专利名称：诊断胎儿细胞和癌细胞的非侵入性方法
诊断胎J L细胞和癌细胞的非侵入性方法
与相关申请的交叉引用本申请要求35 U.S.C § 119(e)下的2006年11月14日提交的系列号 为60/865,796以及2006年3月13日提交的系列请号为60/781,888的美国临时 申请的权益。
祖旦 NT豕本发明说明书所引用的所有参考文献及它们的参考文献，在此以适 合于附力喊可选择的细节、特征和/或技术背景教导的方式并A^发明作为参考。 发明领域此处在实施方案中公开了用于确定妊娠女性的胎儿参数以及用于基 于端粒标记在细胞群体中检测已分化细胞的非侵入性(non-uwasive)方法。在 一个实施方案中，诊断是基于分离自母体血液样品的胎儿细胞来完成的，其采 用胎J L端粒结构作为胎J L细胞的标识。 相关技术的描述端粒是染色体末端的结构成分并由特殊的DNA-蛋白质复合物形成 (Blackburn E.H. 1994 Cell Jun3;77(5):621-3)，其包含非编码DNA重复并且是染 色体稳定性以及细胞衰老所必需的。脊椎动物细胞中的端粒DNA由富含G的 六核苷酸重复TTAGGG组成(Moyas等1988 Proc. Natl Acad Sci. USA 85 6622-6626)并通过端粒结合蛋白折叠成环结构(Griffith等1999 Mammalian Telomers end in a large duplex loop. Cell, May, 14,97(4) 503-514)。端粒显示出3131 保护不受不当的重组和染色体随机的末端-末端融合以及防止细胞分裂中染色体 的DNA不完全复制来保持染色体的完整性。与培养物中人体细胞复制相关的端粒重复的损失已证明端粒充当着 "有丝分裂钟"，细胞的衰老和生物的老化，且端粒的长度是细胞复制历史的生 物标记，其被遗传因素和性别所修饰。例如，在人中，复制中的体细胞的端粒 长度与供体年龄成反比(Vaziri等1993 Loss of Telomeric DNA during Aging of Normal and Trisomy 21 Human Lymphocytes, Amer. J. Hum. Genet. 52:661 ~667;Slagboom等1994 Genetic determination of telomere size in humans: a twin study of three age groups, Amer. J. Hum. Genet. Nov., 55(5): 876-882, and Okuda等.2000 Telomere attrition of the human abdominal aorta: ... Atherosclerosis Oct.; 152(2): 391-398);在同年龄的供体中高度可变(Vaziri等1993，同前;Slagboom等1994, 同前，以及Okuda等.2000同前)；高度可遗传的(Slagboom等1994,同前，以 及Jeanclos等，2000 Telomere length inversely correlates with pulse pressure... Hypertension 36: 195-200)并且在女性中长于在男性中(Jeanclos等.2000 Hypertension 36: 195-200,以及Benetos等.2001 Telomere length as an indicator of biological aging:... Hypertension 37: 381-385)。端粒的长度己被用作细胞分裂的分 析工具并用于分析谱系或前体-产物关系和细胞分裂速率(Rufer等.1998 Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow
cytometry, Nat. Biotechnol.; Rufer等1999 Telomere fluorescence measurement in granulocytes and T lymphocyte subset point to a high turnover of hematopoietic stem cells and memory T cells in early childhood^ J. Exp. Med, Jul. 19; 190(2): 157-167,以
及Son等2000 Lineage-specific telomere shortening and unaltered capacity for telomerase expression in human T and B lymphocytes with age, J. Immunol 165:
1191-1196)。已ffljl荧光原位杂交证明了人血液细胞各种亚群中的年龄相关的端
粒縮矢豆(Baeniocher等Telomere length measurement by fluorescence in situ hybridization and flow cytometry: tips and pitfalls, Cytometry 47: 89-99,2002)。在细胞转化后，当端粒过度縮短时，染色体末端变得不稳定并互相 融合，从而导致断lS虫合-桥循环(BFB)。已发现端粒縮短在许多癌症，包括 前列腺癌、胰癌以及乳腺癌损伤中是一种普遍的变化(Meeker等,2004 Telomere
Length Abnormalities Occur Early in the Initiation of Epithelial Carcinogenesis:
CMcalCancerResearch, 10: 3317-3326)。然而，长的端粒长度与其它的癌症诸如 结肠直肠癌的预后不良相关(Cancer2006,106:541 -551)。已发现高剂量的化学 疗法在一些癌症，例如乳腺癌中，加速某些细胞诸如造血干细胞的端粒长度损
失(Schr6der等."Telomere length in breast cancer patients before and after chemotherapy with or without stem cell transportation," 2001 British J. of Cancer 84:已证明人子宫内生活期间的端粒长度是高度同步的，表现为其在相
1348- 1353)。同胎儿的组织间是相似的，但在胎儿间可以是变化的(Youngren等.1998 Synchrony in telomere length of the human fetus, Hum. Genet Jun, 102(6): 640-643 )。
然而，看起来男性新生儿与女性新生儿(出生时)的端粒长度之间没有差异 (Okuda等.2002 Telomere length in the newborn, Sep, 52(3): 377-381)。目前用于子宫内胎儿诊断的方法包括侵入性技术诸如羊膜腔穿刺 术，其中流体从发育中的胎儿的羊膜囊取出。尽管这个程序广泛应用，但在某 些瞎况下，其可以导致胎儿损伤和/或流产。由于胎儿不定时间段地重复暴露于 超声波辐射，孕妇们关注发育期间柳台儿的重复的声波图。 一些人认为声波图 中用于成像胎儿的超声波辐射可潜在地导致以后生活中的问题。因此，需要新 的且更精确的非侵入性胎儿诊断技术以保护妊娠女性和胎儿。已知众多的用于确定端粒长度的方法包括，通过DNA印迹测量 (Satillo-Pineiro等，"Telomerase activity and telomere length in primary and metastatic tumors from pediatric bone cancer patients," 2004 Pediatric Res. 55(2): 231 -235)、以及单独的荧光原位杂交斑点计数(Schulze等"Telomere Length Measurements" April 2000, Proc. First Euroconference on Quantitative Molecular Epiginetics)或与流式细胞术相结合(Suleman, S. "Telomere Length Analysis as a Novel Diagnostic Test for Bladder Cancer," Enq. J. interdisciplinary Studies for High School Students, 1(1): 1-5, 2003)。这样的系统通常被设立用于检测两个预先选择 的细胞群体间的端粒长度差异，因而不能提供允许从处于其环境内的其它正常 细胞中区分极少见的癌细胞的有力系统。已知许多用于辅助样品显微镜术分析的方法。例如，不受限制的， 已知某些染料对某些细胞结构具有亲和性。这样的染料因而可以通过帮助进一 步地阐释这样的结构而用于辅助分析。细胞和组织的荧光显微镜术是本领域公知的。已开发了在显微镜下 成像荧光染色的细胞以及提取这些细胞中有关空间分布和时间变化信息的方 法。 一些这样的方法及其应用在Taylor等人的文章(American Scientist 80 ( 1992), 第322-335页)中有描述。这些方法被设计以及最优化用于少数样品的制备， 所述的样品用于细胞中荧光报道分子的分布、量以及生化环境的高空间和时间 分辨率的成像测量。荧光信号检测可以经由落射荧光显微镜进行，所述落射荧 光显微镜使用发射的荧光以形成图像。落射荧光显微镜的激发光用于激发样品中的荧光标志，从而导致荧光标志^M荧光。落射荧光显微镜的优点是，样品 可以以使得荧光分子优先附着于目标生物结构的方式制备，从而允许鉴定这样 的目标生物结构。首字母缩略词"FISH"涉及使用发色团标志(荧光团)的技术，所述 发色团标志如果被 光照射则鄉第二信号以检测染色体结构。FISH j顿仅 仅结合它们与之显示高度序歹湘似性的那些染色体部分的荧光探针。这样的标 志可以被导向至特异的染色体和特异的染色体区域。这种探针必须足够长以特 异杂，期巴(并且不杂交至基因组中的相1,列)，但不能太大以致于阻碍杂 交过程，并且其应当以荧光团直接标志。这可以以各种方式完成，例如采用标 志的核苷酸的切口平移或PCR。如果信号放大必须皿显微镜的检测阈值(其 依赖于许多因素诸如探针标记效率、探针以及荧光染料的类型)，那么第二荧光 标志的抗体或链霉抗生物素蛋白结合至标志分子，从而放大了f言号。 FISH技术可用于染色体异常的鉴定和基因作图。例如，21号染色 体的FISH探针允许人们"钓"那些具有导致唐氏综合症的21三体、额外的21号 染色体的细胞。包含了多色DNA探针的FISH试剂盒是市场上可买到的。诊断性FISH斑点计数常规地是由熟练〈顿显微镜的工作人员人工 执行的。除正确地鉴别斑点及其颜色外，其它的大小和形状特性必须加以归类 以正确鉴别染色体的状态。由现象所施加的时间约束使得分析更困难。使用显 微镜的工作人员因而必须进行训练以执行检查。即使是在最好的条件下，这个 过程也被证明是乏味、冗长以及容易发生人为错误的。自动化的显微镜术的应用具有克服人工方法的许多缺点的潜力。自 动化显微镜可以总是及时地可靠地鉴别样品中的荧光点，正确地确定它们的颜 色，基于它们的形状和大小归类，，行必要的总结分析以确定没有不可避免 的由At喿作者而弓i入的主观因素的目标状况存在与否。目前没有可用于确定发育中胎儿的端粒长度的技术和/或信息。也缺 乏不需要费力地分离细胞或劳动密集的细胞分类的从样品中其它细胞检测癌细 胞的方法。我们在此提供了荧光原位杂交后自动^t测端粒长度的方法。
鹏在本发明的实施方案中，公开了用于诊断胎儿细胞的方法，所述的 方法包括以下步骤从妊娠女性分离血液样品；从所述的血液样品中分离胎儿细胞；并通过应用设计用于杂交端粒末端的端粒核酸探针来确定端粒长度以鉴 定胎儿细胞。在一个实施方案中，提供了使用任意妊娠阶段的材料血液以诊断胎
儿细胞的方法。该方法包括从妊娠女性分离血液样品；从所述的血液样品中 分离胎J L细胞；并iffil应用端粒核酸探针的原位杂交技术鉴别所述的胎卩L细胞。 鉴别的胎儿细胞参数可被测量，例如，以允许人们确定胎儿的发育年龄。在另一个实施方案中，公开了用于检测分布于大量正常细胞中的癌 细胞的方法，包括:从病人获得组织样品；〗妙万述组织样品中的细胞染色体DNA 与包括端粒DNA、 RNA禾口/或PNA的核酸探针采用荧光原位杂交(FISH)的 条件杂交以获得处理的样品；并在进行编程以运行下述的自动显微镜系统上分 析所述处理的样品
自动搜寻有关所述处理的样品的光学视野以检测表示所述核酸探针结合至 染色体端粒DNA的荧光信号来鉴别端粒；
在所述处理的样品的其它细胞中鉴别出具有明显不同的染色体端粒DNA 的细胞；
将所述己鉴别具有明显不同染色体端粒DNA的细胞与预先确定的指示处 于癌性状态的细胞的端粒DNA结合标准相比较;并且输出涉及是否检测出癌性 状态的信息。
详述在此所阐明的实施方案中，公开了采用荧光原位杂交(FISH)方法 检测和测S/定量端粒长度，以及采用自动检测显微镜检测和监控荧光信号的存 在的系统。在一个实施方案中，提供了诊断胎儿细胞的方法，该方、 ^a括这些
步骤(a)从妊娠女性分离血液样品；(b)从血液样品中分离胎儿细胞；以及 (c)通过使用设计用于杂交端粒末端的端粒核酸探针确定端粒长度以鉴定胎儿 细胞。当要判定胎儿细胞组织来源的胎儿的发育年龄时，人们可以通i^见察端 粒长J^t其进行确定。检测和定量可以用作鉴别母体血液样品中的胎儿细胞的附加的胎 儿细胞标记。在一个实施方案中，细胞的染色体端粒长度可与胎儿血红蛋白检 测相组合。可以使用原位杂交技术，并且核酸探针杂交至样品细胞中染色体DNA的检测可Mili十算机化自动化显微镜(computerized robotic microscope)增
强。在这个实施方案中，母体血液中的胎儿细胞检测可用于显著地提高母体血 液样品中具核红细胞的鉴另嗷率。胎儿细胞的鉴别和确定也可以通过分离自母体血液样品的具核胎 J L细胞染色体末端端粒长度的测量来完成，所述的测量采用至少一个用荧光标 记进行标记的特异端粒DNA探针以及胎J L特异性检测探针，诸如胎J L血红蛋白采用原位杂交的端粒长度定量可用作为鉴别成年细胞群体中胎儿 细胞的标记。母体循环中的胎儿细胞检测是非常理想的，并形成一种成功产前 诊断的低风险的方法。端粒的测量可通过采用快速检测系统实施并在荧光计算 机化自动化显微镜下分析。从母体血液样品中获得的数据与对照样品数据进行 比较。在一个实施方案中，胎儿细胞以及特别是胎儿起源的具核红细胞的 鉴定采用存在于细胞中的区别特征(诸如细胞内细胞核的存在的鉴定以及血红 蛋白Y的存在，与成熟母体红细胞中的血红蛋白a比较)来完成。甚至当供体血液样品来自于贫血成年个体时，本发明的方法也可以 检测胎儿细胞。在这个实施方案中，某些其血液细胞可表达显著水平的胎儿血 红蛋白的贫血患者可以用端粒探针筛选，以鉴定非常大的母体细胞群体中非常 稀少的胎儿nRBCs。在另外一个实施方案中，公开了一种用于检测分布于许多来自样品 组织(例如，血液)的正常细胞中的稀少的癌细胞的方法。在从病人获得组织 之后，组织样品采用用于检测样品组织中细胞染色体端粒长度差异的荧光原位 杂交程序来处理。该技术应用杂交至组织样品中细胞染色体DNA的端粒核酸探 针。所述包括用所选择颜色的荧光染料标志或标记的端粒DNA、脂A和/或PNA 的核酸探针应用于杂交技术中。杂K后，样品采用包括计算机程序的自动显 微镜系统进行分析，所述的系统自动地搜索有关所述样品的光学视野以检测荧 光信号。从样品中获得的荧光信号指示核酸探针与染色体端粒DNA的杂交并鉴 别样品细胞中端粒的存在。荧光探针的强度可以与存在于细胞中的端粒DNA长 度成正比地定量。当和预先确定的标准相比较时，与所述处理的样品中的其它 细胞具有显著不同的染色体端粒DNA长度的细胞可以被鉴定为，例如处于癌性状态。自动显微镜系统可以输出涉及是否检测到癌性状态的信息。
关于ffi^实施方案的声明尽管本发明已经特别地参考特定实M^案来显示和描述，但应当了 解，战公开的以及其它的特征和功能各种变化或其替代方案，可以适当地组 合为许多其它不同的系统或应用。同样，各种当前无法预料或不曾想到的备选 方案、修饰、变化或改进可以随后M31本领域技术人员完成，其也将被后面的 权利要求所包含。
权利要求
1、一种诊断胎儿细胞的方法，包括从妊娠女性分离血液样品；从所述的血液样品中分离胎儿细胞；采用标记的端粒核酸探针通过原位杂交鉴定胎儿细胞。
2、 权利要求l的方法，进一步地包括以血红蛋白Y探针杂交胎儿细胞。
3、 权禾腰求l的方法，其中所述的端粒核酸探针包括用荧光化合物标记的 DNA探针。
4、 权利要求1的方法，其中所述的DNA探针直接或间接地用荧光化合物 标记。
5、 权利要求l的方法，其中鉴定所述胎儿细胞题过定量结合至样品中胎 J L细胞的标记的端粒核酸探针所发射的信号来确定的。
6、 一种诊断胎儿细胞的方法，所述的方法包括以下步骤 从妊娠女性分离血液样品； 从所述的血液样品分离胎J L细胞；采用设计用于杂交端粒末端的端粒核酸探针通过确定端粒长度来鉴定胎儿 细胞。
7、 一种用于检测分布于大量正常细胞中的癌细胞的方法，包括 从病人获得组织样品；使所述组织样品中的细胞染色体DNA与包括端粒DNA、 RNA禾n/或PNA 的核酸探针4顿荧光原位杂交(FISH) ^f牛杂交以获得处理的样品；在进行编程以运行下述的自动显微镜系统上分析所述处理的样品自动搜索有关所述处理的样品的光学视野来检测指示所述核酸探针结合染 色体端粒DNA的荧光j言号以鉴定端粒；鉴定所述处理的样品中与其它细胞具有明显不同的染色体端粒DNA长度 的细胞；将所述鉴定的具有明显不同染色体端粒DNA的细胞与预先确定的指示处 于癌性状态的细胞的端粒DNA结合标准比较；并 输出涉及是否检观倒癌性状态的信息。
全文摘要
本发明提供了一种确定胎儿的发育年龄或检测癌细胞的非侵入性方法。该方法利用，例如来源于妊娠女性的血液样品以及端粒核酸探针。
文档编号C07H21/04GK101443345SQ200780008872
公开日2009年5月27日 申请日期2007年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者M·基尔佩崔克, P·奇普拉斯, T·P·塔法斯 申请人:伊康尼西斯公司