。成熟前雄性繁殖结构是指在被子植物和裸子植物种类中的雄性组织发育和分化前形成的细胞和组织。后代本发明的"后代"(诸如转基因植物的后代)为出自植物或转基因植物、由植物或转基因植物产生或源自植物或转基因植物的物质。因此，"后代"植物，即"F1"代植物是由本发明的方法制造的转基因植物的苗种或子孙后代。转基因植物的后代可含有至少一种、部分或全部的其细胞基因组，即已通过本文所述的方法整合到亲代转基因植物细胞中的所需聚核苷酸。因此，后代植物得以"传递"或"继承"所需聚核苷酸。后代植物由此继承的所需聚核苷酸可存在于T-DNA构筑体内，所述T-DNA构筑体也是由后代植物从其亲代继承得到。也可认为如本文所使用的术语"后代"为一组植物的苗种或子孙后代。启动子旨在意谓结合RNA聚合酶和/或其它转录调控元件的核酸、优选DNA。与任何启动子一样，本发明的启动子序列将促进或控制DNA或RNA转录而由可操作地连接到所述启动子的核酸分子产生mRNA分子。如上文所述，所产生的RNA可编码蛋白质或多肽，或可编码RNA干预或反义分子。如本文所使用的启动子也可包括调控元件。相反，调控元件也可与启动子分离。调控元件赋予启动子区多种重要特性。一些元件与增强可操作地连接的核酸的转录速率的转录因子结合。其它元件与抑制转录活性的阻遏物结合。转录因子对启动子活性的作用可确定启动子活性为高或低的，即启动子为"强"或"弱"。植物启动子是能够起始植物细胞转录的启动子，无论其起点是否在植物细胞内。示范性植物启动子包括(但不限于)从植物、植物病毒和细菌(诸如农杆菌或根瘤菌)获得的启动子，其包含植物细胞中所表达的基因。发育控制下的启动子的实例包括优先起始某些组织的转录的启动子，所述组织诸如绒毡层、木质部、叶、根或种子。所述启动子称为组织优选的启动子。仅起始某些组织的转录的启动子称为组织特异性启动子。细胞类型特异性启动子主要驱动一种或一种以上器官(例如根或叶中的脉管细胞)中某些细胞类型的表达。可诱导或可阻遏的启动子为环境控制下的启动子。可通过可诱导启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件、热或存在光。组织特异性、组织优选、细胞类型特异性和可诱导启动子将组成非组成性启动子类。组成性启动子为在大部分环境条件下且在大部分植物部分中具活性的启动子。聚核苷酸是包含基因编码序列或其片段(包含至少15个连续核苷酸、至少30个连续核苷酸或至少50个连续核苷酸)、启动子、内含子、增强子区、多聚腺苷酸化位点、翻译起始位点、5'或3'未翻译区、报告基因、可选择标记等的核苷酸序列。聚核苷酸可包含单链或双链DNA或RNA。聚核苷酸可包含经修饰碱基或经修饰骨架。聚核苷酸可为基因组、RNA转录本(诸如mRNA)或经加工核苷酸序列(诸如cDNA)。聚核苷酸可包含有义或反义方向的序列。经分离聚核苷酸为非天然状态的聚核苷酸序列，例如，聚核苷酸包含未见于自然界中的核苷酸序列，或聚核苷酸与其通常接近的核苷酸序列分离，或聚核苷酸与其通常不接近的核苷酸序列接近。可再生性如本文所使用，其是指植物由脱分化组织再分化的能力。繁殖优选的启动子是指优先在植物繁殖组织中表达的启动子。繁殖植物组织包括繁殖结构的雄性与雌性部分，以及成熟前雄性繁殖结构与成熟前雌性繁殖结构。雄性繁殖组织包括(例如)花粉粒、绒毡层、花药、花丝、花粉母细胞、小孢子、雄性花粉球(雄球花)和成熟前雄性繁殖结构。雌性繁殖组织包括(例如)柱头、花柱、子房、大孢子、珠鳞、苞叶、雌球花(胚珠)和成熟前雌性繁殖结构。因此，繁殖优选的启动子可优先在任何被子植物繁殖结构或裸子植物繁殖结构中表达。种子可认为"种子"是含有胚的成熟植物胚珠和植物的繁殖部分(如块茎或孢子)。可在进行农杆菌介导的转化之前，例如于暗室中培育种子以促进发芽。也可在培育之前诸如通过用漂白法进行简单处理使种子灭菌。随后，可将所得籽苗暴露至所需的农杆菌菌株。可选择/可筛选标记如果在植物或植物组织中表达时可能使该等组织与其他植物或植物组织相区别的基因，其中所述其他植物或植物组织并不表达所述基因。筛选程序可能需要对可筛选标记基因编码的蛋白质表达进行分析。所述标记的实例包括卩葡糖苷酸酶(GUS)基因和荧光素酶(LUX)基因。可选择的标记的实例包括编码卡那霉素(kanamycin)和遗传霉素(geneticin)抗性的新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase,NPTII)基因；编码对潮霉素(hygromycin)的抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT或APHIV)基因；编码对磺酰脲型除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶(als)基因；编码对除草剂的抗性的基因(BAR和/或PAT)，所述除草剂起到抑制谷氨酰胺合成酶作用的作用，诸如草铵膦(phosphinothricin)(Liberty或Basta);或其它此项技术中已知的类似基因。序列同一性如本文关于两种核酸或多肽序列的内容中所使用，"序列同一性"或"同一性"包括当在特定区域内对准以达成最大对应时两个序列中相同的残基的相关物。如本文所使用，序列同一性百分数意指通过比较比较窗(comparisonwindow)内两个最佳对准的序列所测定的值，其中当与两个序列的最佳对准的参考序列(不包含加入或缺失)相比较时，所述比较窗中聚核苷酸序列的部分可包含加入或缺失(即，间隙)。通过测定相同核酸碱基出现于两个序列中的位置的数量得到匹配位置的数量，以匹配位置的数量除以比较窗中的位置总数并将结果乘以100以得到序列同一性的百分数，从而来计算所述百分数。雄蕊是指产生雄配子的花器官且包括花药和花丝。绒毡层是指包围被子植物花药的小造孢细胞(microsporogenouscell)或裸子植物雄球花内的微造孢细胞的细胞层。已知其极其接近正在发育的小孢子，绒毡层可能向正在发育的小孢子提供养分，诸如还原糖、氨基酸和脂质。Reznickova，C.R.，Acad.Bulg.Sci.31:1067(1978).Nave等人，J.PlantPhysiol.125:451(1986).Sawhney等人，J.PlantPhysiol125:467(1986)。绒毡层细胞也产生(3(1，3)葡聚糖酶(过氧化氢酶)，其通过消化胼胝质细胞壁促进小孢子释放。因此，绒毡层与小造孢细胞之间存在脆弱的关系，且对于绒毡层的任何破坏都可能导致无功能的花粉粒。举例来说，己展示，绒毡层生物发生的损伤会导致雄性不育性突变体(Kaul，"MaleSterilityinHigherPlants"inMonographsonTheoreticalandAppliedGenetics;Frankel等人编辑；SpringerVerlag;Vol.10;第15-95页；(1988))。因此，编码过氧化氢酶的基因可用于破坏雄性繁殖发育。由此，可使用例如重组DNA分子来诱导使小孢子无法发育成成熟花粉粒，所述重组DNA分子包含能够在绒毡层特异性调控序列控制下破坏绒毡层功能的基因。转录因子转录因子是指通过与一种或一种以上与基因编码序列有关的核苷酸序列直接结合或间接影响与一种或一种以上与基因编码序列有关的核苷酸序列直接结合的另一聚核苷酸的活性来调控基因表达的多肽序列。转录因子可活化(上调)或阻遏(下调)基因的表达。转录因子可含有DNA结合结构域、活化结构域或蛋白质-蛋白质相互作用结构域。在本发明中，转录因子能够进行(1)与核酸序列结合或(2)调控植物细胞中基因的表达的至少一种。转录和翻译终止子本发明的表达DNA构筑体通常在转录起始调控元件对立端具有转录终止区。可根据mRNA的稳定性来选择转录终止区以增强表达，和/或可根据加入到基因转录产物中的多聚腺苷酸化尾的加入来选择转录终止区。转移DNA(T-DNA):农杆菌T-DNA是一种基因元件，众所周知，其为一种能够将其边界内所含的核苷酸序列整合到另一基因组中的元件。就这方面来说，T-DNA通常通过两个"边界"序列侧面相接。本发明的所需聚核苷酸和可选择标记可定位于T-DNA的左边界样序列(leftborder-likesequence)与右边界样序列之间。可将T-DNA内所含的所需聚核苷酸和可选择标记可操作地连接到促进其表达(即，由所需聚核苷酸或可选择标记编码的DNA序列的转录和/或翻译)的多种不同、植物特异性(即，天然)或外来核酸，如启动子和终止子调控元件。植物细胞的转化一种将核酸稳定插入到植物细胞基因组中的方法。转化可在天然或人工条件下使用多种此项技术中众所周知的方法发生。转化可取决于将核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的任何已知方法，包括农杆菌介导的转化方案、病毒感染、噬菌体晶须(whisker)、电穿孔、微注射、聚乙二醇处理、热休克(heatshock)、脂转染(lipofection)禾口粒子轰击。转基因植物本发明的转基因植物是包含至少一种已稳定整合外源核酸的细胞基因组的植物。根据本发明，转基因植物是一种可仅包含一种经基因修饰的细胞和细胞基因组的植物，或其可包含若干种或许多经基因修饰的细胞，或所有所述细胞都可经基因修饰。本发明的转基因植物可为一种所需聚核苷酸(即，外源核酸)的表达仅发生于植物的某些部分中的植物。因此，转基因植物可仅在其结构的某些部分中含有经基因修饰的细胞。变异体如本文所使用的"变异体"应理解为意指源自特定基因的参考(即，天然、标准或已知)核苷酸序列的核苷酸序列。术语"同工型(isoform)"、"同种型(isotype)"和"类似物"也是指核苷酸序列的"变异体"形式。变异体也可指"改组基因(shuffledgene)"，诸如颁予Maxygen的专利中所述的那些基因。举例来说，本发明的变异体可包括根据美国专利第6,132,970号中所公开的方法和基本原理修饰的序列和所需聚核苷酸的变异体，所述专利是以引用的方式并入本文。营养生长这一为此项技术广泛接受的术语是指植物的常规、总体发育。详细说来，例如，繁殖后，分生组织细胞分化成最终发育成根和枝条且之后发育成叶和花的顶端分生组织和侧分生组织。枝条和根构型、分枝模式、发育成叶、花瓣、花和果实的杆、腋芽和原基细胞等都被认为是植物的"营养期"和"营养生长"循环的一部分。所述特征的发育速率视多种因素而定，诸如植物种类、光合作用、养分的可用性和植物生长的一般环境。遗传学也在成形植物发育中起到重要的文字和比喻作用。举例来说，可通过基因表达推断"单叶"或"复叶"的形状，即其以周边光滑、深叶片(deeplobe)、个别小叶或巻须为特征。例如，"LEAFY"基因对于复叶发育起到作用且对于从营养生长至繁殖发育的过渡至关重要。已在拟南芥和金鱼草中鉴别出LEAFY,且其与其他被子植物中的基因相同。豌豆的同源物Unifoliata具有复叶变为单叶的突变体表型，其可表明枝条与复叶之间的调控关系。类似地，金合欢突变体"tl"将巻须转变成小叶，同时突变afilia("af")将小叶转变成巻须。"aftl"双突变体具有复杂构型，类似于欧芹叶。同样，始终在所述"营养"植物细胞和组织中表达的其它基因也是这样，且包含植物其它细微部分的发育、生理学和结构特性。因此，存在许多特定或主要在所有营养组织(诸如，根、枝条、杆和叶)中表达的"营养特异性"基因，或其为营养组织特异性。因此，所述基因的启动子可用于引导所需的内源或外来基因表达特定的营养组织。由此，可能优先在一种或一种以上营养组织中表达基因产物，同时避免在诸如繁殖组织细胞的非营养组织中表达相同产物。木材组成是指可经修饰以改变木材的结构、外观或用途的特质。并非出于限制，确定木材组成的特质包括细胞壁厚度、细胞长度、细胞尺寸、内腔尺寸、细胞密度、微纤维角度、拉伸强度、撕裂强度、木材颜色和细胞分裂的长度和频率。木浆是指由具有不同纯度的树木产生的纤维。木浆可用于造纸、纸板和化学制品。应了解，由于本文所述的特定方法、方案、载体和试剂等可变化，所以本发明不限于此。还应了解，本文所使用的术语只是出于描述特定实施例的目的使用，且不打算限制本发明的范畴。必须注意，除非本文另作清楚指示，否则如本文和随附权利要求中所使用的单数形式"一种"和"所述"包括多种参考物。因此，举例来说，"基因"的相关物为一种或一种以上基因的相关物，且包括其所属领域技术人员己知的等效物。当然，所属领域技术人可使用本文所述的方法来表达植物宿主系统中的任何天然基因(当前或后来已知)。微"经分离"核酸分子预期表示己从天然环境中移除的核酸分子、DNA或RNA。举例来说，认为载体中所含的重组DNA分子是出于本发明的目的而分离的。经分离的DNA分子的其它实例包括异源宿主细胞中维持的重组DNA分子，或溶液中的经纯化(部分或大体全部)DNA分子。经分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体外RNA转录本。根据本发明，经分离核酸分子另外包括合成制得的所述分子。本发明的核酸分子可为RNA的形式，诸如mRNA;或DNA的形式，包括(例如)通过克隆获得或合成制得的cDNA和基因组DNA。DNA或RNA可为双链或单链。单链DNA可为编码链，也称为有义链；或其可为非编码链，也称为反义链。除非另外指出，否则通过对本文中的DNA分子测序所测定的所有核苷酸序列都是使用自动化DNA测序仪(诸如来自AppliedBiosystems，Inc.的3700型)测定，且由本文所测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列都是通过翻译如上文所测定的DNA序列进行预测。由于此项技术中己知通过此自动化方法测定的任何DNA序列，所以本文所测定的任何核苷酸序列都可能含有一些错误。通过自动操作测定的核苷酸序列与经测序DNA分子的实际核苷酸序列具有通常至少约95%、更通常至少约％%直至至少约99%同一性。可通过其它方法(包括此项技术中众所周知的人工DNA测序方法)更精确地测定实际序列。也如此项技术中已知，与实际序列相比，已测定的核苷酸序列中的单一插入或缺失将引起核苷酸序列翻译时框架移位(frameshift),从而使所预测的由已测定的核苷酸序列编码的氨基酸序列可能从所述插入或缺失点开始与由经测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列完全不同。除非另作指示，否则本文所述的每一"核苷酸序列"都是以脱氧核糖核苷酸序列(简写为A、G、C和T)呈现。然而，预期核酸分子或聚核苷酸的"核苷酸序列"为DNA分子或聚核苷酸，即脱氧核糖核苷酸；和RNA分子或聚核苷酸，即特定脱氧核苷酸序列中的每一胸苷脱氧核苷酸(T)都经核糖核苷酸尿苷(U)置换的核糖核苷酸(A、G、C和U)的对应序列。举例来说，预期具有使用脱氧核糖核苷酸简写陈述的SEQIDNO:l序列的RNA分子的相关物表明具有其中SEQIDNO:l的每一脱氧核糖核苷酸A、G或C都已经相应核糖核苷酸A、G或C置换且每一脱氧核糖核苷酸T都已经核糖核苷酸U置换的序列的RNA分子。本发明还涉及本文所述的经分离核酸分子的片段。预期具有本文所公开的核苷酸序列的经分离DNA分子的片段为至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸长的DNA片段，其可用作诊断探针，且引物将于下文中更详细地讨论。当然，根据常规杂交技术，长达本发明核酸分子的全长的较长核酸片段也可在诊断上用作探针，或用作引物以通过聚合酶链反应(PCR)扩增目标序列，举例来说，如MolecularCloning,ALaboratoryManual,第3版，Sambrook，J禾口Russel，D.W.编辑，(2001)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork中所述，所述文献的整个公开内容以引用的方式并入本文。预期(例如)至少20个核苷酸长的片段为包括20个或20个以上来自如本文所公开的核苷酸序列(即，SEQIDNO1-26)的相邻碱基的片段。可使用对于所属领域技术人员来说为例行程序的常规DNA合成方法来产生包含本文所公开的核苷酸序列的核酸。举例来说，可简单地使用限制性核酸内切酶裂解或超音波处理剪切来产生各种尺寸的片段。或者，可根据己知技术合成性产生本发明的DNA片段。另一方面，本发明提供一种经分离的核酸分子，其包含在严格杂交条件下与上述本发明核酸分子中的一部分聚核苷酸杂交的聚核苷酸。预期与"一部分"聚核苷酸杂交的聚核苷酸为与参考聚核苷酸中至少约15个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸和30个以上核苷酸杂交的聚核苷酸(DNA或RNA)。与参考片段杂交的这些片段可用作诊断探针和引物。如本文所使用，探针是定义为一个本文所公开的核酸(即，SEQIDNOl-S和13-26)中的至少约50个相邻碱基。出于本发明的目的，当两个序列在6xSSC、0.5%SDS、5xDenhardt氏溶液和100非特异性DNA载体的杂交溶液中形成双链复合物时，其杂交。参看Ausubel等人，第2.9节，第27增补版(1994)。序列可在"中等严格度"下杂交，所述"中等严格度"定义为在6xSSC、0.5%SDS、5xDenhardt氏溶液和100吗非特异性载体DNA的杂交溶液中、在6(TC的温度下。就"高严格度"杂交来说，温度增加至68'C。在中等严格度杂交反应后，室温下，在2xSSC和0.05呢SDS溶液中洗涤核苷酸5次，随后在60'C下用0.1xSSC和0.05呢SDS溶液洗涤lh。对于高严格度来说，洗涤温度增加至6S'C。出于本发明的目的，杂交核苷酸为使用具有10,000cpm/ng的比放射性的1ng经放射标记的探针检测的核苷酸，其中杂交核苷酸在-7(TC下曝露于X射线胶片仅72小时后即清晰可见。如前文所提及，本申请案涉及与上述核酸序列具有至少90%、95%、％%、97%、98%、99%或100%同一性的所述核酸分子。一个实施例涵盖与SEQIDNO1-8和13-26中所示的核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核酸分子。具有与参考核苷酸序列具有至少(例如)95%同一性的核苷酸序列的聚核苷酸意味着聚核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，但对于每100个参考核苷酸序列的核苷酸来说，聚核苷酸序列可包括多达五个突变点。换句话说，为获得具有与参考核苷酸序列具有至少95%同一性的核苷酸序列的聚核苷酸，参考序列中多达5%核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代，或可将占参考序列中总核苷酸多达5%的数量的核苷酸插入到参考序列中。参考序列的这些突变可出现于参考核苷酸序列的5'或3'末端位置处，或所述末端位置之间的任何位置处，独立地散布于参考序列中的核苷酸之间或散布于参考序列内一个或一个以上相邻基团中。实际上，任何特定核酸分子是否与参考核苷酸片段具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性是指使用此项技术中众所周知的标准算法在两个分子之间作出的比较。尽管可使用任何序列算法来定义序列的同一性，但为清楚起见，本发明参考基本局部比对搜寻工具(BasisLocalAlignmentSearchTool，BLAST)算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990))来定义同一性，其中将
发明内容中所述的启动子序列用作参考序列以在其长度范围内定义聚核苷酸同源物的同一性百分数。匹配、错配和插入或缺失的参数值的选择是任意的，但已经发现某些参数值以得到在生物学上比其它值切合实际的结果。当使用BLAST或任何其它序列比对程序来确定特定序列(例如)是否与本发明的参考序列具有95%同一性时，当然设置参数，从而能够在参考核苷酸序列的全长范围内计算同一性百分数，且能够允许同源性的间隙占参考序列中总核苷酸数量多达5%。也可参考两种聚核苷酸通过形成互补碱基对而杂交形成双链复合物的能力来描述其间关联。本文先前已描述杂交条件。可使用增加温度来分裂这些复合物。在结构上更相同的两个序列为需要较高温度使其分裂或将其"熔解"的序列。熔解双链复合物所需的温度称为"Tm"。Tm与其它杂交参数之间的关系为Tm(°C)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(分率G+C)-0.63(甲酰胺％)-(600〃)其中Tm为由探针和其目标组成的DNA双链体的熔解温度；且1=碱基对中杂合物的长度，限制条件为1〉100个碱基对。Bolton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.48:1390(1962)。一般说来，熔点改变rC表示DNA序列相似度存在0.7%至3.2%的差异。Bonner等人，JournalofMolecularBiology81:123-35(1973);McCarthy等人,InEvolutionofGeneticSystems,H.H.Smith(编车茸),BrookhavenSymposiuminBiologyNo.23，GordonandBreach,NewYork,第1-43页(1972)。在6(TC下形成稳定的DNA双链体通常需要序列之间存在至少80%的序列同一性。Sibley等人，ACTA1:83-121(第18届国际鸟类学大会的会议记录(Proceedingsofthe18thInternationalOrnithologicalCongress)，Moscow,1982年8月16-24日，AcademyofSciencesoftheUSSR)。在一实施例中，本发明的核酸使被子植物和裸子植物的繁殖组织中的多肽或蛋白质能够优先表达。本发明的核酸也可优先引导植物繁殖组织中反义RNA或RNA干预(RNAi)中涉及的RNA(诸如，小干预RNA(siRNA))的表达，其可用于抑制或完全阻断目标基因的表达。繁殖植物组织包括繁殖器官的雄性与雌性部分。雄性组织包括(例如)花粉、绒毡层、花药、花丝、花粉母细胞、小孢子、雄性花粉球(雄球花)和成熟前雄性繁殖结构。雌性繁殖组织包括(例如)柱头、花柱、子房、大孢子、雌球果(胚珠)和成熟前雌性繁殖结构。繁殖优选的启动子是指优先在植物繁殖组织中表达的启动子。繁殖植物组织包括繁殖结构的雄性与雌性部分，以及成熟前雄性繁殖结构与成熟前雌性繁殖结构中表达的启动子。雄性繁殖组织包括(例如)花粉粒、绒毡层、花药、花丝、花粉母细胞、小孢子和花粉球。雌性繁殖组织包括(例如)柱头、花柱、子房、大孢子和胚珠。因此，繁殖优选的启动子除在裸子植物和被子植物的任何成熟前雄性组织或成熟前雌性组织中表达外，还可优先在任何被子植物或裸子植物种类的任何繁殖结构中表达。在一实施例中，繁殖优选的启动子使雄性繁殖组织中的基因得以表达。在一实施例中，繁殖优选的启动子使被子植物种类的花药、花粉或花丝细胞中能够基因表达。在另一实施例中，繁殖优选的启动子使绒毡层或花药表皮细胞中能够基因表达。在另一实施例中，繁殖优选的启动子使雄性花粉球、绒毡层、小孢子叶或裸子植物中存在的任何其它雄性繁殖组织中能够基因表达。对于被子植物和裸子植物来说，繁殖优选的启动子使成熟前雄性繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构中能够基因表达。繁殖优选的启动子可用于(例如)使植物雄性不育。举例来说，可使繁殖优选的启动子可操作地连接到细胞毒素基因，从而使雄性繁殖组织中细胞毒素基因的表达使植物无法产生可育雄配子。在另一实施例中，可选择并分离繁殖优选的启动子，从而使所述启动子不表达非繁殖组织(诸如营养组织)中可操作地连接的基因。在一实施例中，繁殖优选的启动子使雌性繁殖组织中的基因能够表达。在一实施例中，繁殖优选的启动子使被子植物的柱头、花柱或子房中的基因能够表达。在另一实施例中，繁殖优选的启动子使雌球花(胚珠)、大孢子叶或裸子植物中存在的任何其它雌性繁殖组织中能够基因表达。对于被子植物和裸子植物来说，繁殖优选的启动子使成熟前雄性繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构中能够基因表达。繁殖优选的启动子可用于(例如)使植物雌性不育。在一实施例中，可使繁殖优选启动子可操作地连接到细胞毒素基因，从而使雌性繁殖组织中细胞毒素基因的表达使植物无法产生可育雌配子、雌合子和/或种子。在另一实施例中，可选择并分离繁殖优选启动子，从而使启动子不表达非繁殖组织(诸如营养组织)中可操作地连接的基因。举例来说，可通过搜寻仅在繁殖发育过程中存在的mRNA来鉴别繁殖优选的启动子。另外，繁殖优选的启动子可存在于成熟前雄性繁殖组织和成熟前雌性繁殖组织中。在一实施例中，由植物雄性繁殖组织发育过程中存在的mRNA鉴别繁殖优选启动子，所述雄性繁殖组织包括(例如)花药、花粉、花丝、雄球花和成熟前雄性繁殖组织。在一实施例中，由植物雌性繁殖组织发育过程中存在的mRNA鉴别繁殖优选启动子，所述雌性繁殖组织包括(例如)柱头、花柱、子房、胚珠和成熟前雌性繁殖组织。鉴别并分离繁殖优选mRNA后，由这一繁殖优选mRNA制备cDNA。可将所得cDNA用作探针以鉴别植物基因组中含有编码繁殖优选mRNA的DNA的区域。已鉴别DNA后，可分离编码繁殖优选启动子的DNA上游(即，5')的序列。如本文所使用，预期启动子意指结合RNA聚合酶和/或其它转录调控元件的核酸、优选DNA。与任何启动子一样，本发明的启动子将促进或控制DNA或RNA转录，从而由可操作地连接到所述启动子的核酸分子产生mRNA分子。如上文所述，所产生的RNA可编码蛋白质或多肽，或可编码RNA干预或反义分子。如本文所使用，"可操作地连接"是指DNA的化学融合、接合或合成，从而以适当的方向形成启动子-核酸序列组合以使核酸序列转录成RNA区段。本发明的启动子也可含有所得mRNA转录本的部分或所有5'未翻译区(5'UTR)。另一方面，本发明的启动子不需具有任何5'UTR。如本文所使用的启动子也可包括调控元件。相反，调控元件也可与启动子分离。调控元件赋予启动子区多种重要特性。一些元件与增强可操作地连接的核酸的转录速率的转录因子结合。其它元件与抑制转录活性的阻遏物结合。转录因子对启动子活性的综合作用可确定启动子活性为高或低的，即启动子为"强"或"弱"。结合调控元件的转录因子本身可通过对胞外刺激物起反应而与其它已结合的蛋白质相互作用或通过共价修饰(例如，磷酸化)得到调控。通过与细胞核联系的信号转导分子(诸如，有机体的胞内代谢物或外源化学物质)来调节某些转录因子的活性。不受细胞环境改变影响的启动子称为组成性启动子。在另一实施例中，本发明的核酸编码破坏表达核酸的细胞的代谢、功能和/或发育的表达产物。在一实施例中，本发明的核酸编码细胞毒素表达产物。在一实施例中，本发明的核酸包含barnase。在另一实施例中，可通过此项技术中已知的增加和/或降低barnase活性的方法使barnase突变。在一实施例中，突变barnase可具有减弱的细胞毒素活性。本发明还提供包含本发明的经分离的核酸分子和多肽的载体。在一实施例中，本发明的载体为得自根癌农杆菌的Ti质粒。在研究本发明的构筑体时，通常将所述构筑体或其片段的各种组件插入到常规克隆载体中，例如，能够在细菌宿主(例如大肠杆菌(E.coli))中复制的质粒。存在多种已在文献中描述的载体，许多载体市面有售。每次克隆后，可分离具有所需插入物的克隆载体，并使其经历进一步处理以定制具有所需序列的组件，所需处理诸如限制性消化、插入新片段或核苷酸、接合、缺失、突变、切除等。已完成构筑体后，随后可将其转移至适当的载体中以供根据宿主细胞的转化方式进行的进一歩处理。本发明的重组DNA分子通常包括可选择的标记，从而可能从未经转化的细胞中轻易地鉴别经转化细胞并加以选择。所述标记的实例包括(但不限于)新霉素磷酸转移酶(叩tll)基因，其赋予卡那霉素抗性。Potrykus等人，Mol.Gen.Genet.199:183-188(1985)。可使用诸如卡那霉素或G418的适当抗生素来选择表达叩tll基因的细胞。其它常用的可选择标记包括bar基因，其赋予双丙氨膦(bialaphos)抗性；突变体EPSP合成酶基因(Hinchee等人，Bio/Technology6:915-922(1988))，其赋予草甘膦抗性；腈水解酶基因，其赋予对溴苯腈的抗性(Stalker等人，J.Biol，Chem.263:6310-6314(1988));突变体乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，其赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(欧洲专利申请案154,204,1985);和抗甲胺喋呤(methotrexate)的DHFR基因(Thillet等人，J.Biol.Chem.263:12500-12508(1988))。另外，载体可包括特定宿主细胞的复制起点(复制子)。所属领域技术人员已知多种原核复制子，且其起到引导原核宿主细胞自主复制和维持重组分子的作用。载体将优选含有可选择的标记。用于选择经转染植物细胞的多种可选择标记包括(但不限于)在大肠杆菌、根癌农杆菌和其它细菌中培养的抗卡那霉素基因、抗草甘膦基因和四环素或氨比西林(ampicillin)抗性基因。适于使用微弹轰击(microprojectilebombardment)将本发明的核酸引入单子叶植物中的质粒载体是由以下元件构成选择性启动子；提供剪接位点以促进基因表达的内含子，诸如Hsp70内含子(PCT公开案WO93/19189);和3'多聚腺苷酸化序列，诸如胭脂碱合成酶(nopalinesynthase)3'序歹iJ(NOS3')。Fraley等人，ProcNatlAcadSciUSA80:4803-4807(1983)。这一表达盒可组装于适于产生大量DNA的高拷贝复制子上。用于转化双子叶植物的特别有益的基于农杆菌的植物转化载体为质粒载体pMON530(Rogers等人，(1987)Improvedvectorsforplanttransformation:expressioncassettevectorsandnewselectablemarkers.InMethodsinEnzymology.R.Wu禾口L.Grossman编辑，第253-277页，SanDiego:AcademicPress)。质粒pMON530是通过将pMON316的2.3kbStuI-HindII片段(Rogers等人，(1987)Improvedvectorsforplanttransformation:expressioncassettevectorsandnewselectablemarkers.InMethodsinEnzymology.R.Wu禾卩L.Grossman编辑.第253-277页.SanDiego:AcademicPress)转移至pMON526中而制备的pMON505衍生物。质粒pMON526是其中Smal位点因Xmal消化、Klenow聚合酶处理和接合而移除的pMON505的简单衍生物。质粒pMON530保留pMON505和CaMV35S-NOS表达盒的所有特性，且现在启动子与多聚腺苷酸化信号之间含有独特的Smal切割位点。二元载体pMON505是Ti质粒同源区LIH己经小RK2质粒(miniRK2plasmid)pTJS75的3.8kbHindIII至ijSmal区段置换的pMON200(Rogers等人，1987)的衍生物(Schmidhauser和Helinski.J.Bacteriol.164-155(1985))。这一区段含有使用三亲交配程序(tri-parentalmatingprocedure)结合到农杆菌中的RK2复制起点oriV和转移起点oriT(Horsch禾卩KleeProc.Natl.Acad.Sci.USA83:4428-4432(1986))。质粒pMON505保留pMON200的所有重要特征，包括用于插入所需DNA片段中的合成多连接子(syntheticmulti-linker);用于植物细胞抗卡那霉素的嵌合NOS/NPTII/NOS基因；用于大肠杆菌和根癌农杆菌选择的抗奇放线菌素(spectinomycin)/抗链霉素(streptomycin)决定子；便于对转化体和后代遗传记分的完整胭脂碱合成酶基因；和便于在大肠杆菌中制得大量载体的pBR322复制起点。质粒pMON505含有得自pTiT37胭脂碱型T-DNA的右端的单一T-DNA边界。Southern印记分析己展示，质粒pMON505和其所携带的任何DNA都已整合到植物基因组中，也就是说，完整的质粒为已插入到植物基因组中的T-DNA。整合DNA的一端位于右边界序列与胭脂碱合成酶基因之间，且另一端是介于边界序列与pBR322序列之间。另一特别有用的Ti质粒盒载体为pMON17227。这一载体在PCT公开案WO92/04449中得以描述，且含有编码赋予草甘膦抗性的酶的基因(命名为CP4)，其是许多植物优良的选择性标记，包括马铃薯和番茄。使基因与拟南芥EPSPS叶绿体转运肽(CTP2)融合，且通过所选择的启动子驱动表达。为将经翻译蛋白质分泌到内质网内腔、周质空间或胞外环境中，可将适当的分泌信号并入所表达的多肽中。所述信号对于所述多肽来说可为内源信号，或其可为异源信号。在一实施例中，以使本文所述的核酸为组织特异性启动子的方式设计本发明的载体，所述启动子可操作地连接到编码所关注的多肽的DNA。在另一实施例中，所关注的多肽为繁殖发育或调控繁殖发育方面所涉及的蛋白质。编码繁殖发育中所涉及的许多蛋白质的多肽包括(但不限于)AGAMOUS(AG)、APETALA1(AP1)、APETAL3(AP3)、PISTILLATA(PI)、LEAFY(LFY)禾口LEUNIG(LUG)。在另一实施例中，可操作地连接到启动子的编码序列可编码抑制繁殖发育所涉及的蛋白质的表达或活性的基因产物。举例来说，可将编码消化包围正在发育的花粉粒的胼胝质细胞壁的酶过氧化氢酶的基因可操作地连接到绒毡层优选的启动子，并在花粉成熟前表达，由此破坏花粉的发育。在另一实施例中，可操作地连接到启动子的编码序列可编码细胞毒素基因产物。举例来说，可使编码baraase的基因可操作地连接到繁殖优选的启动子，并使其在繁殖组织中表达。在另一实施例中，可使用标准分子生物学方法使baraase活性突变。在一实施例中，经突变的barnase与野生型baraase蛋白质相比具有降低的RNA酶活性。在另一实施例中，使具有降低的RNA酶活性的突变barnase可操作地连接到繁殖优选的启动子，并使其在繁殖组织中表达。在又一实施例中，繁殖组织中具有降低的RNA酶活性的突变barnase的表达并不危及营养生长和发育。在另一实施例中，设计本发明的载体从而使本发明的核酸可操作地连接到编码反义RNA或干预RNA且与编码所关注的多肽的基因对应的核酸，引起目标基因产物的表达减少。在一实施例中，旨在抑制的基因产物为繁殖发育所涉及的蛋白质。使用RNAi抑制基因表达一般在Paddison等人，Genes&Dev.16:948-958(2002)中得以描述，且使用RNAi抑制植物基因的表达特别描述在WO99/61631中，所述两种专利文献都以引用的方式并入本文中。使用反义核酸技术(antisensetechnology)来降低或抑制特定植物基因的表达已描述在(例如)欧洲专利公开案第271,988号中。基因表达的降低导致植物表型改变，在总可见表型差异水平上，例如导致番茄果实中番茄红素合成的缺乏，引起产生黄色而非红色果实；或在更细微的生物化学水平上，例如导致番茄果实成熟期间多聚半乳糖醛酸酶的量改变和胶质解聚合减少。Smith等人,Nature,334:724-726(1988)。Smith等人，PlantMol.Biol.,14:369-379(1990)。因此，已证实反义RNA可用于达成植物中基因表达的减少。在制造本发明的植物的方法的一个实施例中，将能够在植物内转录得到反义RNA转录本的外源DNA引入植物中，例如引入植物细胞中。举例来说，可通过关于基因序列的启动子倒转基因序列方向来制备外源DNA。植物细胞中外源DNA转录会产生关于所述基因为"反义"的胞内RNA转录本。本发明还提供包含本发明的载体的宿主细胞。如本文所使用，宿主细胞是指最终表达编码产物的细胞。因此，宿主细胞可为个体细胞、细胞培养物或作为有机体的部分的细胞。宿主细胞也可为胚、胚乳、精子或卵细胞或受精卵的一部分。可通过此项技术中已知的将重组载体DNA引入目标宿主细胞中的标准程序将本发明的载体引入宿主细胞中。所述程序包括(但不限于)转染、感染、转化、正常摄取、电穿孔、基因枪和农杆菌。此项技术中已知将外来基因引入植物中的方法，且所述方法可用于将本发明的基因构筑体插入植物宿主中，所述方法包括生物和物理植物转化方案。例如，参看Miki等人，1993，"ProcedureforIntroducingForeignDNAIntoPlants",In:MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick禾口Thompson编辑，CRCPress,Inc.,BocaRaton，第67-88页。所选择的方法随宿主植物而变化，且包括化学物质转染方法，诸如磷酸钙；微生物介导的基因转移，诸如农杆菌(Horsch等人，Science227:1229-31，(1985));电穿孔；微注射；和基因枪轰击。因此，本发明还提供植物或植物细胞，其包含本发明的载体。在一实施例中，所述植物为被子植物或裸子植物。在另一实施例中，所述植物是选自桉树属和其杂交物，和松属。或者，所述植物可选自北美短叶松(Pinusbanksiana)、爱琴海松(Pinusbrutia)、力口勒比松(Pinuscaribaea)、砂地松(Pinusclausa)、小干松(Pinuscontorta)、力口州丰公(Pinuscoulteri)、萌芽松(Pinusechinata)、阿富汗松(Pinuseldarica)、(Pinusellioti)、黑材松(Pinusjeffreyi)、糖松(Pinuslambertiana)、马尾松(Pinusmassoniana)、山白丰公(Pinusmonticola)、欧洲黑松(Pinusnigra)、长叶松(Pinuspalustrus)、海岸松(pinuspinaster)、西黄松(Pinusponderosa)、辐射松(Pinusradiata)、美力口红松(Pinusresinosa)、冈U松(Pinusrigida)、晚松(Pinusser。tina)、北美乔松(Pinusstrobus)、棒子松(Pinussylvestris)、火炬松(Pinustaeda)、北美二针松(Pinusvirginiana)、太平洋银冷杉(Abiesamabilis)、香脂冷杉(Abiesbalsamea)、科罗拉多冷杉(Abiesconcolor)、北美冷杉(Abiesgrandis)、高山7令杉(Abieslasiocarpa)、力口州乡I7令杉(Abiesmagnifica)、4士丽7令杉(Abiesprocera)、美国扁柏(Chamaecyparislawsoniona)、黄扁柏(Chamaecyparisnootkatensis)、美国尖口十扁柏(Chamaecyparisthyoides)、雪松(Juniperusvirginiana)、欧洲落叶松(Larixdecidua)、北姜藩叶松(Larixlaricina)、日本落叶松(Larixleptolepis)、美国西部落叶松(Larixoccidentalism西比禾lj亚落叶松(Larixsiberica)、美国西部肖捕(Libocedrasdecurrens)、欧洲云杉(Piceaabies)、恩氏云杉(Piceaengel腿nni)、白云杉(Piceaglauca)、黑云杉(Piceamariana)、北美云杉(Piceapungens)、红云杉(Picearubens)、西力口云杉(Piceasitchensis)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、巨杉(Sequoiagigantea)、北美红杉(Sequoiasempervirens)、落习习杉(Taxodiumdistichum)、力口拿大铁杉(Tsugacanadensis)、西咅卩铁杉(Tsugaheterophylla)、高山铁杉(Tsugamertensiana)、北美香柏(Thujaoccidentalis)、北美乔柏(Thujaplicata)、白按(Eucalyptusalba)、澄枝(Eucalyptusbancroftii)、葡萄桉(Eucalyptusbotryoides)、苹果桉(Eucalyptusbridgesiana)、尾口十桉(Eucalyptuscalophylla)、赤桉(Eucalyptuscamaldulensis)、柠檬桉(Eucalyptuscitriodora)、舌甘口十桉(Eucalyptuscladocalyx)、南澳雪桉(Eucalyptuscoccifera)、Eucalyptuscurtisii、丰桉(Eucalyptusdalrympleana)、录lj皮桉(Eucalyptusdeghipta)、大桉(Eucalyptusdelagatensis)、会I^K(Eucalyptusdiversicolor)、又卩恩、按(Eucalyptusdunnii)、纟工花枝(Eucalyptusficifolia)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、蓝桉(Eucalyptusglobulus)、棒头桉(Eucalyptusgomphocephala)、力口禾U桉(Eucalyptusgunnii)、Eucalyptushenryi、银顶纤皮桉(Eucalyptuslaevopinea)、毛皮桉(Eucalyptusmacarthurii)、大咀桉(Eucalyptusmacrorhyncha)、斑皮桉(Eucalyptusmaculata)、赤桉(Eucalyptusmarginata)、Eucalyptusmegacarpa、蜜味桉(Eucalyptusmdliodora)、Eucalyptusnicholii、亮果桉(Eucalyptusnitens)、Eucalyptusnova-angelica、斜-叶桉(Eucalyptusobliqua)、西方桉(Eucalyptusoccidentalis)、Eucalyptusobtusiflora、奥里桉(Eucalyptusoreades)、雪桉(Eucalyptuspauciflora)、多枝桉(Eucalyptuspolybractea)、王按(Eucalyptusregnans)、树月旨按(Eucalyptusresinifera)、大口十枝(Eucalyptusrobusta)、野桉(Eucalyptusmdis)、賴P口十桉(Eucalyptussaligna)、红皮铁桉(Eucalyptussideroxylon)、Eucalyptusstuartiana、细叶桉(Eucalyptustereticornis)、毛口十桉(Eucalyptustorelliana)、丽桉(Eucalyptusurnigera)、尾叶桉(Eucalyptusurophylla)、多枝桉(Eucalyptusviminalis)、Eucalyptusviridis、Eucalyptuswandoo禾口Eucalyptusyoumanni。具体说来,转基因植物可为以下种类巨桉、辐射松、火炬松(PinustaedaL)(火炬松)、钻天杨(Populusnigra)、三角杨(Populusdeltoides)、柚木(Tectonag醒dis)或马占相思(Acaciamangium)。除植物的一般含义之外，预期术语"植物"还意谓植物的果实、种子、花、球果等。本发明的植物可为直接转染体，表明诸如通过农杆菌将载体直接引入植物中；或所述植物可为经转染植物的后代。第二代或继代植物可通过有性繁殖(即，传粉)产生，或可不通过其产生。而且，植物可为配子体(单倍体阶段)或孢子体(二倍体阶段)。本发明还提供一种控制植物繁殖发育的方法，其包含栽培包含本发明的载体的植物或种子。诱导或维持本发明的植物或种子生长或萌发的适当栽培具有种属特异性，且在此项技术中的普通技术范围内。关于栽培的环境可为促进植物或种子生长或萌发的任何地方。而且，栽培也可包括以下步骤，诸如(但不限于)提供胁迫处理(stresstreatment)(例如，脱氮、热休克、低温、蔗糖脱除)，其可诱导胚发生(embyrogenesis)。本发明另外提供经分离的调控元件，其与转录因子结合并能够调控组织优选或组织特异性表达。通过调控元件所赋予的调控程度可为完全的，表明在无转录因子的情况下转录不可检测；或可为部分的，表明在转录因子存在下转录增强。在一实施例中，使至少一种调控元件可操作地连接到异源启动子以提供复合启动子。所述复合启动子优先或特异性在繁殖组织中表达。如本文所使用，异源启动子是含义相对于调控元件来说的短语。如果在自然环境中调控元件和启动子彼此无关，那么认为启动子相对于调控元件为异源的。通常，启动子区内调控元件的确切定向将不会影响其活性。而且，当将调控元件插入到异源启动子区中时，其可正常起作用。因此，举例来说，可将繁殖优选的调控元件从其内源启动子移除，且可将其插入到异源启动子区中以赋予繁殖特异性或优先选择性。异源启动子可为(例如)最小CaMV35S启动子。在植物细胞中直接表达且适于修饰成最小启动子的启动子包括花椰菜病毒(CaMV)35S启动子(Jefferson等人，EMBOJ.,6:3901-07(1987));稻子肌动蛋白启动子(riceactinpromoter)(McElroy等人，PlantCell,2:163-71(1990));玉米泛素-l启动子(maizeubiquitin-1promoter)(Christensen等人，TransgenicResearch,5:213-18(1996));和胭脂碱合成酶启动子(Kononowics等人，PlantCell4:17-27(1992))。为制备本发明的核酸，由辐射松和火炬松使用多种限制性核酸内切酶将基因组消化成不连续片段来制造基因组文库。基因组文库可类似地由获得组织选择性启动子所需的任何植物种类构筑。根据CIontech有关其GenomeWalkerTM系统(Clontech,PaloAlto,CA)的使用所提供的程序，使接头与每一所述基因组序列接合。随后，使用接头特异性引物和"基因特异性引物"以PCR扩增启动子序列。或者，这一PCR扩增步骤视情况可由以引用方式并入本文的美国专利第5,565,340号和第5,759,822号中所述的方法进行，以得到具有较长长度和最小背景的反应产物。使用这一通用PCR扩增方法，通过选择"基因特异性引物"来管理本发明的启动子的鉴定和其作为组织选择性启动子的鉴定。基因特异性引物为在所关注的组织中以高水平表达的任何经转录的序列。在本发明中，基因特异性引物.为在繁殖组织中以高水平表达的mRNA的片段，或其与在繁殖组织中以高水平表达的mRNA互补。在一实施例中，基因特异性引物是通过已知在特定繁殖组织类型中特异性表达的其同源基因选择。特别关注的基因为在特定繁殖组织中以高水平表达的基因，其通常指示对应启动子的繁殖优选活性。表达序列标签(EST)提供另一基因特异性引物来源。EST是存在于给定文库中的对应mRNA的cDNA片段。可电子搜寻任何植物EST数据库以发现与已知在所需组织类型中特异性表达的基因的区段相同的EST("计算机筛选(insilicoscreening)")。因此，这些EST将提供基因特异性引物以在给定基因组文库中扩增对应基因的启动子。经扩增的基因启动子无需来自获得EST数据库的相同物种。所需要的只是EST与所关注的基因启动子具有足够的序列相似性以充当所述基因的目标区段PCR扩增的引物。另一鉴别组织特异性启动子的方法是检测在一种组织类型中表达而在另一种中不表达的mRNA(暗示其是从组织特异性启动子转录)。举例来说，可在此基础上通过消减杂交(subtractivehybridization)来辨识mRNA群体。一种此类适当消减杂交技术为Clontech所述的PCR-Select。另外，可通过具有放射性标记探针的植物组织薄片的原位杂交来确定组织特异性mRNA的分布。随后，使用对特定组织类型放射性染色的探针以通过基因组文库的Southern分析使用下文所述的方法检测与mRNA有关的启动子。所有上文所提及的技术都需要由所关注的组织(在这一情况下为繁殖组织)制备mRNA文库。cDNA文库可由从木本植物种类分离的繁殖组织制得。举例来说，可从辐射松和火炬松分离雄芽(malebud)和雌芽。简单说来，使用标准技术分离全部RNA，且随后分离poly(A)RNA并进行反转录以构筑繁殖优选组织的cDNA文库。可使用StrategenecDNA合成和GigapakIIGoldTM包装试剂盒在XZAP-XR载体中构筑cDNA文库。接着，可使用基因特异性探针和识别启动子5'端序列的引物通过PCR从所述cDNA文库中分离繁殖特异性启动子。可通过上述计算机方法或(如果己知)基于mRNA序列通过设计特异性探针获得基因特异性探针。而且，可合成与所需目标基因的5'UTR互补的引物。或者，可由所编码的蛋白质的部分氨基酸序列设计引物，即所谓的简并引物。分离所关注的启动子后，可使用各种方法表征其组织特异性表达模式和启动子强度。一种常用方法是使启动子可操作地连接到易于分析的报告基因。举例来说，已使繁殖优选启动子可操作地连接到编码P-葡糖苷酸酶(GUS)的基因。Lacombe等人，PlantJ.23:663-76(2000)。可使用众所周知的方法制得适当的表达构筑体。植物的转化可通过包括农杆菌介导的转化的多种适当技术中的任一种实现，如美国专利第6，051，757号中所述。此项技术中已知转化树的其它方法，如美国专利第5,681,730号中所例示，所述专利公开加速的裸子植物体细胞胚粒子转化方法。其它转化方法包括微弹轰击(Klein等人，Biotechnology6:559-63(1988)):电穿孔(Dhalluin等人，PlantCell4:1495-1505(1992));和聚乙二醇处理(Golovkin等人，PlantSci.90:41-52(1993))。此外，美国专利第6,187,994号中公开重组酶辅助的将表达构筑体插入到植物基因组内的特异性、选择性位点中。上文所提及的所有专利和公开案都以引用的方式并入本文中。可通过任何适当的方法将本发明的DNA分子插入到植物基因组中。适当的植物转化载体包括得自根癌农杆菌的Ti质粒的载体，以及例如Herrera-Estrella等人，Nature303:209(1983)、BevanNucleicAcidsRes.12(22):8711-8721(1984)、Klee等人，Bio/Technology3(7):637-642(1985)和欧洲专利公开案120,516所公开的载体。除得自农杆菌的Ti或诱根(root-inducing)(Ri)质粒的植物转化载体外，还可使用其它方法将本发明的DNA构筑体插入到植物细胞中。所述方法可涉及(例如)使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学制品、通过微弹轰击传递游离DNA和使用病毒或花粉进行转化。也可将DNA插入到叶绿体基因组中(Daniell等人，NatureBiotechnology16:345-348(1998))。当获得适量含有所关注的核酸的细胞(或原生质体)时，使所述细胞(或原生质体)再生成为整个植物。有关再生步骤的方法的选择并不严格，且适当方案可用于来自下述物质的宿主豆科(Leguminosae)(紫花苜蓿、大豆、苜蓿等)、伞形科(Umbelliferae)(胡萝卜、芹菜、防风草)、十字花科(Cmciferae)(甘蓝、萝卜、卡诺拉(canola)/油菜籽等)、葫戸科(Cucurbitaceae)(甜瓜和黄瓜)、禾本科(Gramineae)(小麦、大麦、稻子、玉米等)、茄科(Solanaceae)(马铃薯、烟草、蕃茄、胡椒)、各种繁殖作物(诸如向日葵)和坚果树(nut-bearingtree)(诸如杏树、腰果树、胡桃和美洲山核桃树(pecan))。例如，参看Ammirato等人，(1984)HandbookofPlantCellCulture-CropSpecies.MacmillanPubl.Co.;Fromm，M.,(1990)UCLASymposiumonMolecularStrategiesforCropImprovement,1990年4月16-22曰，Keystone,CO.;Vasil等人，Bio/Technology8:429-434(1990);Vasil等人，Bio/Technology10:667-674(1992);Hayashimoto等人，PlantPhysiol.93:857-863(1990);禾QDatta等人，(1990)。包含启动子和报告基因的载体包括选择经所述载体成功转化的植物细胞的机制，其可为(例如)卡那霉素抗性。转化体中GUS基因的存在可使用GUS特异性PCR引物(Clontech,PaloAlto)通过PCR方法确认。经转化植物细胞后代中卡那霉素抗性的隔离可与Southern分析组合使用以测定停泊己稳定插入的载体的位点数。随后，由报告基因表达的数量推断启动子表达的时间和空间模式，如Jefferson等人，EMBOJ.6:3卯1-07(1987)中所述。一般说来，GUS的表达是以组织化学方法在植物组织薄片中测定，所述植物组织薄片首先在90%丙酮中且随后在含有GUS底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-(3-d-葡糖醛酸(X-Gluc)的缓冲溶液中固定。GUS表达产物的存在是通过与X-Gluc的比色反应指示。举例来说，可通过特异性结合繁殖组织中的转录因子的调控元件的存在使繁殖特异性表达能够进行。繁殖特异性调控元件与繁殖优选转录因子之间的相互作用视调控元件碱基对分组与转录因子的氨基酸残基之间的对准而定。同样，例如，可通过特异性结合绒毡层组织中的转录因子的调控元件的存在使绒毡层特异性表达能够进行。可以其它碱基对取代不与所结合的转录因子相互作用的碱基对，同时保持调控元件特异性结合组织特异性转录因子的全部能力。将启动子鉴定为组织优选或组织特异性启动子后，可使用各种方法鉴别和表征影响组织优选或组织特异性启动子活性的调控元件。在一种方法中，在5'端顺次截断启动子区，并使一连串经截断的启动子各自可操作地连接到报告基因。当缺失调控元件时，通过报告基因组织特异性表达的损失来推断对启动子活性的影响。另外，可将假定的调控元件插入到含有诸如CaMV35S最小启动子的最小启动子(Keller等人，PlantMol.Biol.26:747-56)的表达构筑体中，以确定所述假定调控元件是否赋予组织特异性表达。最小启动子仅含有启动子活性绝对需要的元件，诸如RNA聚合酶结合位点。阐明假定调控元件的其它实例是由有关同等地调控编码1-苯基-丙氨酸脱氨酶(PAL)和4-香豆素辅酶A接合酶(4CL)的基因转录的组织特异性调控元件的研究提供。Hatton等人，PlantJ.7:859-76(1995);Leyva等人，PlantCell4:263-71(1992);Hauffe等人，PlantJ.4:235-53(1993);Neustaedter等人，PlantJ.18:77-88(1999),所有文献都以引用的方式并入本文中。本发欲^动7游^/^丝变^,或/f虔本发明启动子的其它变异体或片段为具有散布于整个序列中的修饰的变异体或片段。如本文所使用，功能性变异体或片段为具有与参考核酸具有至少约70%同一性的核酸序列但仍使编码产物能够组织特异性表达的核酸。功能性变异体的组织特异性或优选必须针对与参考核酸相同的组织。然而，即使所述功能性变异体不与参考核酸一样具有优先选择性或特异性，仍认为所述变异体为如本文所使用的功能性变异体。在一实施例中，功能性变异体或片段的序列与参考核酸具有至少约75%同一性。在其它实施例中，功能性变异体或片段的序列与参考核酸具有至少约80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。可通过从5'端相继缺失残基或从3'端缺失5'UTR序列而进行能够产生功能性变异体的修饰。或者，可对内部残基进行修饰。不影响启动子区功能的修饰很可能为不影响转录因子结合的修饰。本发明所涵盖的修饰还包括以本发明启动子等位基因变异体(allelicvariant)形式天然存在的修饰。劍造本发敏游提虔游方兹可通过使用众所周知的合成技术、标准重组方法、纯化技术或其组合获得本发明的核酸。举例来说，可使用固相亚磷酰胺三酯方法(Beaucage等人，Tetra.Letts.22:1859-1862(1981))、自动化合成器(VanDevanter等人，NucleicAcidsRes.12:6159-6168(1984))或美国专利第4,458,066号的固体载体方法通过直接化学合成来制备本发明的经分离聚核苷酸。化学合成一般产生单链寡核苷酸，其可通过与互补序列杂交或通过使用单链作为模板进行的聚合反应而转变成双链寡核苷酸。同样，可通过接合较短序列获得较长序列。或者，可使用相互引发的寡核苷酸通过重组方法获得本发明的核酸。例如，参看Ausubel等人，(编车葺)，CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons,Inc.1990)。同样，参看Wosnick等人，Gene60:115(1987);和Ausubel等人，(编辑)，ShortProtocolsinMolecularBiology,第3版，(JohnWiley&Sons,Inc.1995)。己确立的使用聚合酶链反应的技术提供合成至少2千碱基长的聚核苷酸的能力。Adang等人，PlantMol.Biol.21:1131(1993);Bambot等人，PCRMethodsandApplications2:266(1993);Dillon等人，"UseofthePolymeraseChainReactionfortheRapidConstructionofSyntheticGenes,"inMethodsInMolecularBiology,第15巻PCRProtocols:CurrentMethodsAndApplications,White(编辑)，第263-268页，(HumanaPress,Inc.1993);Holowachuk等人，PCRMethodsAppl.4:299(1995)。伊财发鐘凝膽方法
技术领域：
：本发明的核酸可用于变化植物的特性。可使核酸可操作地连接到所关注的基因以增加繁殖组织中所见的分子的含量。另外，所关注的基因可抑制繁殖发育，由此赋予植物不育性。所述经操纵的表达的一个主要目标为繁殖发育。出于上述原因，通过基因去除所实现对繁殖发育的调控相当值得关注。举例来说，已在绒毡层优选启动子的控制下使用细胞毒素baraase分子来调控繁殖发育。欧洲专利公开案344,029。举例来说，可使用具有降低的RNA酶活性的突变体barnase基因调控繁殖发育。在一实施例中，可使突变体barnase基因可操作地连接到启动子，从而使barnase基因的表达可对营养组织造成极低损害或无损害，而突变体barnase可为繁殖去除提供适当的RNA酶活性。参考下列实例由此一般描述将更易于理解本发明，所述实例是借助说明提供且不打算限制本发明。实例实例1分离繁殖优选启动子可从基因组文库和cDNA文库分离繁殖优选植物启动子。使用繁殖优选启动子序列作为探针，可分离假定的繁殖优选启动子序列。举例来说，可将来自辐射松的AGAMOUS(AG)启动子用作鉴别其它繁殖优选启动子序列的探针。举例来说，基因组DNA是从火炬松的雄芽分离的。分离雄芽DNA后，将辐射松AG1序列用作筛选经分离的雄芽基因组DNA的探针。使用基于PCR的筛选方法，分离出两种假定的火炬松AG启动子序列，称为LPAG1(SEQIDNO:1)禾nLPAG2(SEQIDNO:2)。每一经克隆的LPAG启动子都为约1400bp，包括600bp5'未翻译区，其含有139bpLPAG1或LPAG2基因的第一个内含子。使用"基因组步行(GenomeWalker)"试剂盒(Clontech，PaloAlto,CA)来克隆启动子。这是一种基于PCR的方法，其需要构筑四种PCR引物，其中两种必须具有基因特异性。一般将基因特异性引物设计到基因的5'UTR内。扩增片段且随后将其克隆到GUS报告基因之前具T尾(T-tailed)的载体中。实例2确定启动子组织特异性的方法如实例1所述鉴别并克隆启动子后，使启动子可操作地连接到报告基因以确定启动子具有活性的组织的类型。出于此目的，通过电穿孔将含有本发明启动子的构筑体转化到根癌农杆菌中。简单说来，将40pl稀AgL-1感受态细胞放置到冰上，并使其与约10ng含有启动子序列的pART27载体接触。在以下参数下进行电穿孔电阻=129欧姆充电电压=1.44kV电场强度=14.4kV/cm脉冲持续时间=5.0ms。电穿孔后，加入400^YEP液体培养基，并在室温下使细胞恢复1小时。随后，在6000rpm下使细胞离心3min，并将其再悬浮到约50piYEP中。将细胞样本展布到YEPKan50/Rif50板的表面上，用石蜡膜(parafilm)密封，并在29°C下培育2天供菌落生长。通过农杆菌介导的叶组织转化，用所关注的构筑体转化烟草(Nicotianatabacum)植物(Burow等人，PlantMol.Biol.Rep.8:124-139,1990)。随后，分析经成功转化的植物中可操作地连接的报告基因的表达。将叶、杆、根和繁殖区浸到染色溶液(50mMNaPO4pH7.2、0.5%TritonX-IOO、lmMX-葡糖苷酸、放线菌酮盐(cycloheximidesalt)(Ducheffa))中。施加真空两次历时5min以使染色溶液渗透组织。随后，在37'C下震荡组织整夜以使颜色发展。在三或四个时间点时检査组织以检查染色发展，且如果样本展示出早期的发展，那么用70%乙醇使一片组织脱去染色。如表1所示，GUS定位证实所公开的经分离的核苷酸序列使报告基因优先在诸如絨毡层的繁殖组织中表达。如实例6所示，当腋芽(axilliarybud)的营养生长受到抑制且营养芽和繁殖芽的转变极快时，在初生花序(pnmaryinflorescence)存在下，预期繁殖优选启动子在营养茎尖(vegetativetip)中表达。表l:植株原位法(&p/a/ito)GUS繁殖表达<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>如下文更详细地描述，"PRMC2"启动子构筑体包含可操作地连接到barnase突变体的来自辐射松的繁殖优选启动子，尤其PrMC2.400-l禾nPrMC2.400-3的H102E。在经PrMC2.400启动子转化的烟草花药中尚未观察到GUS表达。因此，克隆同框(in-frame)PrMC2.400启动子以供去除构筑体中使用并将其用于上述实验中。实例3使用繁殖特异性启动子的方法发现具有适当组织特异性和发育模式表达的启动子后，可使用这一启动子来调控转基因植物中的所需特性。在--实施例中，将绒毡层优选的启动子用于调控植物的繁殖发育。在本实例中，使本发明的绒毡层优选启动子可操作地连接到编码细胞毒素蛋白质的基因。举例来说，可使绒毡层优选启动子可操作地连接到编码barnase的基因。繁殖优选组织(诸如绒毡层)中barnase的表达可导致花粉去除。欧洲专利公开案344,1990。为构筑具有已去除的雄性繁殖发育的转基因植物，使barnasecDNA片段以适当方向可操作地连接到本发明的繁殖特异性启动子和胭脂碱合成酶3'终止子。将整个构筑体作为限制性片段插入到二元载体pBI101.1(Clontech，PaloAlto,CA)中。对于烟草或白杨转化来说，分别使载体电穿孔到根癌农杆菌菌株LBA4404或C58pMP90。一般参看No等人，PlantScience160:77-86(2000)。根据Leple等人，PlantCellRep.11:137-141(1992)的程序，将如上文所述的烟草叶圆片或白杨杆断片浸入到如上文所述的农杆菌培养物中。测试抗卡那霉素转化体的活性，通过Southern分析来测定转基因拷贝的数量，且使适当的转化体生根并将其转移到温室中。实例4制造并选择已减弱的细胞毒素酶的方法万扁履￡7_G浙脸廳ef70(5S游#威通过随机PCR突变发生获得barnase突变体F106S和E73G。使PrAG启动子可操作地连接到野生型barnase编码区，且进行三次PCR反应，从而以barnase翻译密码子置换PrAG翻译起始密码子ATG。在第一次PCR中，使5'引物PrAGKpn(5'-GGTTTGGTACCTAACTTGCC-3'，SEQIDNO:27)与PrAG启动子的-199位至-179位关于其翻译起始ATG位置退火，而3'引物PrAG-7:(5'-GTGTTGATAACCTGTGCCATGATTTGTACACAAAATTTCCG-3'，SEQIDNO:28)与包括翻译起始ATG的-21至+3位退火。PrAG-7引物具有与barnase编码区5'互补的额外18个碱基。PCR混合物含有50ng模板DNA(pWVCZ3DNA)、200dNTP、1.5mMMgCl2和0.5^1TaqDNA聚合酶(PerkinElmer)。在95°C下使DNA变性20秒，在55i:下使其再退火30秒，并在72'C下培育60秒。将这一PCR循环重复25次。PCR后，凝胶纯化220bp产物。在第二次PCR中，使5'引物PrAG-8:29)与barnase编码区的5'退火，且这一引物具有与PrAG启动子3'互补的21个额外碱基。使3'引物3Barn(GGTTCTCGAGTTTCACGTTAACTGGCTAG，SEQIDNO:30)与barnaseDNA的3'退火，并携带供克隆的SacI位点。PCR混合物含有50ng模板DNA(pWVR14)、200dNTP、1.5mMMgCU0.5jiilTaqDNA聚合酶(PerkinElmer)。在95。C下使DNA变性20秒，在55'C下使其再退火30秒，并在72°C下培育60秒。将这一PCR循环重复25次。PCR后，凝胶纯化462bp产物。在第三次PCR中，5'引物为PrAGKpn且3'引物为3Barn，而DNA模板为等量的第一次PCR与第二次PCR产物(各自约40ng)的混合物。第三次PCR的扩增产物为640bp，其为PrAG的3'与barnase编码区之间的融合。第三次PCR后，用KpnI和SacI消化PCR片段，并使其与已携带PrAG启动子的质粒(pUC19)接合，从而在接合后通过全长PrAG启动子驱动barnase。通过电穿孔将接合混合物引入大肠杆菌中，并使经转化的菌落在含有75pg/ml氨比西林的LB琼脂上生长。从两个菌落中提取质粒，且以限制性酶消化来确认PrAG::baraase插入物的存在。对质粒DNA测序以确认其在barnase编码区中都具有突变。已认识到，在LB培养板上生长的所有菌落都含有突变体形式的baraase，且大部分突变都已废除baraase活性。然而，如LB培养板上较小尺寸的菌落所指示，部分突变会降低bamase的活性。选择约100个菌落，并将其培育到含有75pg/ml氨比西林的1mlLB液体中。在37'C下培养整夜后，比较培养物中的细胞密度，且选择5份具有显著较低细胞密度的培养物。低细胞密度指示barnase具有活性，但具有小得多的毒性。从5份大肠杆菌培养物中纯化质粒，并将其再引入到大肠杆菌中以确认所引入的质粒确实在LB琼脂板上产生较小尺寸的菌落，表明质粒具有减弱的baraase活性。重复将质粒再引入到大肠杆菌中三次。对已确认的质粒测序，且结果表明，从大肠杆菌培养物提取的质粒29-S在barnase编码区73位处谷氨酸的密码子中含有单核苷酸取代(A—G),导致谷氨酸变为甘氨酸。这一barnase突变体称为barnaseE73G(SEQIDNO.11)。从大肠杆菌培养物提取的质粒43-S在barnase编码区106位处苯丙氨酸的密码子中含有单核苷酸取代(T—C)，导致苯丙氨酸变为丝氨酸。这一barnase突变体称为barnaseF106S(SEQIDNO.12)。￡謹嫌f7船力W为分析F106S毒性，如上文实例2所述，用具有PrAG启动子的构筑体转化烟草植物，所述启动子可操作地连接到编码突变体barnaseF106S的基因。由于突变体barnaseF106S的表达是致死的，所以并无可见的烟草转化体产生。这些结果表明，需要例如可诱导雄性不育性而对营养生长无不利影响的己减弱的barnase。5ama^￡73G分桥基于大肠杆菌中毒性筛选的结果，选择barnase突变体E73G用于繁殖去除。大肠杆菌中barnaseE73G的表达导致低毒性水平。具体说来，barnaseE73G抑制大肠杆菌在LB液体培养基中和LB固体板上的生长。尽管不能从这一生物筛选获得barnase突变体降低的RNA酶活性(毒性)的值，但这些结果仍表明E73G具有减弱的RNA酶活性。有关barnaseE73G中barnase活性减弱的另一证据可见于barnaseE73G与F106S之间的比较研究。在比较中，barnaseF106S引起比barnaseE73G显著高的大肠杆菌毒性。这些结果表明，barnaseF106S具有比barnaseE73G高的RNA酶活性。基于有关相关酶barnase中的对应突变具有约2%天然酶活性的报告，选择barnaseH102E突变。Yakovlev等人，FEBSLett.354:305-306(1994)。如下文实例5中所述，barnaseH102E具有减弱的活性。在这一突变体中，组氨酸102的密码子经谷氨酸密码子取代。Barnase区段的定向突变发生利用包含野生型barnase编码区的现存质粒pWVR14。Barnase的这一先验克隆使用引物BAR5NCO(5'-TGACAACCATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGAC-3',SEQIDNO:31)和BAR3MFE(5'-AAAGTGCAATTGACCGATCAGAGTTTGAAG匿3'，SEQIDNO:32)以扩增质粒pMT416的barnase盒的整个编码区。Hartley,R.W.J.Mol.Biol.202:913-915(1988)。用Ncol消化经扩增的片段，并将其克隆到已制备的具有一个NcoI端和一个平端的载体中。所得质粒pWVR14将barnase区段放到启动子和SEPALLATA1基因(SEPl，以前称为AGL2)5'-UTR的相邻处，且突变发生程序利用所述启动子序列。使用引物AGL2PB(5'-TTTCACAACCTCCACACACTT-3'，SEQIDNO:33)禾口BARH2E(5'-GTAAAGGTCTGATACTCGTCCGTTG-3'，SEQIDNO:34)来扩增编码区的5'部分和邻接启动子区段。使用引物BAR5NCO和BAR3MFE扩增野生型barnase盒。扩增后，使用凝胶电泳和QIAEX凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)来纯化分离片段和引物与PCR试齐U。使约100ng每一片段与50|il反应物中的lxPerkinElmerTaq缓冲液、1.6mMMgCl2、0.10mM各dNTP和0.5piPerkinElmerTaqDNA聚合酶组合，且重复使混合物在95。C下变性、在50'C下再退火和在72'C下培育(5个循环)，以便使包含一部分SEP1启动子和完整barnase编码区的0.75kb片段延长。将10延长反应物加入到50含有20pmol引物AGL2PB和BAR3MFE的每一者、lxPCR缓冲液、1.6mMMgCl2、0.250mM各dNTP和0.5^1TaqDNA聚合酶中，并且再执行七次循环，从而进一步扩增所述0.75kb的片段。用Ncol消化片段，并对barnase区段进行凝胶纯化，且用Ncol和平端将其接合到载体中。通过序列分析来验证正确的突变。在诸如组装pWVR220的后续工作中，使用引物BAR5NCO和BAR3SAC(5'-GAAGAAGAGCTCTTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3'，SEQIDNO:35)扩增全长barnaseH102E片段，用Ncol和Sacl消化并加以纯化。由于需要在翻译起始密码子处需要具有Ncol位点，所以引物BAR5NCO中包括ATG后紧接着的额外丙氨酸密码子。这导致实际最终编码区中密码子103处His成为Glu的突变。基于有关相关酶barnase中的对应突变具有约20%天然酶活性的报告，选择barnaseK27A突变。Yakovlev等人，FEBSLett.354:305-306(1994)。另一报告表明，barnaseK27A突变体相比天然酶具有降低的活性。Mossakowska等人，Biochemistry28:3843-3850(1989)。变化barnase编码区，从而使赖氨酸27的密码子经丙氨酸密码子取代。使用PCR同日寸实现对barnase区段的扩增和定向突变。使用引物BAR5NCO(5'-TGACAACCATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGAC匿3'，SEQIDNO:31)和BARK27AR(5'-TGCTTCTGATGCTGTAATGTAATTATCAG-3'，SEQIDNO:36)来扩增编码区的5'部分，且使用引物BARK27AF(5'-AATTACATTACAGCATCAGAAGCACAAG-3'，SEQIDNO:37)禾卩BAR3SAC(5'-GAAGAAGAGCTCTTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3'，SEQIDNO:35)来扩增质粒pMT416barnase盒编码区的3'部分。扩增后，纯化分离所述片段与引物和PCR试剂，且随后将其组合。使约100ng每一片段与25^反应物中的lxStmtagene高盐缓冲液、0.175mM各dNTP和0.25piTaqPlusLong组合，且重复使混合物在95。C下变性、在50'C下再退火和在72'C下培育(5个循环)，以便使全部编码区延长。将延长反应物加入到75jal含有20pmol引物BAR5NCO和BAR3SAC的每一者、lxStratagene高盐缓冲液、0.175mM各dNTP和0.75(ilTaqPlusLong中，并且再执行十五次循环，从而进一步扩增全长baraaseK27A片段。用Ncol和Sacl消化所得全长片段，并加以纯化。经突变的编码序列陈述在SEQIDNO:8中。如上所述，引物BAR5NCO中ATG后紧接着包括额外丙氨酸密码子。这导致实际最终编码区中密码子28处Lys成为AIa的突变。实例5大肠杆菌中barnase突变体的毒性分析通过PCR在PrAG启动子的3'端融合barnaseDNA，且将所得PCR片段克隆到pUC19中，并将其引入到大肠杆菌中。在37摄氏度下在补充有80叫/ml氨比西林的LB琼脂上生长整夜(约16小时)后，选择单个菌落，并在1ml含有氨比西林的LB液体中培育。培育整夜后，选择正缓慢生长的大肠杆菌培养物，并提取质粒。将经纯化的质粒再引入到大肠杆菌中，且在37摄氏度下培育整夜后在LB琼脂上获得单个菌落。测量菌落直径，并将其与对照物(由PrAG启动子驱动的具有barnaseH102Y插入物的pUC19)相比较。具有barnase突变体的单个菌落的直径为从将质粒引入大肠杆菌中的步骤起重复的三个独立实验的平均值。通过将所述单个菌落的直径与对照菌落的直径相比较来确定bamase突变体的毒性。如下表2所示，大直径菌落指示无毒性，而小直径菌落表明强毒性。表2:大肠杆菌中Barnase突变体的毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>*BarnaseH102Y不具有所报告的RNA酶生物活性。实例6ALAPG启动子的组织优选表达通过实例1所述的程序鉴别和克隆启动子后，使启动子可操作地连接到报告基因以确定启动子具有活性的那些组织类型。为确定LPAG1和LPAG2启动子的组织特异性，如实例2所述，使每一启动子都可操作地连接到GUS报告基因，并将所得构筑体引入烟草植物中。箏^"浙在層Gt/S分析简单说来，为分析烟草中LPGA1启动子活性的GUS表达，从高度为约2到5mm的未成熟、幼花中移除萼片和花瓣。使用刀片垂直切下中间的心皮，且在37'C下对所得一半心皮(连有2-3片幼雄蕊)染色历时16小时以用于GUS活性分析。对来自每一转基因株的三朵单独花染色，且在70%乙醇中且且随后在95%乙醇中进行脱染色。妨〃/"游GfAS分桥分析与花相邻的幼叶的GUS表达。对于每一转基因株来说，将三片幼叶切成小正方形(9mm2)，并如上文关于萼片和花瓣所述，在37。C下染色16小时以供GUS活性分析，且随后脱染色。,养茎关游Gra分界从处于两个不同生长阶段的个别植物收集幼茎尖。第一生长阶段的分析涵盖收集烟草植物的茎尖，其中初生顶生花序(primaryterminalinflorescence)上30%的花已开放。在这一第一生长阶段分析具有初生顶生花序的茎尖。具有初生顶生花序的茎尖表示从初生杆与初生叶的横断面长出的腋生茎尖(axillaryshoottip)。具有初生顶生花序的每一茎尖为约10至15mm长。分析第二生长阶段涵盖收集移除初生顶生花序6天后的茎尖。这些茎尖不具有初生顶生花序，且表示从初生杆与初生叶的横断面长出的腋生茎尖。所收集的每一无初生顶生花序的茎尖都为约25至40mm长。移除茎尖周围大部分的幼叶，且仅使一到三片叶子与茎尖相连。从中间垂直切下分开的茎尖，且在37'C下对所得一半茎尖(仍连有1-3片叶)染色历时16小时以供GUS活性分析。从每一转基因株收集三个茎尖，并加以染色。如下表3所示，LPAG1启动子优先在雄蕊和心皮(繁殖组织)中具有活性且在叶(营养组织)中未展示活性。表3:转基因烟草中LPAG1活性的GUS表达分析<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>如上表3所示，移除初生顶生花序后，茎尖中LPAG1启动子活性降低。在初生花序存在下，腋芽的营养生长受抑制，且营养芽极快转变为繁殖芽。在一些情况下，当腋生枝仅10mm长时，出现花芽。在烟草的繁殖生长期间，养分获取和激素产生会诱导腋生枝中花基因的表达。移除初生顶生花序使烟草植物恢复营养生长，且腋芽的生长不再经历由顶生花强加的抑制。己观察到，移除初生顶生花序后，当腋生枝为40mm长时，腋芽生长加快，且不存在花芽。因此，在顶生花存在下，腋生枝的分生组织已转变成花分生组织，或中途朝向花分生组织转变，其中诸如LEAFY和AGAMOUS的花基因的表达开启且LPAG1启动子也开启。移除顶生花使腋芽恢复营养生长，且腋生枝分生组织中花基因的表达关闭，且因此LPAG1启动子活性也可能关闭。实例6BLPAGl启动子的缺失分析可使用启动子缺失分析来确定启动子序列内的最小启动子和调控元件。使每一启动子缺失可操作地连接到报告基因，并分析启动子-报告基因构筑体的表达概况。举例来说，连续缺失LPAG1启动子(SEQIDNO.1)。简单说来，从LPAG1启动子序列的5'端得到5个连续缺失。每一连续缺失都缺失约160bp,共800bp缺失。以下为有关LPAG1启动子缺失的初步结果的摘要。将5个连续缺失构筑体(称为LPAGldl-LPAGld5)引入到松树和烟草中。由于缺失是从LPAG1启动子序列的5'端得到，估计LPAGld5缺失构筑体将切开LPAG1基因的5'未翻译区，且因此LPAG1启动子序列将不在LPAGld5构筑体中。用启动子缺失构筑体转化松树和烟草植物后，如实例2所述，分析经转化胼胝体的LPAG1启动子活性。如实例5所述确定GUS表达分析。LPAG1启动子缺失实验的结果概括于下表4中。表4:LPAG1的启动子缺失分析<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>基于表4所示的GUS表达概况，结果清楚地表明存在于LPAGld3中但不存在于LPAGld4中的核苷酸序列(约150bp)对于在烟草花雄蕊和心皮中具活性的LPAGl启动子至关重要，但由于LPAGld4在胼胝体中仍具有类似GUS活性，所以相同序列对于在松树胼胝体中具活性的LPAGl启动子不太重要，如GUS染色和MUG分析所示。实例7使用具有LPAGl和PrAG启动子的构筑体去除松树雄球花和雌球花的方法基于实例6表4所示的结果，可将LPAG1和PrAG启动子和其启动子缺失用于去除松树中的雄球花和雌球花。举例来说，去除构筑体可具有可操作地连接到编码barnase的基因的LPAG1启动子，而PrAG或LPAGld4启动子可操作地连接到编码barstar(barnase抑制剂)的基因。如上文实例6中所示，LPAG1启动子在松球和胚中具活性，而PrAG或LPAGd4启动子仅在松树胚中具活性。通过在启动子(PrAG)下放置在松球中展示极低活性的编码barstar的基因，由其它启动子(LPAG)产生的barnase毒性可有效去除雄球花和雌球花。另一方面，松树胚中两个启动子的相似活性水平会产生相似量的barnase和barstar,且因此胚中的barnase毒性得以有效中和，导致松树胚性愈伤组织和胚的转化和再生。实例2中所述的转化方案后，分析松树愈伤组织的LPAG1表达。实例8辐射松AO4M0C/S启动子的分析如实例1所述，可从诸如辐射松或巨桉的树种类中鉴别繁殖优选启动子并进行克隆。PrAG启动子为来自辐射松的AGAMOUS启动子。PrAG启动子具有约1400bp的长度，包括5'-未翻译区。PrAG启动子公开于WO00/55172中，所述专利以引用的方式并入本文中。为确定PrAG是否能够繁殖优选表达，使PrAG启动子可操作地连接到具有内含子的GUS报告基因。如实例2中所述，将所得PrAG-GUS启动子构筑体引入烟草植物中。分析烟草组织的GUS表达，且表5中概括PrAG启动子活性。表5:PrAG启动子活性的GUS分析<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>尽管通过酶分析未检测到叶、花瓣、雄蕊和心皮组织中的GUS表达，但使用更敏感的方法(诸如用poly(A+)RNA进行的RNA酶保护分析(RNaseProtectionAssay))可检测到花瓣、雄蕊和心皮组织中的GUS表达。实例9花特异性增强子增加PrAG启动子活性如实例8所述，PrAG启动子使繁殖优选启动子在烟草中极弱地表达。已展示，拟南芥AGAMOUS基因含有存在于AG基因的第二个内含子中的花特异性增强子(AtAGenh)。Sieburth,L.E.和Meye薩itz，E.M.ThePlantCell9,355-365(1997)。Busch,M.A.,Bomblies,K.和Weigel,D.Science285，585-587(1999)。Deyholos，M.K.和Sieburth,L.E.ThePlantCell12:1799-1810(2000)。AtAGenh增强子元件可优先在被子植物花的繁殖组织屮上调PrAG启动子活性是可能的。为确定AtAGenh是否增强繁殖组织中的PrAG启动子活性，分离拟南芥AG(2750bp)的第二个内含子并使其与可操作地连接到具有内含子((AtAGenh)PrAG::GUSIN)的GUS报告基因的PrAG启动子的5'端融合，并将所得构筑体(pWVCZ20，参看图2)引入烟草中。烟草转化后，收集烟草组织，并分析其GUS表达。如下表6中所示，GUS染色揭示，AtAGenh确实增强主要在雄蕊和心皮中的PrAG启动子活性，且也在花瓣中观察到部分增加。在萼片、叶和营养茎尖中未观察到GUS染色。表6:AfAGenh增强PrAG启动子活性<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>实例10使用繁殖优选启动子::突变体barnase构筑体用于繁殖去除而不干扰营养生长如上文实例4中所述，可使用各种方法产生具有减弱的细胞毒素作用的突变体细胞毒素基因。通过降低barnase酶的毒性作用，可将barnase用于繁殖去除，而不危及植物的营养生长。而且，可操作地连接到减弱的barnase的繁殖优选启动子组合提供一种供繁殖去除而不破坏营养生长的方式。举例来说，分别使突变体barnaseE73G与PrAG融合以建立pWVCZ23(图3),与(AtAGenh)PrAG融合以建立pWVCZ24(图4),并将所得构筑体引入烟草中。转化后，分析烟草植物，并将结果展示于下表7中。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>如表7所示，68呢经(AtAGenh)PrAG::E73G转化的烟草植物具有不育性繁殖表型，即许多经转化植物不产生具生育力的花粉，也不产生具生育力的种子。同样，10%经PrAG::E73G转化的植物不产生具生育力的花粉和种子。有趣的是，以任一构筑体转化都不危及营养生长。所得结果清楚地证实，去除盒(AtAGenh)PrAG::E73G可产生雄性不育性和雌性不育性烟草，且此盒能够对其它被子植物(包括被子植物和裸子植物)产生类似的去除作用。实例11使用温度敏感型Barnase去除繁殖原基而不干扰营养生长Barnase是一种经良好表征的酶，且已鉴定出多种突变体。具体说来，己鉴定出具有变化的稳定性和/或毒性的banrnse突变体。可能需要温度敏感型barnase来去除繁殖原基而不影响营养生长。举例来说，可将热敏感型baraase用于繁殖去除。举例来说，在夏季(高温)，当出现大量营养生长时，热敏感型barnase的表达可具有极低毒性作用，但在冬天或低温产生繁殖芽时可具有毒性。可使用诸如PrMC2(SEQIDN04或16)的繁殖优选启动子使营养组织中热敏感型barnase的表达减到最低。实例12Barstar中和转基因松树愈伤组织和再生胚中的barnase毒性Barstar是一种天然的barnase抑制剂，且已将其用于保护非目标组织免受baraase毒性影响和恢复植物的繁殖力。BealsT.P.禾口GoldbergR.B,PlantCell.9:9:1527-45(1997)。KuvshinovV等人，PlantSci.160:3:517-522(2001)。先前的实验证实，三种启动子LPAGl、PrAG和LPAGld4在松树愈伤组织和再生胚中具有相似的活性。LPAG1启动子在烟草花中具有高活性，而PrAG和LPAGld4启动子在烟草花中不展示活性或展示痕量活性，表明PrAG和LPAGld4启动子在被子植物或裸子植物繁殖组织中可能不具活性。因此，可使PrAG和LPAGld4启动子可操作地连接到中和barnase的细胞毒素作用的基因，诸如barstar，且启动子::barstar构筑体将靶向非繁殖组织。所述启动子::barstar构筑体(例如，PrAG::barstar)将保护营养组织免受有害barnase表达的影响。而且，建立具有可操作地连接到barnase的繁殖优选启动子和可操作地连接到barstar的非繁殖优选启动子的去除构筑体可能极为有益。举例说来，松球去除构筑体可具有驱动barnase的LPAG1启动子，而PrAG或LPAGld4启动子驱动barstar(诸如LPAG1::barnaseE73G/PrAG::barstar或LPAGl::barnaseE73G/LPAGld4::barstar)，且两个盒在一个骨架中。在松树转化期间，由松树愈伤组织和再生胚中的LPAG1活性引起的barnase毒性将由PrAG或LPAGld4启动子活性产生的barstar有效中和，且因此可平稳地进行转化。然而，在成熟转基因松树中，松球芽(pine-conebud)中由LPAGl启动子活性引起的barnase的存在将因barnase毒性和松球芽中barstar的缺乏而有效杀死松球。实例13同框PrMC2.400启动子片段的克隆如美国专利申请公开案20030101487中所述，鉴别并分离PrMC2.400启动子序列，所述专利以引用的方式并入本文。PrMC2.400序列具有与pWVR220和其它PrMC2构筑体中所使用的ATG不同框的ATG。尽管先前有关拟南芥的测试清楚表明GUS是由PrMC2.400启动子表达的，但在经PrMC2.400启动子转化的烟草花药中未观察到GUS表达。因此，克隆同框PrMC2.400以用于去除构筑体中。使用下述PCR引物，分离两种不同PrMC2.400启动子的序列。如下文所述，将两个PrMC2.400启动子克隆到表达载体中，以确保所述序列与可操作地连接的基因同框。在PrMC2.400启动子序列中尤其361、367和397位处存在若干个同框ATG。使用所述的反向引物，产生两种不同的PrMC2.400产物。PrMC2.400-l含有所有三个ATG;PrMC2.400-3仅含有第一个ATG。反向引物的5'端经磷酸化，因此其可与克隆载体中的适当位点平末端接合(blunt-ligated)。PrMC2-XG引物含有Xhol位点。使用高保真Taq聚合酶掺合物(TaqPlusLong,Stratagene)进行PCR。PCR后，凝胶纯化扩增产物且随后使用标准程序用Xhol进行消化。将每一产物克隆到中间载体中并测序。测序指示PrMC2.400-l序列与原始序列存在1个核苷酸的差异，即35位处存在"T"残基插入。将PrMC2.400-l和PrMC2.400-3序列克隆到表达载体中已确保所有ATG位点都与所关注的基因保持同框。PrMC2習XG(正向):5'匿GAAGAACTCGAGTAAAACATAATTTTGGCAGTAAAAAGTGA-3'(SEQIDNO:38)PrMC2-Rl(反向):5'-CATGTTCCCGTTTGATACCTGAATTTTG-3'(SEQIDNO:39)PrMC2-R3(反向)5'-CATAAATCTTCTAAAAACAGCAGAACTGAC-3'(SEQIDNO:40)PrMC2-XG+PrMC2-Rl:产生指定为PrMC2.400-l的3966(KNC)bp产物(SEQIDNO:5)PrMC2-XG+PrMC2-R3:产生指定为PrMC2.400-3的3603(KNC)bp产物(SEQIDNO:16)。实例14将同框PrMC2.400-l::突变体barnase克隆到二元载体中如实例17中所述，可使同框启动子PrMC2.400-l和PrMC2.400-3可操作地连接到所关注的基因以用于基因去除。举例说来，可使同框PrMC2.400-l启动子可操作地连接到减弱的barnase序列以用于繁殖去除。如实例4中所述，将K27A突变体barnase预先克隆到高拷贝载体pWVR63中。将PCR产生的片段PrMC2.400-l克隆到pWVR63中，所述pWVR63预先经Ncol消化，经绿豆核酸酶处理以产生平末端，随后经XhoI消化和凝胶纯化以分离载体片段。随后的中间质粒pWVR205现含有去除盒PrMC2.400-l::K27Abarnase::RNS2TER。接着，使用Kpnl和Apal将此盒亚克隆到二元载体中以产生pWVR216。如实例4中所述，预先将H102E突变体barnase克隆到高拷贝载体pWVR15中。为得到更便利的限制性酶末端以供克隆，使用PCR引物由pWVR15模板产生H102E。使用以下PCR引物产生突变体barnaseH102E:Agl2-PB:5'-TTTCACAACCTCCACACACTT-3'(SEOIDNO:33)Bar3Sac:5'-GAAGAAGAGCTCTTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3'(SEOIDNO:35)。使用高保真Taq聚合酶掺合物(TaqPlusLong，Strategene)进行PCR。使用标准的三步骤PCR方法。凝胶纯化PCR反应物，且随后用Ncol和Sacl进行消化。凝胶纯化限制性消化物，并分离片段且浓縮。将这一经纯化PCR片段克隆到预先经Ncol和Sacl消化的中间载体中，产生构筑体pWVR218。对这一构筑体测序以确保正确的突变体baraase序列。随后，将PCR产生的片段PrMC2.400-l克隆到pWVR218中，所述pWVR218预先经Ncol消化，经绿豆核酸酶处理以产生平末端，随后经Xhol消化和凝胶纯化以分离载体片段。随后的质粒pWVR219现含有去除盒PrMC2.400-l::H102Ebarnase::RNS2TER。对这一构筑体测序以确保正确的启动子序列和启动子:基因联接。接着，使用Kpnl和Apal将此盒亚克隆到二元载体中以产生pWVR220。如实例4中所示，预先将E73G突变体barnase克隆到高拷贝载体中。为得到更便利的限制性酶末端以供克隆，使用PCR引物由质粒模板产生E73G序列。使用以下PCR引物产生突变体barnaseE73G:Bar5Nco:5'-TGACAACCATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGAC習3'(SEOIDNO:MlBar3Sac:5'匿GAAGAAGAGCTCTTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3'(SEOIDNO:Ml。使用高保真Taq聚合酶掺合物(TaqPlusLong,Strategene)进行PCR。使用标准的三步骤PCR方法。凝胶纯化PCR反应物，且随后用Ncol和Sacl进行消化。凝胶纯化限制性消化物，并分离片段且浓缩。将这一经纯化PCR片段克隆到预先经NcoI和Sacl消化的中间载体中，产生构筑体pWVR230。对这一构筑体测序以确保正确的突变体barnase序列。随后，将PCR产生的片段PrMC2.400-l克隆到pWVR230中，所述pWVR230预先经NcoI消化，经绿豆核酸酶处理以产生平末端，随后经Xhol消化和凝胶纯化以分离载体片段。随后的质粒pWVR231现含有去除盒PrMC2.400-I::E73Gbarnase::RNS2TER。对这一构筑体测序以确保正确的启动子序列和启动子:基因联接。接着，使用Kpnl和Apal将此盒亚克隆到二元载体中以产生pAGF232。GfAS抓裙尽管先前关于拟南芥的测试证实GUS是从原始PrMC2.400启动子表达的，但在经转化的烟草花药中未观察到染色。合成新的报告基因盒(参看下文)，从而使其匹配去除构筑体的框架。将PCR产生的片段PrMC2.400-1克隆到pWVR52中，所述pWVR52预先经Ncol消化，经绿豆核酸酶处理以产生平末端，随后经XhoI消化和凝胶纯化以分离载体片段。随后的质粒pWVR233现含有盒PrMC2.400-l::GUS::RNS2TER。对这一构筑体测序以确保正确的启动子序列和启动子:基因联接。接着，使用Kpnl和Apal将此盒亚克隆到二元载体中以产生pAGF234。实例15PrMC2.400-l:Barnase的植物原位表达通过电穿孔以二元载体pWVR216或pWVR220或pAGF232或pAGF234转化根癌农杆菌菌株GV2260。由农杆菌介导的烟草(Nicotianatabacum)转化制造转基因植物。在含有卡那霉素的培养基上选择转化体。通过PCR鉴别阳性转化体，将其转移到土壤中，并使其在标准温室条件下生长。分析植物的总营养生长速率、开花时间和雄性不育性。由PrMC2.400-l启动子驱动表达突变体barnase基因的植物展现出雄性不育表型。具体说来，转基因植物不产生花粉粒。这是以显微镜通过在复式光学显微镜下(compoundlightmicroscope)观察得到确认。另外，无花粉植物不产生果实蒴果(fruitcapsue)和种子。然而，当用野生型(wt)烟草花粉对植物进行异花授粉时，出现正常结实，表明雌性繁殖力未受影响。此外，这些异花授粉的苗种产生无花粉表型，表明转基因得以继承且后代中转基因的存在产生雄性不育植物。应注意，由PrMC2.400-l启动子驱动表达突变体barnase基因的烟草株具有相对于心皮降低的雄蕊高度。开花时间也有所延迟。易于相对于对照株由表达K27A和E73G的烟草株观察到营养生长的降低。所述营养生长的降低导致较小的植物和较慢的发育。表达H102E的植株展示出最小的营养影响标志，且在总体生长方面与对照株极其类似。营养生长降低可指示烟草组织中PrMC2.400启动子表达的"漏出程度(leakiness)"。为分析营养组织中PrMC2.400启动子的活性，对经PrMC2.400-l::GUS株转化的植株中幼叶组织、根和营养茎尖的GUS活性进行测试。使用发色底物X-GIuc以组织化学方法分析GUS活性。室温下，使组织中真空渗入X-Gluc历时1小时，随后在37'C下培育16小时。培育后，使组织在100%甲醇中且随后在95%乙醇中脱染色。这些组织显示并无GUS表达。也可能GUS表达水平过低而无法通过这一分析检测。进行使用连接到GUS的PrMC2.400-l进行的其它实验以进一步了解烟草花药发育期间的时间和空间表达模式。可将烟草花发育细分成12个阶段以提供花器官系统中基因表达的参考点。Koltunow等人，ThePlantCell2:1201-1224(1990)。在每一阶段时都移除花芽，切细，染色以分析GUS活性，并以显微镜观察。使用发色底物X-Gluc以组织化学方法分析GUS活性。室温下，使花芽中真空渗入X-Gluc历时1小时，随后在37i:下培育16小时。使组织在100%甲醇中且随后在95%乙醇中脱染色。结果指示PrMC2.400-l启动子仅在花药中表达，且PrMC2.400-l的表达限于其中存在绒毡层的发育阶段。这些绒毡层在花粉形成中起到重要作用。因此，绒毡层中细胞毒素基因的表达可防止花粉产生。实例16将PrMC2.400-3::突变体barnase克隆到二元载体中如上文实例13所述，使用引物PrMC2.400-XG和PrMC2-R3产生PrMC2.400-3。用于扩增这一片段的模板是二元载体pWVR220。将这一经纯化PCR片段克隆到预先经Nco1和Sacl消化的中间载体中，产生构筑体pWVR242，其现含有去除盒PrMC2.400-3::H102Ebarnase::RNS2TER。对这一构筑体测序以确保正确的启动子序列和启动子:基因联接。随后，使用Kpnl和Apal将此盒亚克隆到二元载体中产生pWVR243。G"S妖街将PCR产生的片段PrMC2.400-3克隆到pWVR52中，所述pWVR52预先经Ncol消化，经绿豆核酸酶处理以产生平末端，随后经XhoI消化和凝胶纯化以分离载体片段。随后的质粒pWVR244现含有所述盒PrMC2.400-3::GUS::RNS2TER。对这一构筑体测序以确保正确的启动子序列和启动子:基因联接。随后，使用Kpnl和Apal将此盒亚克隆到二元载体中以产生pWVR245。实例17PrMC2.400-3:barnase的植物原位表达通过电穿孔以二元载体pAGF243或pAGF245转化根癌农杆菌菌株GV2260。由农杆菌介导的烟草(Nicotianatabacum)转化制造转基因植物。在含有卡那霉素的培养基上选择转化体。通过PCR鉴别阳性转化体，将其转移到土壤中，并使其在标准温室条件下生长。观察植物的总营养生长速率、开花时间和雄性不育性。转基因烟草植株显示出雄性不育表型。具体说来，植物不产生花粉粒。另外，PrMC2.4000-l::H102E株相对于心皮高度具有降低的雄蕊高度，且开花时间有所延迟。将含有连接到报告基因GUS的PrMC2.400-3的植株与PrMC2.400-1::GUS株相比较。花芽、尤其花药组织中GUS染色的强度可与PrMC2.400-l::GUS株相较。实例18构筑具有开花对照盒的前体质粒质粒的构筑是以得自因缺失非必需DNA区段而降低尺寸的pBIN19的二元载体pARB310(SEQIDNO:Z1)开始。通过BstXI消化将先前已以侧翼BstXI位点克隆的barstar基因(Hartley,R.W.J.Mol.Biol.202:913-915(1988))从pWVR200B移除，并进行凝胶纯化。使约470bp片段接合到已经BstXI消化的pARB310中，产生pARB310B。接下来，使用PCR以下述引物对由pART27(Gleave，1992)扩增ColEl复制起点和周围区域ColEl-F4(5'-GAGAGAGGATCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3'，SEQIDNO:41)禾口ColEl-R4(5'-GAGAGATGATCAGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTG-3'，SEQIDNO:42)。用BamHI和Bell消化1.0kb的ColEl片段，随后加以纯化并将其接合到trfA基因末端与T-DNA左边界(LB)之间pARB310B的Bell位点中。这产生pAGF50，其充当大肠杆菌中的高拷贝数质粒，但仍在农杆菌中复制。用Ascl和Ncol消化pAGF50以移除UBQ3启动子和大部分NPTII编码区，并对所得5.7kb片段进行凝胶纯化。通过Ascl和Ncol消化将连接到NPTII编码区5'端的1.9kb片段和UBQ10启动子从pWVR3释放，凝胶纯化并将其接合到pAGF50片段中以产生pARB1000。通过加入SUBIN::GUSIN::NOSTER报告基因盒进一步修饰这一质粒。SUBIN表示来自辐射松的独特启动子，其包括编码5'-UTR和内含子的基因组DNA;GUSIN表示来自马铃薯tuberin基因的(3-葡糖苷酸酶编码区和内含子(Vancanneyt等人，1990)。通过Dral消化将报告基因盒从pARB494移除，并将其接合到pARB1000的Smal位点中以产生pARB1001。除能够充当转化对照物外，由于pARB1001具有两个在报告基因侧面的可用于使其与所关注的其它基因转换的Notl位点，所以还将其用作开花对照质粒的直接前体。雄性特异性开花对照基因PrMC2.400::barnaseH102E::RNS2TER存在于pWVR219中，且具有一个接近3'端的不合需要的Notl位点。用Notl消化质粒，且随后在dNTP存在下通过用T4DNA聚合酶处理并与载体再接合来破坏所述位点。用Ascl和Xhol将PrMC2.400::barnaseH102E::RNS2TER盒从已变化的pWVR219切除，并对1.1kb的片段进行凝胶纯化。通过用Xhol部分消化随后以Ascl完全消化来制备pARB1001以使质粒线性化。使PrMC2.400::barnaseH102E::RNS2TER盒与所制备的pARB1001载体接合以产生pARB1002。用单边测序(single-passsequencing)验证质粒的结构。通过EcoRI禾GAscl消化将(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G::NOSTER盒从pWVCZ24移除。将包含寡核苷酸EcoNotl(5'-AATGCGGCCGCAGAGA-3'，SEQIDNO:43)禾口EcoNot2(5'-TCTCTGCGGCCGC-3'，SEQIDNO:44)的Notl接头接合到EcoRI位点，并用Notl消化，且随后纯化4.9kb片段。用Notl和Ascl消化质粒pARB1001，并对7.6kb载体片段进行凝胶纯化。将上述盒接合到这些位点中以产生pARB1005L(图19)。用单边测序验证质粒的结构。实例19西方桉早花(EarlyFlowering)的转化本实例详细说明西方桉早花的感染和转化。为测试开花对照构筑体，在温室生长条件下测试西方桉籽苗的早花，并基于六个月内的开花情况选择克隆。将这些克隆引入不育组织培养物中以用于本发明的去除构筑体和对照GUS构筑体的转化。如下表所示，根据美国专利申请案10/861,909的方法，采集叶外植体(Leafexplant)，并预培养4天，且随后用具有p35SGUSINT(35S::GUSINT，NOS::NPTII)或本发明的构筑体的农杆菌菌株GV2260感染单独外植体，所述专利以以引用的方式并入本文。根除农杆菌后，将外植体移植到选择培养基中，所述选择培养基是由如同一专利申请案中所述的常规再生培养基和30mg/l遗传霉素组成。使转化体的再生枝条生根，并使其在温室中在容器中的土壤上生长以相对于对照物测试经去除构筑体转化的桉树的开花时间。也使用美国专利申请案10/861,909的方法将本发明的构筑体转化到赤桉克隆和尾叶桉和巨桉的商用克隆中。使转化体的再生枝条生根，将其转移到土壤中并使其适应温室，随后在美国农业部植物健康检查服务(USAgriculturalPlantHealthInspectionService)通知下将其转移到Florida和SouthCarolina的田间种植点。定期监测植物花芽的发育。迄今尚未观察到开花。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>实例20杂交松使用美国专利第5,856,191号中所述的程序从个别未成熟大配子体的合子胚起始杂交松(火炬松属x刚松属)和火炬松(火炬松属)胚细胞系，并使用美国专利第5,506,136号中所述的程序加以维持。在维持培养基上培养一到三个月后，低温保存组织培养物，储存长达数年的时间，且随后使用美国专利第6,682,931号中的方法加以恢复。植物组织培养领域的技术人员将认识到，其它低温保存和回收方案将适用于本方法中且不可将本实例中的细节解释为对本方法应用的限制。根据美国专利第5,491,090号中的方法，两种遗传不同的杂交松组织培养细胞系和多种火炬松细胞系的均匀悬浮培养物是通过在250mlNephelo侧臂烧瓶(Nephelosidearmflask)(KontesChemistryandLifeSciencesProducts)中接种1g各组织而建立的。在23°C+21:的温度下，在暗培养室中将含有液体培养基中的细胞的烧瓶放置到100rpm下的回转式震荡器(gyrotoryshaker)中。一周后，通过将15ml新鲜培养基倾入培养烧瓶中并打漩以均匀分布细胞来使每一烧瓶中的液体达到35ml。将细胞和培养基倾析到烧瓶的侧臂部分中，使细胞沉降30分钟且随后测量产将细胞体积(SCV)，从而来测量侧臂中细胞的生长。当SCV大于或等于最大SCV的一半(烧瓶中50%体积由植物细胞占据)时，将每一培养物转移到含有总计80ml细胞和培养基的500ml侧臂烧瓶中，并在相同条件下维持所转移的培养物。为准备基因转移，通过高压灭菌使聚酯膜载体无菌，并将其放置到单独的无菌布氏漏斗(Buchnerfunnel)中，且对于每个细胞系6个复制平板中的每一个而言，将1微升到3微升松树胚性细胞悬浮液吸到每一载体上，从而使胚性组织均匀分布。从所述组织抽吸液体培养基，并根据美国专利公开案第20020100083号中所述的方法，将具有胚性组织的每一载体放置到凝胶化制备型培养基上以供农杆菌培育。通过所属领域技术人员众所周知的技术将二元报告基因构筑体引入到不同根癌农杆菌的分离物中(isolatesAgrobacteriumtumefacien),并通过常用技术以投与乙酰丁香酮诱导毒性，于是，使每一经诱导的农杆菌分离物与单独的植物材料复本共混合。在22'C+2°CT,在暗室中共培植所述细胞历经约72小时。共培植后，根据美国专利公开案第20020100083号中所述的方法，从培养物中根除农杆菌。随后，以2周的时间间隔将聚酯膜载体上生长的细胞转移到新鲜选择培养基上。在许多皮氏培养皿(petridish)上的多个独立部分中出现选择培养基上的活跃生长。所述在选择剂存在下的活跃生长通常表明生长组织已将选择基因整合到其染色体中并经稳定转化。将这些活跃生长区作为独立转化事件处理，且在下文中将其称为假定的转基因亚株(putativetransgenicsubline)。通过将正在生长的转基因部分转移到补充有个别选择剂的新鲜半固体维持培养基中来繁殖假定转基因胚性组织。在推定经转化亚株达到约2g后，使用标准技术对其进行选择以用于聚合酶链反应(PCR)扩增，从而确认转基因的存在。表9.PCR引物对<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>牺牲来自每一亚株的材料以供GUS染色和显微镜检验。对于GUS染色而言，根据植物转化技术中众所周知的技术，在暴露到发色葡糖苷酸酶(colorigenicglucuronidase)酶底物"X-gluc"(购自Inalco)后通过每一转基因细胞系中细胞的深蓝染色来检测编码在组织培养细胞中表达的P-葡糖苷酸酶的已插入uidA基因。显微镜检验证实，细胞分裂已恢复，且uidA转基因的瞬时表达展现出这些轰击的正常频率。如下制备可发芽胚。使已在选择培养基上经培养的细胞团块增殖到至少1克后，再次将每一细胞团块单独地再悬浮到液体培养基中。当细胞悬浮液达到均匀(最大的一半)SCV时，将等量的悬浮培养细胞吸到无菌膜载体上以放置到如美国专利第5,506,136号中所述的发育/突变培养基上，从而萌发高品质的可采集的第3阶段(子叶)胚。在暗生长室中，在23'C+2^下培育培养皿。每三周将膜载体转移到含有新鲜培养基的新皮氏培养皿中。第9周时，视觉分析第3阶段(子叶)胚的发芽品质，并将其采集到如美国专利第5，506，136号中所述的培养基上的织物载体上，且在黑暗中在4°C±2'C的温度下培育约4周。接着，在25。C±2'C的温度下在黑暗中，在密封容器中的水中培育其织物载体上的胚历经约3周。上述两种处理后，将其织物载体上的胚转移到培养基萌发培养基上，并在黑暗中在25。C±2。C的温度下培育约3天。随后将胚从其织物载体上移除，并将其放置到新鲜萌发培养基上。在光照下在25t:±2。C的温度下进行萌发。每周检查萌发平板，历时约4周的一段时间，并将正在萌发的胚转移到含有100ml萌发培养基的MAGENTA⑧盒中以转变成幼苗。在光照下，在25°C±2°C的温度下培育含有正在发育的幼苗的MAGENTA⑧盒历经约8至lj12周。当幼苗形成上胚轴(新近形成的约2cm到4cm的嫩枝)时，将其转移到填充有灌封混合物(pottingmix)[2:1:2的泥炭块:珍珠岩蛭石，含有602g/m3OSMOCOTE肥料(18-6-12)、340g/m3白云石和78g/m3MICRO-MAX微量养料混合物(SierraChemicalCo.)]的容器中。使幼苗在阴凉的温室中生长且偶尔喷雾历经约2周的一段时间。将其从薄雾中移除以适应温室中的环境历经约4周。随后，将幼苗转移到户外荫凉处历经约6周以最后适应环境，此后，将其移到全光照条件下。接着，使其在容器中生长直至条件适于田间种植。也将由火炬松松属(P.taeda)植株再生的植物种植到相同田间地点，在种植后长达6年的时间内未观察到球果产生。然而，出人意料的是，在种植后三年时，转基因杂交松树植株产生球花。此时，所述杂交树大约l米高，比相邻转基因火炬松小得多。下表10展示另一次种植的结果，其包括作为对照物的非转基因杂交松树原始株以用于体细胞胚发生；与对照物具有相同亲代不经过组织培养的多种籽苗基因型；和使用两种不同载体由97LP0006产生的总计24种不同的转基因植株，一些使用基因枪转化且一些使用农杆菌转化，且总计超过250棵植物中大部分植株的多个复本在种植2年后产生一些球花且在种植三年后产生显著数量的球花。测试以下述观察结果终止。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>表10所示的结果表明，经过组织培养和转化是达成产生本发明的早球花(earlystrobili)结果所必需的，这是因为SE对照物不产生球花，而极少数未经组织培养的基因型产生球花。然而，几乎所有的转基因植株都以极高频率产生雄球花或雌球花或二者。18种转基因植株中仅一种在三年内未产生球花。所述结果与所使用的转化无关且也与所使用的转化载体无关。这表明最佳模式是使用(例如)经报告基因构筑体转化的转基因对照物以供所预期的比较，从而展示诸如本发明的去除构筑体的繁殖对照构筑体的效率。在产生球花时，树平均约为1.2米高，具有平均高度的人无需专用工具就可轻易采集。随后，使用这一系统来测试本申请案的繁殖对照构筑体在裸子植物中的功用，所述测试为一种不可能以其它方式进行的测试。胚性愈伤组织提供测试所测试的启动子是否在裸子植物中漏出和当以漏出方式表达时减弱的barnase基因是否有害的机会(参看表中第4列)。使树再生并将其种植到田间后，相对于经GUS转化的对照物可在三年内测量对球果形成日期的影响，此后田间测试可终止。这将另外允许供这些田间测试用的昂贵制造林地更快的轮种。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>实例21使用具有LPAG1和LPAGld4启动子的构筑体去除松树雄球花和雌球花的方法基于实例6表4所示的结果，可使用LPAG1和LPAGld4启动子去除松树的雄球花和雌球花。举例说来，去除构筑体可具有可操作地连接到编码barnase的基因的LPAG1启动子，而LPAGld4启动子可操作地连接到编码barstar(barnase抑制剂)的基因。如上述实例6所示，LPAG1启动子在松球和松胚中具活性，而LPAGld4启动子仅在松胚(pineembryo)中具活性。这一设想是基于LPAG1在烟草花中具有高活性而LPAGld4在烟草花中具极低活性的观察作出的。通过在可在松球中具有极低活性的LPAGld4启动子的控制下放置编码barstar的基因，由另一启动子(LPAG1)所产生的barnase毒性可有效去除雄球花和雌球花。另一方面，在松胚中两种启动子的类似活性水平产生类似量的barnase和barstar,且因此所述胚中barnase毒性得以有效中和，引起松树胚性愈伤组织和胚的转化和再生。序列鉴别符的说明SEqIDNO.1—LPAG1SEGIDNO.2—LPAG2SEQIDNO.3—PrAG-ATenhSEqIDNO.4—PrMC2.400-lSEQIDNO.5—barnase突变体E73G(DNA)SEQIDNO.6—barnase突变体F106S(DNA)SEQIDNO.7—barnase突变体H102E(DNA)SEQIDNO.8—barnase突变体K27A(DNA)SEQIDNO.9—barnase突变体E73G(AA)SEQIDNO.10—barnase突变体F106S(AA)SEQIDNO.11—barnase突变体H102E(AA)SEQIDNO.12—barnase突变体K27A(AA)SEQIDNO.13—PrMC2+barnase突变体H102ESEQIDNO.14—PrMC2+barnase突变体K27ASEQIDNO.15—PrMC2+barnase突变体E73GSEGIDNO.16—PrMC2.400-3SEQIDNO.17—LPAGld4SEQIDNO.18—pWVR220[PrMC2.400::barnaseH102E](图1)SEQIDNO.19—pWVCZ20[(AtAGenh)PrAG::GUS(内含子)](图2)SEQIDNO.20—pWVCZ23[PrAG::barnaseE73G](图3)SEQIDNO.21_pWVCZ24[(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G](图4)SEQIDNO.22—pARB599B[PrMC2::barnaseH102E](图5)SEQIDNO.23—pARB639B[(AtAGenli)PrAG::barnaseE73G](图6)SEQIDNO.24—pAGF243[PrMC2.400-3::barnaseH102E](图7)SEQIDNO.25-pABDP010[CZ28-bstar+UBQ10::NPTII::E9/LPAGld4::bstar::NOST的互补拷贝](图8)SEQIDNO.26—pABDP04[CZ28-bstar+UBQ10::NPTII::E9/LPAGld4::bstar::NOST的互补拷贝](图9)序列如下。SEQIDNO.1—LPAG1TGTGTACAAATCATGSEQIDNO.2—IiPAG2TCATGSEQ工DNO.3—PrAG-ATenh<formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula>SEQIDNO.4_PrMC2—400.1GTTTTTAGAAGATTTATGAGAATGGCCAAAATTCAGGTATCAAACGGGAACSEQIDNO.5—barnase突变体E73G(DNA)SEQIDNO.8—barnase突变体K27A(DNA)SEQIDNO.9-ba纖se突变体E73G(AA)AlaProGlyLysSerlleGlyGlyAspIlePheSerAsnArgGluGlyljysIieuPiroGlyliysSerGlyArgThrTrpArgGlyAlaAspIleAsnTyrThrSerGlyPheArgAsnSerAspArglleLeuTyrSei:SEQ工DNO.10-barnase突变体(AA>isLysLeuProAspArgThrTrpArgGluAlaAspIleAsnTyrThrSerGlyPheArgAsnSerAspArglleLeuTyrSerSerAspTrpLeuIleTyrLysThrThrAspHisTyrGlnThrSerTtirliysIleArgSEQIDNO.11-barnase突变体H102E(AA)AsnTyrlleThrLysSerGluAlaGlnAlaLeuGlyTrpValAlaSerLysGlyAsnLeuAlaAspValAlaProGlyLysSerlleGlyGlyAspIlePheSerAsnArgGluGlyLysLeuProGlyLysSerGlySerAspTrpIieuIleTyrliysThrThrAspGluTyrGlnThrPheThEljysIleAjrgSEQ工DNO.12-barnase突变体K27A(AA>/sGlyAsnLeuAlaAspValjeuProGlyLysSerGlyArgThrTrpArgGluAlaAspIleAsnTyrThrSeirGlyPheArgAsnSerAspArglleLeuTyrSerSerAspTrpLeuIleTyrLysThrThrAspHisTyrGlnThrPheThirLysIleArgSEQIDNO.13-PrMC2::BarnaseH102E::RNS2TE:RcassetteSEQIDNO,14—PrMC2::BarnassK27A::RNS2TERcassetteSEQIDNO.16-PrMC2.400-3启动子AGAAGATTTSEQIDNO.17-LPAGld4ACAAATC关于用SEQIDNO.18-26表示的序列，见图1-9和图13。权利要求1.一种选自由SEQIDNO1-8与13-26组成的群组的经分离聚核苷酸或其功能性变异体，其中SEQIDNO1、2、3、4或16中任一者所述的序列使植物细胞表达繁殖优选基因。2.根据权利要求1所述的经分离聚核苷酸，其中所述功能性变异体与所述经分离聚核苷酸的序列具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%的序列同一性。3.—种构筑体，其包含可操作地连接到所需核酸的选自SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的聚核苷酸或其功能性变异体，其中所述聚核苷酸调控所述所需核酸在经所述构筑体转化的植物细胞中的表达。4.根据权利要求3所述的构筑体，其中所述所需核酸编码表达产物，所述表达产物能够破坏植物中雄性繁殖结构、雌性繁殖结构、成熟前雄性繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构中至少一种繁殖结构的繁殖发育。5.根据权利要求4所述的构筑体，其中所述雄性繁殖结构为花药、花丝、绒毡层、花粉、小孢子叶或雄球花中的至少一种，且其中所述雌性繁殖结构为柱头、花柱、子房、大孢子或胚珠(ovuliferouscone)中的至少一种。6.根据权利要求4所述的构筑体，其中所述表达产物是降低所述植物表达目标基因的RNA转录本。7.—种包含权利要求3所述的构筑体的转基因植物。8.—种制造转基因植物的方法，其包含(a)用构筑体转化植物细胞，所述构筑体包含(i)至少一种可操作地连接到所需核酸的具有SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的序列的聚核苷酸或其功能性变异体，其中所述聚核苷酸调控所述所需核酸的活性，或(ii)具有SEQIDNO:13、14或15中任一者所述的序列的聚核苷酸；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞，其中所述植物为显示出与不含有所述构筑体的相同种类植物不同的表型的转基因植物。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述经转化植物的表型的特征在于与不含有所述构筑体的相同种类植物相比的雄性繁殖结构、雌性繁殖结构、成熟前雄性繁殖结构或成熟前雌性繁殖结构中至少一种繁殖结构的繁殖发育中的差异。10.根据权利要求8所述的方法，其另外包含选择繁殖不育、已去除繁殖发育、已变化花粉育性和/或具有未受干扰的营养生长的植物。11.根据权利要求8所述的方法，其中所述植物细胞是来自木本植物。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述木本植物是选自桉树属(￡McaZ，n)或松属(■P/ttiii1)。13.—种经分离的突变体baraase酶，其是由包含SEQIDNO:5-8中任一者所述的序列的聚核苷酸或其变异体编码，其中所述经编码的突变体barnase酶与野生型barnase酶相比具有已减弱的活性。14.根据权利要求13所述的经分离突变体baraase酶，其中所述变异体与SEQIDNO:5-8中任一者的序列具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%的序列同一性。15.—种获得木浆的方法，其包含(a)将构筑体引入木本植物的植物细胞中，所述构筑体包含(i)具有SEQIDN0:1、2、3、4或16中任一者的序列的启动子或其功能性变异体，其可操作地连接到(ii)所需核酸，所述核酸包含SEQIDNO:5、6、7或8中任一者所述的序列；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞；和(c)从所述植物获得木浆。16.—种使转基因植物繁殖不育性的方法，其包含(a)用构筑体转化植物细胞，所述构筑体具有繁殖优选启动子和非繁殖优选启动子，所述繁殖优选启动子可操作地连接到细胞毒素基因，所述非繁殖优选启动子可操作地连接到编码抑制所述细胞毒素基因的蛋白质的基因；其中所述繁殖优选启动子在被子植物或裸子植物繁殖结构中具活性，且所述非繁殖优选自动子在被子植物或裸子植物繁殖结构中不具活性；(b)在促进植物生长的条件下培养所述经转化植物细胞；和(c)选择具有已去除的繁殖结构的转基因植物，其中所述繁殖优选启动子是选自由SEQIDNO:1、2、3、4或16组成的群组。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述非繁殖优选启动子包含SEQIDNO:17中所述的序列。18.—种构筑体，其包含(i)SEQIDNO:1或2中任一者的序列，其可操作地连接到包含SEQIDNO:5-8中任一者的序列的聚核苷酸；(ii)SEQIDNO:3的序列，其可操作地连接到SEQIDNO:9的序列；(iii)SEQIDNO:4或16的序列，其可操作地连接到SEQIDNO:7的序列；(W)SEQIDNO:1或2的序列，其可操作地连接到编码包含SEQIDNO:9-12中任一者中所述的氨基酸序列的多肽的聚核苷酸；或(v)SEQIDNO:22或SEQIDNO:23中所述的序列。19.一种转基因植物，其包含权利要求18所述的构筑体。20.根据权利要求18所述的构筑体，其另外包含可操作地连接到barstar基因的非繁殖优选启动子。21.根据权利要求20所述的构筑体，其中所述非繁殖优选启动子包含SEQIDNO:17中所述的序列。22.—种转基因植物，其包含权利要求20所述的构筑体。23.根据权利要求7所述的转基因植物，其中所述所需核酸包含SEQIDNO:5-8中任一者的序列。24.根据权利要求8所述的方法，其中所述所需核酸包含SEQIDNO:5-8中任一者的序列。25.根据权利要求3所述的构筑体，其中所述核酸包含SEQIDNO:5-8中任一者的序列。26.—种经包含SEQIDNO:18-26中任一者的序列的构筑体转化的杂交后代植物。27.根据权利要求26所述的杂交后代植物，其中所述杂交后代植物是由刚松松属(P.r!'gWa)北美油松(pitchpine)与火炬松松属(P.toe&)火炬松(loblollypine)杂交而获得。全文摘要本发明涉及繁殖发育的调控，尤其涉及被子植物和裸子植物中繁殖组织的基因去除。本文揭示繁殖优选的启动子、调控元件和细胞毒素核苷酸序列以及基因去除的构筑体与方法。文档编号A01H5/02GK101410522SQ200580039310公开日2009年4月15日申请日期2005年9月22日优先权日2004年9月22日发明者威廉·H·罗特曼,张春程,金·H·诺里斯-卡内达申请人:阿博根有限公司