专利名称：增加癌细胞程序性细胞死亡的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及细胞透过性肽以及这些肽运载功能性货物(cargo)从组织进入细胞的应用。本发明还涉及抑制NF-κB活化的因子。
关于国家权利的陈述本发明部分由美国政府提供的资金(授予号CA99340，由国立卫生研究所，国立癌症研究所资助)而进行的。因此，美国政府可以拥有本发明中的某些权利。
背景技术：
前列腺癌(PCA)是美国癌症相关的死亡的第二主要起因。由于在雄激素-依赖性前列腺癌细胞中刺激程序性细胞死亡，雄激素切除术通常用作治疗法。PCA细胞通常是雄激素-不依赖性的，并且有一些随着时间变成雄激素-不依赖性的。在雄激素切除术治疗过程中最终剩下了雄激素-不依赖性细胞，并且向雄激素-不依赖性状态的进展是患有前列腺癌的男性死亡的主要起因。雄激素-不依赖性肿瘤细胞更难被消灭，已经表明其对许多抗癌药物和肿瘤坏死因子α(TNF-α)治疗法不敏感。雄激素-不依赖性RCA细胞与高剂量的化学治疗药物诸如顺铂和依托泊苷反应，但是这些药物本身具有不理想的系统性毒性水平。倘若水平足够高足以影响显著数目的肿瘤细胞，那么可能对患者构成不可接受的威胁。
已经证明雄激素-不依赖性前列腺癌细胞(例如PC-3和DU145)对TNF-α不敏感，而雄激素-敏感性前列腺癌细胞(例如LNCaP)是TNF-α敏感性的。在许多癌细胞中，对TNF-α和许多已知的化学治疗剂的促凋亡作用的抗性与NF-κB的组成型活化相关。Muenchen等.，(Clin.Cancer Res.2000，61969-1977)证明用IκBα“超级抑制剂”(p6R-IκBS32A+S36A)抑制NF-κB使得先前对TNF-α作用不敏感的前列腺癌细胞变得敏感。在大多数细胞类型中，NF-κB以潜在的、没有活性的形式组成型地存在于细胞质中，它通过与IκB蛋白相互作用而保留在细胞质中，所述IκB蛋白与NF-κB结合并且掩饰其核定位序列(NLS)。在一些细胞类型中，NF-κB被组成型地活化。NF-κB在细胞中的活化包括IκB的遍在蛋白化作用，以致它被26S蛋白酶体降解。去除IκB暴露了NLS，并且导致NF-κB向细胞核的移动，在这里它起作用保护细胞免受程序性细胞死亡。
NF-κB的组成型活化已经在各种组织中得到报道，包括，例如，胸腺、胰腺、肝脏、膀胱、肺、肾和卵巢。成神经细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤和多发性骨髓瘤是与NF-κB的组成型活化相关的癌症。还已经证明对NF-κB核移动的抑制在使得多发性骨髓瘤对多柔比星的促凋亡作用敏感中具有某种作用(Mitsiades等，Blood，(June 2002)994079-4086)。因此，NF-κB活化成为提高癌症治疗的靶点。
对于癌症治疗，优选地应用靶点特异性药剂，并且开发增加癌细胞的破坏而对正常细胞没有类似影响的药剂。特别需要的是用于对目前的治疗模式表现出抗性并且因而具有增加的死亡率的那些癌症的新型药剂。
发明概述本发明涉及包括大约6-大约50个残基的细胞透过性(cell-permeable)肽的多肽，所述细胞透过性肽包括至少SEQ ID NO1的6个连续的残基和NF-κB核定位序列。本发明还涉及包括大约11-大约50个残基的细胞透过性肽的多肽，所述细胞透过性肽包括SEQ ID NO2的至少11个连续的残基和NF-κB核定位序列。NF-κB的核定位序列(NLS)可以包括，例如，p50、p65或它们的功能等价物。本发明还提供在细胞中抑制NF-κB核易位的方法，其包括给细胞施用有效量的包括SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或其组合的肽。所述方法可以治疗性地用于各种疾病状态或代谢异常，其中特别是NF-κB核易位和NF-κB的组成型活化起显著作用。
本发明还提供约6-约50个氨基酸的包括SEQ ID NO1的细胞透过性肽，和约11-约50个氨基酸的包括SEQ ID NO2的细胞透过性肽。所述细胞透过性肽可以合成，在细胞的或没有细胞的DNA和RNA表达系统中产生，或者化学附着以便它与货物分子功能性缔合。例如，所述货物分子可以是内部细胞活性的调节子、细胞-细胞信号传导的诱导子、激素、寡核苷酸或其它活性剂。
本发明还提供用于与组成型NF-κB活化相关的癌症的化学治疗系统，所述系统包括治疗有效量的包括SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或其组合的肽、以及在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡的化学治疗剂或放射性治疗剂。化学治疗剂可以包括，例如，TNFα、依托泊苷或顺铂。本发明还提供治疗雄激素-不依赖性前列腺癌的方法，所述方法包括给需要其的受试者施用治疗有效量的至少一种抑制癌细胞中NF-κB组成型活化的肽，与化学治疗剂组合施用。所述至少一种肽可以包括，例如，SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SN50或其组合。
附图简述
图1示例CB5005的设计和氨基酸序列(单字母氨基酸密码)(SEQ IDNO4)，其为一种抑制NF-κB活化、诱导人前列腺癌细胞程序性细胞死亡并且使得肿瘤细胞对抗癌药物诸如顺铂和依托泊苷的破坏肿瘤细胞作用敏感的肽剂。CB5005(SEQ ID NO4)包含NF-κB p50蛋白的核定位序列(NLS)(斜体)以及新型的11-mer细胞透过性序列(CPS)(SEQ ID NO2)(下划线)。CB5003(SEQ ID NO3)是只具有部分CPS(也用下划线)的类似物肽。CB5002(SEQ ID NO5)包含突变的CPS并且因此不是细胞透过性的和功能性的。CB5007(SEQ ID NO6)是除了NF-κB p50 NLS中2个碱性残基突变(KR-NG)外与CB5005对应的对照肽。
图2通过荧光显微镜分析示例CB5005(SEQ ID NO4)在DU145，PC3，LNCaP和N2a细胞中的细胞输入。将在8孔腔式载玻片上的细胞用30μMCB5005(SEQ ID NO4)在37℃处理1小时。通过使用抗-肽抗体和FITC-标记的抗兔抗体的直接免疫荧光检测而检测胞内肽，并且通过荧光显微镜分析。
图3a示例雄激素-不依赖性DU145细胞核提取物中的NF-κB p50蛋白的蛋白质印迹分析。将DU145细胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)，CB5003(SEQ ID NO3)(90μM)，CB5007(SEQ ID NO6)(30μM)或稀释剂处理30min，之后用TNF-α(10ng/ml)或稀释剂再处理1h。将等量的核提取物通过SDS-PAGE分离，并且将蛋白转移到硝化纤维素膜上。使用抗-p50兔抗体和增强的化学发光检测NF-κB p50蛋白。图3b示例雄激素-不依赖性DU145细胞的核提取物中NF-κB p50蛋白的蛋白质印迹分析。将DU145细胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)，CB5007(SEQ ID NO6)(30μM)或稀释剂处理16h。不加入TNF-α。
图4示例用膜联蛋白V/PI染色的凋亡DU145细胞。在4孔腔式载玻片上的DU145细胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)或稀释剂处理30min，然后用顺铂(5μg/ml)再处理5h。然后，将细胞用膜联蛋白V/PI试剂盒按照制造者流程(BD-Pharmingen)的指导进行处理，并且通过荧光显微镜检验。荧光染色的细胞指示凋亡的细胞。
图5使用TUNEL反应试剂盒(Roche)示例凋亡DU145细胞，所述试剂盒优选标记在程序性细胞死亡过程中产生的DNA链裂口。将在8孔腔式载玻片上的DU145细胞用指定浓度的CB5005(SEQ ID NO4)或稀释剂处理30min，然后用顺铂(5μg/ml)或稀释剂再处理16h。箭头指示在核仁中检测的DNA分裂的深褐色区域，这是程序性细胞死亡的常见迹象。
图6使用TUNEL反应试剂盒(Roche)示例凋亡DU145细胞，所述试剂盒优选标记在程序性细胞死亡过程中产生的DNA链裂口。将在8孔腔式载玻片上的DU145细胞用指定浓度的CB5003(SEQ ID NO3)(40μM)、CB5002(SEQ ID NO5)(72μM)、CB5007(SEQ ID NO6)(30μM)或稀释剂处理30min，然后用顺铂(5μg/ml)再处理16h。
图7a示例用膜联蛋白V/PI染色的DU145细胞的流式细胞分析。将DU145细胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)或稀释剂处理30min，然后用顺铂(5μg/ml)或稀释剂再处理21h。然后通过流式细胞术分析细胞。图7b示例图7a结果的柱状图。
图8示例用膜联蛋白V/PI染色的DU145细胞的流式细胞分析。将DU145细胞用CB5003(SEQ ID NO3)(72μM)、CB5002(72μM)或稀释剂处理15min，然后用顺铂(5μg/ml)或稀释剂再处理21h。然后通过流式细胞术分析细胞。
图9示例用膜联蛋白V/PI染色的DU145细胞的流式细胞分析。将DU145细胞指定浓度的CB5005(SEQ ID NO4)或稀释剂处理30min，然后用TNF-α(10ng/ml)或稀释剂再处理21h。然后通过流式细胞术分析细胞。
图10a显示在不存在CB5005(SEQ ID NO4)或CB5003(SEQ ID NO3)时顺铂在DU145细胞中诱导的凋亡细胞的百分数，其从流式细胞分析的结果计算。实验条件与图7相同。
图10b示例并且比较通过单独的顺铂。单独的CB5005(SEQ ID NO4)以及顺铂和CB5005(SEQ ID NO4)共同处理在DU145细胞中诱导的凋亡细胞的百分数，其从流式细胞分析的结果计算。
图11显示在不存在CB5005(SEQ ID NO4)时依托泊苷在DU145细胞中诱导的凋亡细胞的百分数，其从流式细胞分析的结果计算。将DU145细胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)或稀释剂处理30min，然后用指定浓度的依托泊苷再处理21h。然后，通过流式细胞术分析用膜联蛋白V/PI染色的细胞。
图12a显示不比较在不存在CB5005(SEQ ID NO4)时依托泊苷在PC3细胞和LNCaP细胞中诱导的凋亡细胞的百分数，其从流式细胞分析的结果计算。将PC3细胞或LNCaP细胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)或稀释剂处理30min，然后用5μg/ml的依托泊苷再处理21h。然后，通过流式细胞术分析用膜联蛋白V/PI染色的细胞。
图12b示例用CB5005(SEQ ID NO4)处理的不同细胞系的细胞毒性研究。将生长在96孔平板中的DU145、PC3、LNCaP或N2a细胞一式四份用不同浓度的肽在37℃处理24h。使用MTS比色检测(Promega)1h并且使用Bio-Tek MicroplateAutoreader EL 309在490nm处读数而确定细胞毒性。数据表示为三次独立的实验的平均值±SEM。在DU145和PC3细胞中肽-未处理的和处理的样品(30μM)之间观察到统计学显著性(p＜0.05)，而在LNCaP和N2a细胞中没有观察到统计学显著性。
图13示例CB5005(SEQ ID NO4)在PC3细胞中增强依托泊苷诱导的胱天蛋白酶-3活性的作用。将PC3细胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)或稀释剂处理30min，然后用5μg/ml的依托泊苷再处理16h。使用Asp-Glu-Val-Asp氨基甲基香豆素(DEVD-AMC)作底物，通过荧光分光光度法胱天蛋白酶-3定量检测试剂盒测定细胞裂解物中的胱天蛋白酶-3活性。将样品在380nm处激发，并且在CytofluorTM2300读数仪(Millipore，Bedford，MA)中在460nm处读数。通过从样品荧光中减去空白荧光(只有缓冲液加底物)而计算相对荧光。结果表示为三次不同实验的平均值±SEM。(*显示与只用依托泊苷处理的细胞显著不同(p＜0.05)的值)。
图14使用TUNEL反应试剂盒(Roche)示例凋亡DU145细胞，所述反应试剂盒优选标记在程序性细胞死亡过程中产生的DNA链裂口。将在8孔腔式载玻片上的DU145细胞用指定浓度的CB5005(SEQ ID NO4)或SN50(包括信号肽序列和NF-κB核定位序列的肽，在Lin等美国专利号5,807,746中所述)或稀释剂处理30min，然后用顺铂(5μg/ml)或稀释剂再处理16h。深褐色区域显示在核仁中检测到的DNA分裂，这是程序性细胞死亡的常见迹象。
图15显示在不存在或存在CB5005(SEQ ID NO4)或SN50时顺铂在DU145细胞中诱导的凋亡细胞的百分数，其从流式细胞分析的结果计算。将DU145细胞用CB5005(SEQ ID NO4)(18uM)、SN50(18μM)或稀释剂处理30min，然后用5μg/ml的顺铂再处理21h。然后，通过流式细胞术分析用膜联蛋白V/PI染色的DU145细胞。
图16示例并且比较荧光显微镜分析再DU145细胞中的CB5005(SEQID NO4)和SN50的细胞输入。将在8孔腔式载玻片上的DU145细胞用稀释剂、30μM的CB5005(SEQ ID NO4)或SN50在37℃处理1h。使用抗肽抗体和FITC-标记的抗兔抗体，通过间接免疫荧光检测而检测作为绿色染色的胞内肽，并且通过荧光显微镜进行分析。
详述本发明人设计了新型细胞透过性肽(CPS)，其可以功能性附着到NF-κB活化或核定位抑制剂上以破坏雄激素-不依赖性前列腺肿瘤细胞(癌细胞)。当被递送到细胞时，并且运载包括NF-κB活化抑制剂的货物肽时，相比由已知的NF-κB活化抑制剂诸如SN50提供的抑制，这种CPS提供增加的NF-κB活化抑制。本发明提供可以单独施用、或者与化学治疗剂组合施用增加对肿瘤细胞的毁坏而抑制NF-κB的抗凋亡作用的肽。
本发明还提供新型肽的使用方法，所述新型肽诱导癌细胞的程序性细胞死亡，并且使得肿瘤细胞对化学治疗药物诸如顺铂和依托泊苷的杀细胞作用敏感。这样的肽可以抑制细胞中的抗凋亡机制，或者促进细胞的程序性细胞死亡，并且通常可以包括约6-约50个氨基酸的肽，其包括SEQ IDNO1(Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala)、SEQ ID NO2(Lys-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala)、SEQ ID NO3、SEQ IDNO4或它们的组合。本发明提供新型的治疗剂，其用于治疗雄激素-不敏感性前列腺癌，以及组成型NF-κB活化在其中诱导细胞程序性细胞死亡抗性或抑制程序性细胞死亡的各种癌症类型。
本发明的肽和本发明方法中所用的肽可以通过本领域技术人员已知的标准肽合成方法而制备。肽还可以是使用表达载体产生，所述表达载体具有编码选择的肽的核苷酸序列，其可操作地连接到适当的启动子、终止子和其它功能性序列诸如编码纯化标记的序列上，以促进所述肽的表达和纯化。“可操作地”或“功能性地”连接意指，CPS与其货物肽连接，以致CPS可以指导CPS/货物肽(例如CPS/NLS)输入到细胞中，并且所述货物肽可以起到影响细胞代谢诸如细胞信号传导的功能。例如，CPS和货物肽可以通过一个或多个肽键连接。CPS可以紧接在货物肽的C端或N端，可以使用多于1个CPS，可以使用多于1个货物肽，和/或CPS和货物肽氨基酸序列可以通过在CPS和货物肽之间区域的一个或多个氨基酸而分开。CPS/货物肽可以包括C端或N端或者两端的其它氨基酸。
当用于本文时，“化学治疗”剂是在细胞中刺激程序性细胞死亡的化学试剂，通常(但不是总是)对癌症或肿瘤细胞比对正常细胞具有更大的作用。许多化学治疗剂是本领域的技术人员已知的。癌症治疗领域的技术人员已知的刺激癌细胞的程序性细胞死亡的药剂还包括放射性治疗剂。本发明的肽也可以用于增加放射性治疗剂的作用，并且提供协同作用，以促进癌细胞的毁灭。
细胞透过性，“能够输入的”信号肽序列以及膜易位序列促进附着的肽和蛋白转运到细胞中。先前已经描述了一些这种类型的序列，包括卡波西成纤维细胞生长因子信号序列的疏水区，所述卡波西成纤维细胞生长因子与p50的核定位序列(NLS)融合产生称为SN50的肽(U.S.Patent No.5,807,746)。本发明人在这里提供由本发明人设计的赋予附着的肽或蛋白提高的细胞透过性的新型序列。当在相似的施用条件下与SN50的活性比较时，将NF-κB p50或功能性副本与本文所述的细胞透过性序列(CPS)可操作地连接，产生具有提高活性的肽。本发明人证明包括Lys-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala(SEQ ID No.2)的序列比一种最广泛应用的NF-κB活化的细胞透过性抑制剂SN50更有效地促进p50NLS的细胞输入。当与在这些细胞中引发凋亡途径的化学治疗剂组合施用时，本发明人生产的CPS/p50 NLS(SEQ ID NO3)肽提供有效的雄激素-不依赖性前列腺癌细胞的细胞杀伤。CPS/p50 NLS(SEQ ID NO4)肽不但当与至少一种化学治疗剂或放射性治疗剂施用时提供协同的促凋亡作用，而且当不与化学治疗剂或放射性治疗剂一起施用时也提供促凋亡和治疗作用。
当用于本文时，术语“CPS”包括所述肽的变体或生物活性片段、以及可以在公开序列的N端或C端(或两端)含有其它氨基酸的肽、它们的衍生物、变体或功能性副本。例如，“功能性副本”可以包括肽核酸(PNA)。肽的“变体”与公开的CPS肽序列不完全相同。依据本发明的内容，变体可以通过插入、删除或取代一个或多个氨基酸改变氨基酸序列而获得。可以修饰公开的肽的氨基酸序列，例如，通过取代产生具有基本上相同或改善的性质的肽。取代可以是保守取代。“保守取代”是用具有在极性/非极性性质、电荷或大小上相似的侧链的另一种氨基酸取代氨基酸。20种基本氨基酸可以分成具有非极性侧链的(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)，不带电荷极性侧链的(甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)，酸性侧链的(天冬氨酸和谷氨酸)以及碱性侧链的(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)。保守取代可以包括，例如，Asp取代成Glu，Asn或Gln；His取代成Lys，Arg或Phe；Asn取代成Gln，Asp或Glu；Leu取代成Ile或Val；以及Ser取代成Cys，Thr或Gly。丙氨酸通常用于进行保守取代。
对于本领域的技术人员，变体肽可以通过在肽结构中的一个或多个位置用第一个氨基酸取代第二个氨基酸以影响生物活性而获得。例如，氨基酸取代可以包括导致增加的生物活性的多肽构象变化。
本领域的技术人员还可以基于氨基酸的亲水性指数(hydrophilicityindex)或亲水指数(hydropathic index)在氨基酸序列中进行取代。
本发明的变体肽同相应的天然核酸分子的或包括SEQ ID NO 1，SEQID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的多肽的氨基酸序列有低于100％，但是至少约50％，并且优选地至少约80％-约90％的氨基酸序列同源性或相同性。因此，变体CPS肽的氨基酸序列基本上符合公开的氨基酸序列。当用于本文时，“基本上符合”是指这样的多肽序列，其引发同由公开的CPS产生的生物活性相似的生物活性，这样的活性是公开的CPS肽的活性的至少约70％-大于公开的CPS肽的活性的100％。
公开的CPS的变体可以包括在相应的CPS中不存在的氨基酸残基，或者相对于相应的CPS可以包括删除。与相应的CPS相比，变体还可以是剪截的“片段”，即，只是某些公开的CPSs的部分氨基酸序列。
核因子κB(NF-κB)在雄激素-不敏感性PCA细胞中被组成型地活化，活化通过在组织中释放TNF-α而增加。NF-κB以及它调控的基因似乎负责在人PCA细胞中诱导抗程序性细胞死亡作用。NF-κB核易位可以通过施用本发明的CPS/p50 NLS(SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或其组合)肽干扰NF-κB-调控的抗凋亡机制而得到抑制。当与刺激程序性细胞死亡的化学治疗剂组合施用时，本发明的CPS/p50 NLS(SEQ ID NO3)肽阻滞NF-κB活化以及随后的程序性细胞死亡的抑制，并且促进肿瘤细胞的杀伤。当单独施用或者与诱导程序性细胞死亡的化学治疗剂组合施用时，SEQ ID NO4所述的CPS/NLS也阻滞NF-κB对程序性细胞死亡的抑制，并且促进肿瘤细胞的破坏。
包括SEQ ID NO4的肽可以单独施用，不存在任何化学治疗剂，来提供治疗作用。“单独”意欲表示所述肽作为主要的治疗剂提供，没有具有显著促凋亡治疗作用的其它药剂。应该理解本发明的肽或者本发明方法所用的肽可以与本领域技术人员已知的适当的药剂一起提供，诸如例如赋形剂、稀释剂、溶剂、盐溶液以及具有其它理想的治疗作用的试剂诸如抗生素和减轻疼痛剂。
本发明的细胞透过性序列(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)还可以用来递送各种其它肽、核酸以及其它用于研究或治疗应用的有机化合物。可以使用本发明方法递送到细胞内部的其它肽包括，但不限于，包括酶分解位点、磷酸化位点、蛋白-蛋白相互作用区域以及胞内蛋白受体结合位点的肽。CPS还可以用来递送包括在细胞内部作用以促进生长、分化或其它细胞功能的蛋白功能区域的肽。
本发明的CPS/p50 NLS还可以用于包括出于减少炎症或疼痛目的而抑制NF-κB核定位的许多其它的治疗中。例如，已经提议NF-κB抑制作为类风湿性关节炎(RA)治疗干预的靶点。在类风湿性关节炎中，滑膜变成有侵入性的、肿瘤样结构(关节翳)，并且通常认为程序性细胞死亡的消弱性调控是一种病因因素。在RA的动物模型中，动脉内施用NF-κB诱饵在治疗过的关节中以及在对侧未治疗的关节中防止链球菌细胞壁-诱导的关节炎的复发。已经表明，脊髓NF-κB活化诱导COX-2上调和诱导炎性疼痛超敏性。炎性疼痛超敏性在急性和慢性疼痛病况中起作用。本发明的CPS/p50 NLS可以提供到受伤、手术、外伤和炎症位点，以降低COX-2上调和疼痛超敏性。肽可以注射到动脉内空间，或者可以通过来自储蓄库泵的导管而提供，所述泵位于体内或体外。持续或者改进释放的组合物可以通过注射或泵而提供，或者可以结合到移植基质中或者结合在炎症位点附近。
已经报道，NF-κB的抑制对移植组织或细胞诸如胰岛细胞具有保护性作用。因此，具有CPS/p50 NLS序列与移植组织组合提供的本发明的肽提供了一种促进细胞存活的方法。
已经表明，通过过量表达IκBα或剪截的p65而抑制NF-κB活化减少了炎性反应，并且保护器官免受异种移植的伤害。已经提议抑制NF-κB活化有效地防止与局部缺血/再灌注、心脏病发作和中风相关的组织损伤。
本发明还针对在细胞中诸如PCA细胞中抑制NF-κB转录因子家族蛋白的诱导的和/或组成型活化的方法，例如，通过包括上文所述的功能性连接到NLS上的CPS的多肽进行。本发明的方法提供了将NF-κB p50 NLS引入到人前列腺癌细胞内部而抑制内源NF-κB的核易位和活化的方法。所述方法包括向患者细胞内部施用治疗有效量的肽，其与治疗有效量的至少一种化学治疗剂组合施用，所述肽包括可操作地连接到促进NF-κB核定位序列转运的肽上的NF-κB核定位序列或其功能片段。包括NF-κB核定位序列和促进NF-κB NLS转运到细胞内部的肽的肽，可以包括，例如，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或其组合。促进NF-κB核定位序列转运到细胞内部的肽可以包括，例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO2或其组合。CPS/NF-κB NLS肽可以在施用至少一种化学治疗剂之前、同时或之后而施用，并且施用的时间选择可以取决于所选的施用途径。
CPS/p50 NLS NF-κB抑制剂，或包括本发明所述的功能性连接到NF-κB核定位的抑制剂上的CPS的肽，诸如CB5003(SEQ ID NO3)，还可以用于具有相似的抗凋亡机制的癌细胞。在本发明中，本发明人表明，用CB5005(SEQ ID NO4)同时治疗PCA细胞极大地减少了诱导人PCA细胞程序性细胞死亡所需要的顺铂或依托泊苷的浓度，并且显著地增加了所述化学治疗剂的功效。此外，当不存在其它化学治疗剂以其自身用作化学治疗剂时，CB5005(SEQ ID NO4)也可以在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡。
因此，本发明还提供了化学治疗试剂盒或系统，所述化学治疗试剂盒或系统包括治疗有效量的至少一种肽试剂(其抑制NF-κB的抗凋亡作用，促进肿瘤细胞毁灭)或试剂组合，其包括与至少一种在肿瘤细胞中引发凋亡途径的化学治疗剂一起提供的至少一种肽试剂。这些可以以混合形式或以独立的等分形式提供。在一个实施方案中，这样的试剂盒或系统包括CPS/p50 NLS或相似的肽，诸如例如，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或其组合，以及至少一种化学治疗剂。例如，化学治疗剂可以包括TNF-α、顺铂、依托泊苷、或者当施用给需要化学治疗的患者特别是在诊断患有雄激素-不依赖性前列腺癌的患者中刺激程序性细胞死亡的其它药剂。例如，CPS/p50 NLS肽可以包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者赋予与其可操作地连接的肽的膜透过性的各种序列。这样的序列还可以包括，例如，卡波西成纤维细胞生长因子的信号序列或在美国专利No.6,780,843中所述的膜易位序列。
根据本文所含的内容，本发明提供的肽剂的治疗有效量可以由本领域的技术人员确定，并且可以依据用来确定剂量水平的常见因素而不同，诸如年龄和重量，以及在给处方使用肽剂和化学治疗剂组合的具体个体中依据肿瘤大小、肿瘤数目和肿瘤位置而不同。施用可以通过标准途径进行，诸如静脉内施用、腹膜内施用、移植持续不变释放的基质、装置或组合物、或者本领域技术人员已知的其它方式。
持续不变的释放、改进的释放、或可控释放组合物或装置先前已经描述过，并且可以为本发明所述的肽剂提供施用。例如，体内泵可以用来施用所述肽剂，以及与所述肽剂组合施用的化学治疗剂。也可以使用外部泵，特别是当这样的泵可操作地与用于将肽剂递送到患者循环系统或患者组织的靶点位点的导管相连时。对于位于或者在皮肤表面附近的肿瘤，还可以应用透皮递送。可以使用本文所述的肽的静脉内施用或者用于本文所述方法的肽的静脉内施用。可以使用标准针头/注射器注射肽组合物。例如，注射可以皮下、腹膜内或肌内提供。
本发明的CPS的增加的膜透过性还提供了递送活性剂(其包括，例如肽、蛋白、DNA、RNA、反义寡核苷酸、核酶、或它们的组合)通过一个或多个组织以辅助药物递送的更有效的药剂。在美国专利号6,780,846(Elan Corporation，PLC)中描述了应用膜易位肽提供药物递送系统的应用。药物组合物诸如肽、蛋白、激素、止痛剂、螯合剂、细胞内代谢的调控剂、细胞-细胞信号传导的调控剂等可以通过附着到本发明的CPS上而提供。附着可以通过下列各项实现合成CPS/活性剂货物组合分子，将货物分子化学附着到CPS上，在细胞的或没有细胞的重组DNA表达系统中生产CPS/活性剂货物组合物分子，或者本领域技术人员已知的其它方法。CPS/活性剂分子可以与本领域先前所述的各种试剂组合或者通过其递送，诸如例如，微粒、微球(nanospheres)、脂质体、微球体(microspheres)、胶囊、乳剂和/或微团。通常包括肽或目标生物体DNA序列，激素诸如例如胰岛素、生长素、雌二醇和睾酮，化学治疗剂，抗高血压剂以及其它活性剂的疫苗，可以通过包括本发明的CPS的药物递送系统递送。递送途径可以包括静脉内、腹膜内、口服、鼻腔(例如通过滴入或吸入)、局部或本领域技术人员已知的其它方式。例如，包括本发明的CPS/活性剂分子的组合物可以进行局部施用，以辅助皮肤癌、皮肤疾病、烧伤和慢性创伤的治疗。
本发明将通过下述非限制性实例的方式进一步描述。
实施例设计并合成CPS功能性肽肽通过常规固相肽合成方法(Celtek Bioscience，Nashville，TN)合成。应用基于Fmoc化学的标准合成流程。合成后，将未加工的肽从固体支持物上切下，并且通过C18反相HPLC纯化。通过分析性HPLC分析和质谱分析特征性描述纯化的肽。
对于生物检测，在作为稀释剂的PBS(2mg/ml)或DMSO(30mg/ml)中制备肽储液。DMSO在培养基中的终浓度不超过0.1％。
将NF-κB p50蛋白的核定位序列(NLS)用作功能性货物，并且将细胞-透过性序列(CPS)用作载体。合成CPS/NLS的合成肽，以使CPS位于NLS的N端(
图1)。对于多肽CB5003(SEQ ID NO3)，具有包括CPS的SEQ IDNO1。对于多肽CB5005(SEQ ID NO4)，具有包括CPS的SEQ ID NO2。CB5002(SEQ ID NO5)包含位于NLS N端的突变的、非功能性的CPS。CB5007(SEQ ID NO6)含有位于CPS C端的突变的、非功能性的NLS。
细胞系人前列腺癌DU145和LNCaP细胞系获得于美国典型培养物收藏中心(ATCC，Rockville，MD)。人前列腺癌PC3细胞系由Huntington MedicalResearch Institutes，Pasadena，CA的Dr.Lawrence Jones友好馈赠。所有3种细胞系都保持在补充了10％胎牛血清、50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素和1mM丙酮酸钠的RPMI 1640中。对于LNCaP细胞，还补充了10mMHEPES和4.5g/L葡萄糖。N2a成神经细胞瘤细胞系由University of SouthernMississippi，Hattiesburg，Mississippi USA的Dr.Yuan Luo友好馈赠。N2a细胞保持在补充了5％胎牛血清的50％DMEM/50％Opti-MEM中。细胞系在37℃5％CO2湿润的氛围中生长。
用于检测肽细胞输入的间接免疫荧光检测将DU145细胞在8孔腔式载玻片(Nunc，Naperville，IL)上生长到80％汇合。然后，将这些细胞在37℃与稀释剂或在没有血清的RPMI中的不同浓度的肽温育1h。将细胞用冰冷的PBS洗涤3次，以去除细胞外的肽，并且然后用在PBS中的3.5％低聚甲醛溶液在4℃固定20min。将固定的细胞用冰冷的PBS洗涤3次，并且用0.25％Triton X-100处理10min。然后，将洗涤的细胞与在PBS中的抗肽IgG一起温育1h。用PBS洗涤3次，每次洗涤5min，之后，使用FITC-标记的山羊抗兔IgG(Pierce，Rockford，IL)在温育1h后，随后检测胞内肽(通过肽-抗体复合物)。将具有染色细胞的盖玻片封固在Poly/Mount(Polysciences，Warrington，PA)中，并且使用100×油浸镜头用Microstar IV(Reichard，Buffalo，NY)进行分析。使用Pixera数码相机分析彩色成像，并且以JPG格式保存。对于在其它细胞系包括PC3、LNCaP和成神经细胞瘤N2a细胞中确定肽的细胞输入，也应用了相同的检测法。
CB5005(SEQ ID NO4)肽的细胞输入通过荧光显微镜分析检测免疫荧光检测中的荧光信号，而检验CB5005(SEQ ID NO4)，CB5003(SEQ ID NO3)，CB5002(SEQ ID NO5)，和CB5007(SEQ ID NO6)肽在不同细胞系中的细胞内输入活性。如在图2中所示，CB5005(SEQ ID NO4)对于检测的所有细胞系包括DU145和PC3癌细胞、雄激素-依赖性LNCaP癌细胞和成神经细胞瘤N2a细胞都是细胞-透过性的。
CB5005(SEQ ID NO4)的细胞输入也是浓度-依赖性的。然而，CB5003(SEQ ID NO3)表现出弱得多的输入活性，而CB5002在这种细胞输入检测中是没有活性的。由于这两种肽共有相同的CPS，所以CB5007表现出同CB5005(SEQ ID NO4)相似的输入活性。
这种间接的免疫荧光检测还用来定量肽的细胞输入。简要地，将在96孔平板上生长的细胞用肽处理不同的时间阶段，然后使用上文所述的抗肽抗体和FITC-标记的抗兔抗体进行间接的免疫荧光检测。然后，将细胞用10％SDS裂解，并且通过CytofluorTM2300读数仪(Millipore)在485/560nm处定量可溶细胞溶液中的荧光。荧光读数通过从肽-未处理样品的背景读数中减去所述荧光而计算。数据表示为在一式四份样品中进行的3次独立实验的平均值±SEM。通过使用这种定量法，研究输入的CB5005肽(SEQ IDNO4)的动力学。观察到时间-依赖型荧光累积(628.00±75.60(1h)，737.33±37.10(4h)，和1,042±58.40(20h))，这表明CB5005肽(SEQ ID NO4)在胞内区室中的相对稳定性，CB5005肽由抗肽抗体识别。
核提取物的蛋白质印迹分析将PCA细胞在60-mm盘中生长至70-80％汇合。将细胞与不同浓度的肽在37℃温育30min，然后在37℃用TNF-α(10ng/ml)再处理1h，如指示那样，或者只与肽一起温育16个小时。处理后，将细胞用冰冷的PBS洗涤，并且在冰上在500ml缓冲液A(10mM HEPES，pH7.9，10mM KCl，0.1mMEDTA，0.1mM EGTA，0.4％乙基苯基聚乙二醇，1mM DTT，0.5mM PMSF和1mg/ml每种亮肽素、抑肽酶、胃酶抑素、抑糜蛋白酶素和止痛剂)中裂解10min。通过高速离心而沉淀核，并且将核用500ml缓冲液A洗涤。然后，将核重悬在40ml缓冲液B(20mM HEPES，pH7.9，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM PMSF和1mg/ml每种亮肽素、抑肽酶、胃酶抑素、抑糜蛋白酶素和止痛剂)中。使用Pierce BCA蛋白检测法确定核提取物的蛋白浓度，并且使用缓冲液B使得样品间浓度相等。
将等量的蛋白在2x SDS样品上样缓冲液中在100℃热处理5分钟，并且通过10％SDS聚丙烯酰胺电泳分离。将蛋白转移到硝基纤维素纸上。用在TBS(10mM Tris-HCl，pH7.6，70mM NaCl和0.05％Tween 20)中的5％脱脂奶粉封闭30分钟后，通过使用抗-p50 IgG抗体(1∶5000)，(Upstate，LakePlacid，NY)而检测核NFκB p50。通过使用制造者流程中所述的ECL蛋白质印迹系统(Pierce，Rockford，IL)，用辣根过氧化物酶-偶联的二级抗体显现一级抗体。
抑制NF-κB核易位和在人前列腺癌细胞中的活化DU145是一种表现组成型NF-κB活化的雄激素-不依赖性前列腺癌细胞系，所述NF-κB活化可以通过TNF-α处理而进一步增强。一种雄激素-依赖性细胞系LNCaP没有表现出组成型NF-κB活化，但是NF-κB活化可以由TNF-α处理而刺激。NF-κB活化通常导致其快速地输入到核内。因此，在核提取物中的NF-κB蛋白质印迹分析用来评估NF-κB活化的程度。相对于对照，在DU145(图3a)和LNCaP两种细胞中，功能性连接到NF-κB p50NLS上的CB5005(SEQ ID NO4)和CB5003(SEQ ID NO3)抑制TNF-α诱导的NF-κB核易位。具有突变NLS的对照肽CB5007(SEQ ID NO6)在每种细胞系中都没有抑制作用。CB5005(SEQ ID NO4)也抑制NF-κB的组成型活化(图3b)。
通过使用特异的NF-κB p50抗体进行酶联免疫检测(ELISA)而测定NF-κB与编码κB识别位点的双链寡核苷酸的结合，而量化这些肽对前列腺癌细胞中NF-κB功能性活性的抑制作用。相对于肽-未处理的细胞，来自肽-预处理DU145细胞的核提取物表现出显著更低的NF-κB结合活性，这证实这些肽在DU145细胞中抑制TNF-α诱导的和组成型NF-κB核易位。
荧光显微镜将DU145细胞在4孔腔式载玻片上生长到70-80％汇合。然后，在37℃，将细胞用CB5005肽(SEQ ID NO4)(30μM)或稀释剂处理30min，然后用顺铂(5μg/ml)再处理5h。处理后，将细胞用结合缓冲液洗涤，并且按照制造者流程(BD Biosciences，San Diego，CA)建议的那样，在室温下在暗处在含有膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭(PI)的结合缓冲液中重悬15min。将腔式载玻片在Poly/mount(Polysciences，Warrington，PA)中封固，并且使用×100油浸镜头用荧光显微镜(Microstar IV，Reichard，Buffalo，NY)进行分析。彩色成像用Pixera数码相机分析，并且以JPG格式保存。
TUNEL检测将DU145细胞在8孔腔式载玻片上生长到70-80％汇合。然后将细胞用不同浓度的肽或稀释剂在37℃温育30min，然后用顺铂(5μg/ml)或稀释剂再处理16h。将细胞在空气中干燥，并且在室温下在4％低聚甲醛中固定1h。然后用PBS洗涤细胞，并且在冰上用渗透性溶液(0.1％Triton X-100，在0.1％柠檬酸钠中)渗透2min。按照制造者的用法指导使用TUNEL方法“原位细胞死亡检测”(Roche，Indianapolis，IN)，检测程序性细胞死亡。在×40放大下，通过使用抗荧光素抗体缀合的POD(过氧化物酶)，在光学显微镜(Microstar IV，Reichard，Buffalo，NY)下，显现由于程序性细胞死亡引起的荧光-标记的DNA链裂口。成像使用Pixera数码相机进行分析。
流式细胞分析将PCA细胞在60-mm盘上生长至50-60％汇合。将这些细胞用不同浓度的肽在37℃温育30min，然后用TNF-α(10ng/ml)、顺铂(2-30μg/ml)、依托泊苷(2-20μg/ml)或稀释剂在37℃再温育21h。通过它们结合膜联蛋白V的能力而测定在凋亡细胞上暴露的磷脂酰丝氨酸。具体地，将细胞通过胰蛋白酶消化收集。将胰蛋白酶化的细胞、培养基和PBS洗液组合在一起，并且通过离心收集细胞。将收集的细胞用结合缓冲液洗涤，并且按照制造者流程(BD Biosciences，San Diego，CA)所建议那样，在室温在暗处在70ml含有膜联蛋白V-FITC和PI的结合缓冲液中重悬15min。染色的细胞用流式细胞术进行分析。对于每种样品测定最少20,000个事件。
CB5005 (SEQ ID NO4)肽对诱导雄激素-不依赖性PCA细胞的程序性细胞死亡以及化学治疗剂杀伤这些癌细胞的敏感性和增强性的作用CB5005(SEQ ID NO4)肽剂与顺铂一起用来处理雄激素-不依赖性DU145细胞。在不存在CB5005(SEQ ID NO4)时，顺铂(5μg/ml)在诱导DU145的程序性细胞死亡中无效，这通过基于膜联蛋白V/PI的荧光显微镜分析而确定(图4)，其中程序性细胞死亡的早期阶段可以通过从凋亡细胞内部释放的在细胞膜外部的膜联蛋白V-FITC-结合的磷脂酰丝氨酸(PS)而检测。然而，当DU145细胞用CB5005(SEQ ID NO4)肽和顺铂共同处理时，诱导了程序性细胞死亡，这通过强烈的膜联蛋白V-FITC染色而证明(图4)。CB5005(SEQ ID NO4)的这种协同活性得到不同的程序性细胞死亡检测——TUNEL检测的证实，TUNEL检测优先标记在程序性细胞死亡过程中产生的DNA链裂口(图5)。CB5005(SEQ ID NO4)的这种敏化活性是浓度依赖性的，在20μM浓度达到最大(图5)。有趣地，用单独的CB5005(SEQID NO4)处理细胞也诱导了低水平的程序性细胞死亡，这表明组成型NF-κB活化负责维持DU145肿瘤细胞的生长(图5)。CB5003(SEQ ID NO3)，但不是CB5002(SEQ ID NO5)也不是CB5007(SEQ ID NO6)，也是有活性的，尽管与CB5005(SEQ ID NO4)相比是低得多的水平(图6)。这些结果综合起来表明CB5005(SEQ ID NO4)是一种能够使得雄激素-不依赖性前列腺癌DU145细胞对抗癌药物的杀伤性敏感的有效药剂。
CB5005(SEQ ID NO4)使得晚期前列腺癌DU145细胞对顺铂杀伤性敏感的能力通过流式细胞术测定细胞的膜联蛋白V/PI标记水平而定量。将DU145细胞用单独的顺铂、单独的CB5005 (SEQ ID NO4)处理，或者用CB5005(SEQ ID NO4)和顺铂共同处理(图7)。尽管顺铂处理(5μg/ml)是无效的，并且CB5005(SEQ ID NO4)处理(30μM)是部分有效的，但是这两种药剂的共同处理显著地诱导了DU145癌细胞中的程序性细胞死亡(图7)。此外，CB5003(SEQ ID NO3)是有活性的，但是与CB5005(SEQ IDNO4)相比活性在小得多的程度上(图8)。CB5002(SEQ ID NO5)，一种CB5003(SEQ ID NO3)的对照肽，在这些基于程序性细胞死亡的实验中没有表现出显著的作用(图8)。最后，CB5005(SEQ ID NO4)还能够使得DU145细胞对TNFα诱导的程序性细胞死亡敏感(图9)。
CB5005 (SEQ ID NO4)或CB5003(SEQ ID NO3)在增强顺铂诱导的程序性细胞死亡中的协同活性是浓度依赖性的(
图10a)。与只用顺铂处理的那些癌细胞相比，在CB5005(SEQ ID NO4)/顺铂的情形中，30μMCB5005 (SEQ ID NO4)的共同处理在DU145细胞中刺激了大约15倍增加的程序性细胞死亡。当顺铂剂量从5μg/ml减少到2μg/ml时，CB5005(SEQID NO4)肽的这种协同活性没有很大地改变(
图10b)。有趣地，单独的CB5005(SEQ ID NO4)处理(无顺铂)在刺激这些肿瘤细胞的程序性细胞死亡中也是相当有活性的(
图10b)。
使用依托泊苷，晚期PCA细胞对其表现出抗性的另一种抗癌药物，观察到甚至更大的CB5005(SEQ ID NO4)协同活性(
图11)。通过对用依托泊苷(2μg/ml)和CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)共同处理21h的DU145细胞进行流式细胞术分析，检测到高百分数的凋亡细胞(几乎达60％)(
图11)。
综合来看，这些实验数据清楚地证明，与高剂量(20-30μg/ml)单独使用这些抗癌药物处理相比，用CB5005(SEQ ID NO4)和顺铂或依托泊苷(2μg/ml)共同处理DU145细胞在诱导PCA细胞的程序性细胞死亡中有效得多。
体外细胞毒性检测将LNCaP，DU145，PC3或成神经细胞瘤N2a细胞在96孔平板上生长至60％汇合。在总体积为100μl无血清的RPMI中在37℃一式四份进行用不同浓度的肽处理24h。然后洗涤所述细胞，并且在37℃用100μl含有20μlCellTiter 96 AQueous Solution试剂(Promega，Madison，WI)的无RPMI的酚红温育1h。使用微量平板自动读数仪EL 309(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)读取490nm处的每个孔的吸收。所述吸收直接反映了活细胞数目。从所有数据中减去空白。然后，使用Prism软件(GraphPad SoftwareInc.，San Diego，CA)分析所述数据，并且将其表示为3次独立实验的平均值±SE。通过单向ANOVA进行统计学显著性，并且如果p＜0.05认为是显著的。
CB5005’s(SEQ ID NO4)对雄激素-不依赖性PCA细胞协同活性的特异性为了确定CB5005(SEQ ID NO4)诱导PCA细胞程序性细胞死亡的活性是否对雄激素-不依赖性细胞特异，本发明人检验了这种肽对雄激素-依赖性LNCaP细胞的作用，所述LNCaP细胞不表现组成型NF-κB活化。如在
图12a中所示，CB5005(SEQ ID NO4)使得雄激素-不依赖性PC3细胞对依托泊苷-诱导的程序性细胞死亡敏感，但是没有使得雄激素-依赖性LNCaP细胞对依托泊苷的促凋亡作用敏感。MTS细胞毒性检测的结果也表明，CB5005(SEQ ID NO4)对于LNCaP细胞是没有毒性的(
图12b)。此外，所述结果表明，CB5005肽(SEQ ID NO4)处理没有导致对成神经细胞瘤N2a细胞的毒性(
图12b)。综合看来，所述结果表明，CB5005的促凋亡活性是针对特征在于组成型NF-κB活化的雄激素-不依赖性前列腺癌细胞特异的。
荧光分光光度法胱天蛋白酶3定量将PC3细胞在60-mm盘上生长至90％汇合。然后，将细胞在37℃用CB5005(SEQ ID NO4)处理30min，之后用依托泊苷(5μg/ml)或稀释剂处理16h。处理后，将细胞通过胰蛋白酶消化而收集。将胰蛋白酶化的细胞、培养基和PBS组合在一起，并且通过离心收集细胞。将收集的细胞在冰上在胱天蛋白酶3缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.2，150mM NaCl，1％Triton X-100，1mM DTT)中裂解30min。将等量的蛋白在室温下用2×胱天蛋白酶反应缓冲液(100mM HEPES，pH7.5，10％蔗糖，0.1％CHAPS，0.2％BSA，新鲜添加10mM二硫苏糖醇和作为底物的50μM Asp-Glu-Val-Asp氨基甲基香豆素(DEVD-AMC))温育。样品在380nm处激发，并且在Cytofluor2300(Millipore，Bedford，MA)中在460nm处读取。相对荧光通过从样品荧光中减去空白荧光(只有缓冲液加上底物)而计算。
数据表示为平均值±SEM。通过斯氏t检验而进行统计学显著性，并且如果p＜0.05认为是显著的。
胱天蛋白酶-3参与CB5005-诱导的程序性细胞死亡当用CB5005(SEQ ID NO4)和依托泊苷处理时，PC3细胞中，胱天蛋白酶-3活性升高了(
图13)，这表明CB5005(SEQ ID NO4)在PCA细胞中的促凋亡作用包括效应子胱天蛋白酶-3的作用。
在增强由细胞毒性药剂诱导的PCA细胞程序性细胞死亡方面，CB5005(SEQ ID NO4)比SN50更有效。
SN50，一种目前用于许多科学研究的商购26-mer肽，已经在许多类型的细胞中表现出抑制NF-κB核易位的功效。在程序性细胞死亡检测中，诸如TUNEL检测(其优先标记在程序性细胞死亡过程中产生的DNA链裂口)和流式细胞术分析(其定量地测定膜联蛋白V/PI标记的凋亡细胞的水平，如
图15所示)，本发明人逐一进行了CB5005肽(SEQ ID NO4)与SN50的比较。在这两种检测中，在促进顺铂-诱导的雄激素-不敏感PCA细胞的程序性细胞死亡中，CB5005(SEQ ID NO4)表现出比SN50显著更强的活性。
CB5005(SEQ ID NO4)表现出比SN50更高的细胞输入活性为了确定CB5005肽(SEQ ID NO4)在PCA细胞中更高的凋亡活性是否至少部分是由于它的更高的细胞膜-易位活性，在使用间接免疫荧光检测的细胞输入研究中，本发明人逐一进行了CB5005肽(SEQ ID NO4)与公知的细胞透过性SN50肽的比较。如在
图16中所示，CB5005(SEQ ID NO4)表现出比SN50肽显著更高的输入活性。
序列表<110>切尔泰克生物科学有限公司林耀忠克劳迪亚布杜<120>增加癌细胞程序性细胞死亡的组合物和方法Cells<130>CB001<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>6<212>PRT<213>合成的肽<220>
<221>肽<222>(1)..(6)<400>1Leu Ala Leu Ala Leu Ala1 5<210>2<211>11<212>PRT<213>合成的肽<220>
<221>肽<222>(1)..(11)<400>2Lys Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala1 5 10<210>3<211>16<212>PRT<213>合成的肽<220>
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<221>肽<222>(1)..(21)<400>6Lys Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Val Gln Arg Asn Gly1 5 10 15Gln Lys Leu Met Pro20
权利要求
1.一种多肽，其包括a)大约6-大约50个残基的细胞透过性肽，其包括至少SEQ ID NO1的6个连续残基，和b)NF-κB核定位序列。
2.权利要求1的多肽，其中所述NF-κB核定位序列包括NF-κB p50。
3.一种多肽，其包括a)大约11-大约50个残基的细胞透过性肽，其包括至少SEQ ID NO2的11个连续残基，和b)NF-κB核定位序列。
4.权利要求2的多肽，其中所述NF-κB核定位序列包括NF-κB p50。
5.一种大约11-大约50个氨基酸的细胞透过性肽，其包括SEQ ID NO2。
6.一种大约11-大约50个氨基酸的细胞透过性肽，其包括SEQ ID NO1。
7.一种抑制细胞中NF-κB核易位的方法，其包括给细胞施用有效量的包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或其组合的肽。
8.一种用于与组成型NF-κB活化相关的癌症的治疗系统，所述系统包括治疗有效量的a)包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或其组合的肽，和b)在肿瘤细胞中诱导程序性细胞死亡的化学治疗剂。
9.权利要求8的化学治疗系统，其中所述化学治疗剂包括依托泊苷或顺铂。
10.一种用于治疗雄激素-不依赖性前列腺癌的方法，所述方法包括给需要其的受试者施用治疗有效量的至少一种抑制癌细胞中NF-κB组成型活化的肽，与化学治疗剂一起施用。
11.权利要求10的方法，其中所述至少一种肽包括SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SN50或它们的组合。
全文摘要
本发明提供在癌细胞中抑制抗凋亡过程促进肿瘤细胞死亡的细胞透过性肽和肽剂，以及提供治疗性癌症治疗的方法。组合物可以与常规化学治疗剂组合递送，以提供显著增加所述化学治疗剂破坏癌细胞的功效的协同作用。本发明还提供用于癌症治疗的试剂盒或系统，其包括至少一种抑制NF－κB抗凋亡作用的肽剂，和至少一种刺激细胞凋亡途径的化学治疗剂。
文档编号A01N37/18GK101090730SQ200580038257
公开日2007年12月19日 申请日期2005年11月9日 优先权日2004年11月9日
发明者林耀忠, 克劳迪亚·布杜 申请人:切尔泰克生物科学有限公司