一种具有光热增强效应的金纳米星@硫化铜光热探针的制备方法及其应用与流程

本发明涉及纳米探针技术领域，采用籽晶生长法和异质生长法制备了一种具有光热增强效应的金纳米星@硫化铜光热探针，实现对癌细胞的靶向光热治疗。

背景技术：

癌症仍然是威胁最大和最具挑战性的疾病之一。据统计,2008年约760万人死于癌症，这一数字在2030年预计将达到1310万，人类与癌症的斗争还任重道远。近年来，纳米材料的光热疗法是生物医学领域内的一个研究热点，所谓的光热疗法是指利用纳米材料的强吸收效应，将入射光中的光子能量转换为热能或声子，产生局部高温，从而杀死其周围的癌细胞，达到癌症治疗的目的。硫化铜(cus)纳米材料作为新兴的光热治疗材料，是一种p型半导体材料，具有良好的光学和电学性质，已在光热治疗、药物传输、传感器、分子成像等领域得到广泛的应用。其优势在于:一方面，cus作为一种半导体纳米颗粒，具有制备工艺简单、颗粒尺寸较小、价格低廉、毒性较低等内在特征，非常适用于生物医学领域的研究和应用；另一方面，硫化铜纳米颗粒的光学吸收特性集中在近红外光(700-1100nm)波段，光热治疗过程中使用的正是对生物组织穿透能力较强的近红外光光源，可以有效降低生物组织对光的吸收，同时由于cus材料的吸收特性来源于其铜离子内部带隙间的d-d能级跃迁，其吸收波段基本不受外界介质的干扰，提高了其光学稳定性。基于以上两个原因，cus纳米颗粒被视为最具前景的纳米光热材料之一。近年来，硫化铜以其制备工艺简单、颗粒尺寸小、价格低廉、毒性低等优点被科研人员视为理想的光热探针的首选，但是硫化铜材料的光热转换效率相对偏低一直是科研人员的一块心病。

技术实现要素：

为了提高硫化铜纳米材料的光热转换效率，制备纳米金属与硫化铜的复合结构，本发明利用了纳米金属的局域表面等离子体共振(lspr)效应实现对硫化铜光热转换效率的提高。基于此，本发明的第一目的在于提供一种具有光热增强效应的金纳米星@硫化铜光热探针的制备方法。

本发明的另一目的在于提供所述方法制备的光热探针。

本发明的还一目的在于提供所述制备方法及其制备的探针在肿瘤治疗中的应用。

在本发明中通过液相方法制备了金纳米星@硫化铜的光热探针，基于金纳米星的局域表面等离子体共振效应增强硫化铜的光热转换效率，达到增强光热治疗的目的。复合光热探针基于纳米颗粒的强吸收效应可以实现癌细胞的光热治疗。利用金纳米星良好的生物特性提高复合探针的生物相容性。

本发明采用籽晶生长法与异质生长法制备金纳米星@硫化铜光热探针。首先利用水热方法制备小金纳米颗粒，对小金纳米颗粒用十六烷基溴化铵进行表面修饰；在十六烷基溴化铵修饰的小金纳米颗粒中加入硫代苯甲酸镍和铜盐，然后将混合溶液进行高温处理，得到金颗粒@硫化铜颗粒；然后以金颗粒@硫化铜颗粒为籽晶，通过籽晶生长法制备金纳米星@硫化铜复合结构；最后在复合结构表面进行交联剂的修饰以方便链接各种生物分子，得金纳米星@硫化铜光热探针。

具体地，本发明的方法包括以下步骤：

(1)小金纳米颗粒@硫化铜的制备:

向50ml质量分数为0.015mmol的氯金酸溶液中加入0.1ml-50ml浓度为1％的柠檬酸钠(或者硼氢化钠、抗坏血酸、四羟甲基氯化磷)溶液，反应10-360分钟后，得小金纳米颗粒；向反应溶液中加入10ml浓度为0.5m的ctab(十六烷基溴化铵)进行修饰；然后将硫代苯甲酸镍和铜盐加入到小金纳米颗粒中，然后将此混合物放入高压釜中，进行100-300摄氏度反应1至96小时，对制备的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒进行离心洗涤，溶解在20ml高纯水中；

(2)金纳米星@硫化铜复合结构的制备：

向50ml物质的量为0.02mmol的haucl4中加入4ml的步骤(1)所得小金纳米颗粒@硫化铜颗粒后搅拌5分钟，该溶液中混有50ulhcl溶液；然后加入硝酸银和0.025mol的抗坏血酸，反应1分钟后进行离心后备用；

(3)金纳米星@硫化铜光热探针的制备：

利用金纳米星@硫化铜复合结构表面的修饰基团与多种生物分子进行交联反应，得金纳米星@硫化铜光热探针。

优选的，所述小金纳米颗粒为金纳米球、金纳米棒、金纳米立方体、金多边形中的任意一种。

优选的，步骤(1)中所述硫代苯甲酸镍与氯金酸摩尔比为1:0.1至1:2；所述铜盐与硫代苯甲酸镍的摩尔比为1:0.3至1:10，铜盐可以是氯化铜、硫酸铜、硝酸铜。

优选的，步骤(2)中所述硝酸银与氯金酸的摩尔比为1：10至1：40。

优选的，所述修饰基团包括氨基基团、羧基基团等；所述生物分子包括抗体、dna片段和生物配体中的任意一种。

进一步地，本发明提供了所述方法制备的金纳米星@硫化铜光热探针光热探针。

更进一步地，本发明提供了所述金纳米星@硫化铜光热探针在癌细胞定向追踪，癌细胞的光热治疗中的应用。所述癌细胞包括所有恶性肿瘤细胞如乳癌细胞等。

有益效果

相对于传统的探针，此探针是光热增强型的光热探针，可以有效的定向杀死癌细胞，硫化铜自身的光热转换效应被增强，另外还提高了硫化铜的生物相容性。

(1)利用金纳米星的表面等离子体效应，实现对硫化铜光热转换效应的提高，相比于单独的硫化铜和金纳米星，复合探针的光吸收效应被增强。

(2)在复合探针中，基于金纳米颗粒良好的生物特性，提高了复合探针的生物相容性。

附图说明

图1金纳米星@硫化铜探针的应用示意图；

图2金纳米星@硫化铜复合探针的透射电镜图片；

图3复合探针及单独硫化铜、金纳米星的吸收光谱；

图4金纳米星@硫化铜光热探针对乳腺癌细胞的光热疗效；

图5是六个实施例得到的复合探针的吸收光谱图；

图6是六个实施例得到的复合探针的升温曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中所用的试剂均可市场购买得到。

压釜厂家：上海予名仪器设备有限公司，型号：100ml，工作温度：≤220摄氏度，工作压力：≤3mpa。

实施例1：

(1)小金纳米颗粒@硫化铜的制备:

向50ml物质的量为0.015mmol的的氯金酸溶液中加入1ml浓度为1％的柠檬酸钠溶液，反应20分钟后得到小金纳米颗粒，向反应溶液中加入10ml浓度为0.5m的ctab，然后将0.008mmol的硫代苯甲酸镍和0.003mmol的氯化铜加入到小金纳米颗粒中，然后将此混合物放入高压釜中，进行135摄氏度反应2小时。对制备的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒进行离心洗涤，溶解在20ml高纯水中。

(2)金纳米星@硫化铜复合结构的制备：

向50ml物质的量为0.02mmol的haucl4(混有50ulhcl溶液)中加入4ml的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒后搅拌5分钟，然后加入0.0005mmol的硝酸银和0.025mol的抗坏血酸，反应1分钟后进行离心后备用。

(3)金纳米星@硫化铜光热探针的制备

利用复合结构表面的氨基基团、羧基基团可以发生交联反应，从而实现对多种生物分子(抗体)的链接。37度环境下，将0.05mmol的抗体分子加入到0.005mmol的复合结构中，然后在37度下进行交联4小时，然后进行洗涤离心，最后在外界光场作用下，实现对癌细胞的荧光标记和光热治疗。

本发明制备的金纳米星@硫化铜光热探针结构示意图如图1所示；图中：黑色主体部分代表硫化铜，星状灰度部分代表金纳米星，外侧曲线代表功能基团。

金纳米星@硫化铜复合探针的透射电镜图片如图2所示。金纳米星和硫化铜的物理特性不同，在透射电镜中显示的灰度有所区别，图中深黑色部分是金纳米星，浅灰色色部分是硫化铜纳米颗粒，从图中可以看出复合探针是由金纳米星和硫化铜两部分组成的，复合探针实现了两者的有效结合。

复合探针及单独硫化铜、金纳米星的吸收光谱如图3所示，从图中可以看中复合探针的吸收强度要显著好于二者混合物和单独硫化铜、金纳米星，尤其在波长大于800纳米时。通过测量吸收谱线的吸收面积，可以得到复合探针的吸收强度是单纯硫化铜探针的3.7倍。

复合探针与硫化铜的光热杀灭癌细胞整体对比图如图4所示，a图为硫化铜的光热效果，b图示复合探针的光热效果。从图上可以看出复合探针杀灭癌细胞的情况明显好于硫化铜的光热效果。

实施例2：

(1)小金纳米颗粒@硫化铜的制备:

向50ml物质的量为0.015mmol的的氯金酸溶液中加入1ml浓度为1％的硼氢化钠溶液，反应20分钟后得到小金纳米颗粒，向反应溶液中加入10ml浓度为0.5m的ctab，然后将0.0015mmol的硫代苯甲酸镍和0.003mmol的氯化铜加入到小金纳米颗粒中，然后将此混合物放入高压釜中，进行135摄氏度反应2小时。对制备的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒进行离心洗涤，溶解在20ml高纯水中。

(2)金纳米星@硫化铜复合结构的制备：

向50ml物质的量为0.02mmol的haucl4(混有50ulhcl溶液)中加入4ml的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒后搅拌5分钟，然后加入0.0005mmol的硝酸银和0.025mol的抗坏血酸，反应1分钟后进行离心后备用。

(3)金纳米星@硫化铜光热探针的制备

利用复合结构表面的氨基基团、羧基基团可以发生交联反应，从而实现对多种生物分子(抗体)的链接。37度环境下，将0.05mmol的抗体分子加入到0.005mmol的复合结构中，然后在37度下进行交联4小时，然后进行洗涤离心，最后在外界光场作用下，实现对癌细胞的荧光标记和光热治疗。

实施例3：

(1)小金纳米颗粒@硫化铜的制备:

向50ml物质的量为0.015mmol的的氯金酸溶液中加入1ml浓度为1％的四羟甲基氯化磷溶液，反应20分钟后得到小金纳米颗粒，向反应溶液中加入10ml浓度为0.5m的ctab，然后将0.03mmol的硫代苯甲酸镍和0.003mmol的氯化铜加入到小金纳米颗粒中，然后将此混合物放入高压釜中，进行135摄氏度反应2小时。对制备的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒进行离心洗涤，溶解在20ml高纯水中。

(2)金纳米星@硫化铜复合结构的制备：

向50ml物质的量为0.02mmol的haucl4(混有50ulhcl溶液)中加入4ml的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒后搅拌5分钟，然后加入0.0005mmol的硝酸银和0.025mol的抗坏血酸，反应1分钟后进行离心后备用。

(3)金纳米星@硫化铜光热探针的制备

利用复合结构表面的氨基基团、羧基基团可以发生交联反应，从而实现对多种生物分子(如抗体)的链接。37度环境下，将0.05mmol的抗体分子加入到0.005mmol的复合结构中，然后在37度下进行交联4小时，然后进行洗涤离心，最后在外界光场作用下，实现对癌细胞的荧光标记和光热治疗。

实施例4：

(1)小金纳米颗粒@硫化铜的制备:

向50ml物质的量为0.015mmol的的氯金酸溶液中加入1ml浓度为1％的抗坏血酸溶液，反应20分钟后得到小金纳米颗粒，向反应溶液中加入10ml浓度为0.5m的ctab，然后将0.008mmol的硫代苯甲酸镍和0.003mmol的氯化铜加入到小金纳米颗粒中，然后将此混合物放入高压釜中，进行135摄氏度反应2小时。对制备的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒进行离心洗涤，溶解在20ml高纯水中。

(2)金纳米星@硫化铜复合结构的制备：

向50ml物质的量为0.02mmol的haucl4(混有50ulhcl溶液)中加入4ml的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒后搅拌5分钟，然后加入0.0001mmol的硝酸银和0.025mol的抗坏血酸，反应1分钟后进行离心后备用。

(3)金纳米星@硫化铜光热探针的制备

利用复合结构表面的氨基基团、羧基基团可以发生交联反应，从而实现对多种生物分子(如抗体)的链接。37度环境下，将0.05mmol的抗体分子加入到0.005mmol的复合结构中，然后在37度下进行交联4小时，然后进行洗涤离心，最后在外界光场作用下，实现对癌细胞的荧光标记和光热治疗。

实施例5：

(1)小金纳米颗粒@硫化铜的制备:

向50ml物质的量为0.015mmol的的氯金酸溶液中加入1ml浓度为1％的柠檬酸钠溶液，反应20分钟后得到小金纳米颗粒，向反应溶液中加入10ml浓度为0.5m的ctab，然后将0.008mmol的硫代苯甲酸镍和0.003mmol的氯化铜加入到小金纳米颗粒中，然后将此混合物放入高压釜中，进行135摄氏度反应2小时。对制备的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒进行离心洗涤，溶解在20ml高纯水中。

(2)金纳米星@硫化铜复合结构的制备：

向50ml物质的量为0.02mmol的haucl4(混有50ulhcl溶液)中加入4ml的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒后搅拌5分钟，然后加入0.001mmol的硝酸银和0.025mol的抗坏血酸，反应1分钟后进行离心后备用。

(3)金纳米星@硫化铜光热探针的制备

利用复合结构表面的氨基基团、羧基基团可以发生交联反应，从而实现对多种生物分子(如抗体、dna片段、生物配体等)的链接。37度环境下，将0.05mmol的抗体分子加入到0.005mmol的复合结构中，然后在37度下进行交联4小时，然后进行洗涤离心，最后在外界光场作用下，实现对癌细胞的荧光标记和光热治疗。

实施例6：

(1)小金纳米颗粒@硫化铜的制备:

向50ml物质的量为0.015mmol的的氯金酸溶液中加入1ml浓度为1％的四羟甲基氯化磷溶液，反应20分钟后得到小金纳米颗粒，向反应溶液中加入10ml浓度为0.5m的ctab，然后将0.008mmol的硫代苯甲酸镍和0.003mmol的氯化铜加入到小金纳米颗粒中，然后将此混合物放入高压釜中，进行135摄氏度反应2小时。对制备的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒进行离心洗涤，溶解在20ml高纯水中。

(2)金纳米星@硫化铜复合结构的制备：

向50ml物质的量为0.02mmol的haucl4(混有50ulhcl溶液)中加入4ml的小金纳米颗粒@硫化铜颗粒后搅拌5分钟，然后加入0.002mmol的硝酸银和0.025mol的抗坏血酸，反应1分钟后进行离心后备用。

(3)金纳米星@硫化铜光热探针的制备

利用复合结构表面的氨基基团、羧基基团可以发生交联反应，从而实现对多种生物分子(如抗体)的链接。37度环境下，将0.05mmol的抗体分子加入到0.005mmol的复合结构中，然后在37度下进行交联4小时，然后进行洗涤离心，最后在外界光场作用下，实现对癌细胞的荧光标记和光热治疗。

应用例

本发明针对6个实施例的得到的复合探针做了光热杀灭癌细胞的情况分析。癌细胞是人乳腺癌细胞mda-mb-231(商业购买)。

乳腺癌细胞mda-mb-231细胞的杀灭实验：将乳腺癌细胞生长到96孔培养板上，然后在37度下生长24小时，然后用pbs缓冲液对培养基冲洗三次，然后将连接有生物分子(如抗体)的复合探针和1.9ml的dmem(dulbecco'smodifiedeaglemedium)加入到培养基中，当培养基在37度下培养4小时后，对培养基用pbs缓冲液进行冲洗三次以除去未连接的复合探针。最后进行光热效应研究，所用激光器的波长是808nm，功率是2w/cm²。对于培养基中的癌细胞照射10分钟后，对细胞进行染色(使用双色试剂盒，橙红色代表死细胞，绿色代表活细胞)，并在奥里帕斯显微镜下进行观察并拍摄细胞图像。具体如图4所示，在b图片中明亮位置周围有大量碎片(实际是细胞膜的碎片)表示细胞已经凋亡，而无碎片表示细胞生存状况良好)。

如图5所示，从图中可以看到实施例1的吸收特性是最强的。如图6所示，从图中可以看到实施例1的升温曲线是最强的。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。