生产胶原的植物及其生成和使用方法

专利名称：生产胶原的植物及其生成和使用方法
技术领域：
和背景本发明涉及生产胶原的植物及其生成和使用方法。更具体而言，本发明涉及用于生成能够生产高水平羟基化胶原链的植物的新方法，所述胶原链能够形成天然的三股螺旋I型胶原纤维。
胶原是负责脊椎动物和许多其他多细胞生物的结构完整性的主要结构蛋白。I型胶原代表原型的纤维胶原，并且是大多数组织中的主要胶原类型。
I型胶原是骨和腱中占优势的胶原组分，并且大量发现于皮肤、主动脉和肺中。I型胶原纤维提供极大的抗张强度和有限的伸长性。I型胶原的最丰富的分子形式是由2种不同的α链[α1(I)]2和α2(I)组成的异源三聚体(Inkinen，2003)。所有纤维胶原分子都包含由重复的Gly-X-Y三联体构建的3种多肽链，其中X和Y可以是任何氨基酸，但通常是亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸。
形成原纤维的胶原作为包含球状N-和C-末端延伸前肽的前体前胶原而合成。前胶原的生物合成是牵涉多种不同的翻译后修饰的复杂过程，所述翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸羟基化、N-连接的和O-连接的糖基化以及链内和链间二硫键的形成。执行这些修饰的酶以协同的方式起作用以确保正确排列和热稳定的三股螺旋分子的折叠和装配。
每种前胶原分子由3种多肽链组成成分在粗面内质网内装配。因为多肽链共翻译地穿过内质网膜移位(translocate)，所以脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化发生在Gly-X-Y重复区域内。一旦多肽链完全移位到内质网腔内，C-前肽就折叠。3种前-α链随后经由其C-前肽结合以形成三聚体分子，从而允许Gly-X-Y重复区域在其C-末端形成成核点，确保链的正确排列。Gly-X-Y区域随后在C-至-N方向折叠以形成三股螺旋。
多肽链修饰和三股螺旋形成之间的时间关系是关键的，因为脯氨酸残基的羟基化是确保三股螺旋在体温下的稳定性必需的，一旦形成，三股螺旋就不再充当羟基化酶的底物。C-前肽(以及较少程度上的N-前肽)在前胶原通过细胞的过程中保持前胶原可溶(Bulleid等人，2000)。在前胶原分子分泌进入细胞外基质后或在这个过程中，通过前胶原N-和C-蛋白酶去除前肽，从而触发胶原分子自发地自身装配为原纤维(Hulmes，2002)。通过前胶原N-和C-蛋白酶去除前肽使前胶原的溶解性降低了＞10000倍，并且是发动胶原自身装配成纤维所必需和充分的。对这个装配过程关键的是在三股螺旋结构域末端被称为端肽的短的非三股螺旋肽，它确保原纤维结构内的胶原分子的正确记录，并降低自身装配的临界浓度(Bulleid等人，2000)。在自然中，胶原的三股螺旋结构的稳定性需要由脯氨酰-4-羟化酶(P4H)对脯氨酸的羟基化，以在胶原链内形成羟脯氨酸残基。
表达胶原链的植物是本领域已知的，参见例如，美国专利号6,617,431和(Merle等人，2002，Ruggiero等人，2000)。尽管植物能够合成包含羟脯氨酸的蛋白质，但与哺乳动物P4H相比，负责在植物细胞中合成羟脯氨酸的脯氨酰羟化酶显示出相对宽松的底物序列特异性，并因此只在Gly-X-Y三联体的Y位置包含羟脯氨酸的胶原生产需要植物共表达胶原和P4H基因(Olsen等人，2003)。
生产依赖于植物中天然存在的羟基化机制的人胶原的尝试得到了在脯氨酸羟基化方面弱的胶原(Merle等人，2002)。这种胶原在低于30℃的温度下熔解或失去其三股螺旋结构。胶原和脯氨酰-羟化酶的共表达产生稳定羟基化的胶原，它在生物学上与体温时的应用相关(Merle等人，2002)。
赖氨酰羟化酶(LH，EC 1.14.11.4)、半乳糖基转移酶(EC2.4.1.50)和葡糖基转移酶(EC 2.4.1.66)是在胶原翻译后修饰中牵涉的酶。它们序贯地将特定位置中的赖氨酰残基修饰为羟赖氨酰、半乳糖基羟赖氨酰和葡糖基半乳糖基羟赖氨酰残基。这些结构是胶原特有的并且是其功能活性必需的(Wang等人，2002)。单独的人的酶，赖氨酰羟化酶3(LH3)可以催化羟赖氨酸连接的碳水化合物形成中的所有3个连续步骤(Wang等人，2002)。
烟草中表达的人胶原的羟赖氨酸形成少于2％的在牛胶原中发现的羟赖氨酸(0.04％残基/1.88％残基)。这提示植物内源性的赖氨酰羟化酶不能充分地使胶原中的赖氨酸羟基化。
在将本发明变为实践的同时，本发明人揭示了胶原链的有效羟基化依赖于胶原链连同能够正确修饰这种多肽的酶的隔离。
发明概述根据本发明的一个方面，提供了在植物或被分离的植物细胞中生产胶原的方法，其包括在植物或被分离的植物细胞中，以能够使至少一种类型的胶原α链和外源性P4H积聚在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中的方式，表达至少一种类型的胶原α链和外源性P4H，从而在植物中生产胶原。
根据本发明的一个另外的方面，提供了根据下文描述的本发明的优选实施方案中进一步的特征，该方法进一步包括在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中表达外源性LH3。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链缺乏ER靶向序列或保留序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链表达于包含DNA的植物细胞器中。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H表达于包含DNA的植物细胞器中。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链是α1链。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链是α2链。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链包括C-末端和/或N-末端前肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，植物选自烟草、玉米、苜蓿、稻、马铃薯、大豆、番茄、小麦、大麦、低芥酸菜子(Canola)和棉花。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链或外源性P4H只在植物的部分中表达。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，植物的部分是叶、种子、根、块茎或茎。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H能够使至少一种类型的胶原α链的Gly-X-Y三联体的Y位置特异性羟基化。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H是人P4H。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，对植物实施应激条件。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，应激条件选自干旱、盐度、损伤、寒冷和喷射应激诱导化合物。
根据本发明的另一方面，提供了基因修饰植物或被分离的植物细胞，其能够积聚具有羟基化模式的胶原α链，所述羟基化模式与当胶原α链表达于人细胞中时产生的模式相同。
根据本发明的再一方面，提供了基因修饰植物或被分离的植物细胞，其能够在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中积聚胶原α链。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，基因修饰植物进一步包括外源性P4H。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链缺乏ER靶向序列或保留序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，至少一种类型的胶原α链表达于包含DNA的植物细胞器中。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H表达于包含DNA的植物细胞器中。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α链是α1链。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α链是α2链。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α链包括C-末端和/或N-末端前肽。
根据本发明的再一方面，提供了植物系统，其包括能够积聚胶原α1链的第一种基因修饰植物，和能够积聚胶原α2链的第二种基因修饰植物。
根据本发明的再一方面，提供了植物系统，其包括能够积聚胶原α1链和胶原α2链的第一种基因修饰植物，以及能够积聚P4H的第二种基因修饰植物。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，第一种基因修饰植物和第二种基因修饰植物中的至少一种进一步包括外源性P4H。
根据本发明的再一方面，提供了生产纤维胶原的方法，其包括(a)在第一种植物中表达胶原α1链；(b)在第二种植物中表达胶原α2链；其中在第一种植物和第二种植物中的表达被这样设置，从而使得胶原α1链和胶原α2链各自能够在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中积聚；和(c)使第一种植物与第二种植物杂交，并选择表达胶原α1链和胶原α2链的后代，从而生产纤维胶原。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，该方法进一步包括在第一种植物和第二种植物的每一种中表达外源性P4H。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α1链和胶原α2链中的每一种包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α1链和胶原α2链中的每一种缺乏ER靶向序列或保留序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，步骤(a)和(b)经由在包含DNA的植物细胞器中的表达来实现。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H表达于包含DNA的植物细胞器中。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α1链和胶原α2链中的每一种包括C-末端和/或N-末端前肽。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H能够使至少一种类型的胶原α链的Gly-X-Y三联体的Y位置特异性羟基化。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，外源性P4H是人P4H。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，对第一种植物和第二种植物实施应激条件。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，应激条件选自干旱、盐度、损伤、重金属毒性和寒冷应激。
根据本发明的再一方面，提供了生产纤维胶原的方法，其包括(a)在第一种植物中表达胶原α1链和胶原α2链，其中在第一种植物中的表达被这样设置，从而使得胶原α1链和胶原α2链各自能够在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中积聚；(b)在第二种植物中表达外源性P4H，其能够在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中积聚；和(c)使第一种植物与第二种植物杂交，并选择表达胶原α1链、胶原α2链和P4H的后代，从而生产纤维胶原。
根据本发明的再一方面，提供了核酸构建体，其包括置于在植物细胞中起作用的启动子的转录控制下、编码人P4H的多核苷酸。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，启动子选自CaMV 35S启动子、遍在蛋白启动子、rbcS启动子和SVBV启动子。
根据本发明的再一方面，提供了基因修饰植物或被分离的植物细胞，其能够表达胶原α1链、胶原α2链、P4H、LH3和蛋白酶C和/或蛋白酶N。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原α1链和胶原α2链各自能够在缺乏内源性植物P4H活性的亚细胞区室中积聚。
根据本发明的再一方面，提供了基因修饰植物或被分离的植物细胞，其能够积聚具有温度稳定性特征的胶原，所述温度稳定性特征与哺乳动物胶原的特征相同。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原是I型胶原。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，哺乳动物胶原是人胶原。
根据本发明的再一方面，提供了对于在植物中的表达进行最优化的胶原编码序列。
根据所述优选实施方案中再进一步的特征，胶原编码序列为由SEQ ID NO1所阐明的。
本发明通过提供能够表达正确羟基化的胶原链成功地解决了目前已知构造的缺点，所述胶原链能够装配为具有与人胶原类似特性的胶原。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述那些相似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但下文还是描述了适当的方法和材料。在冲突的情况下，以本专利说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是举例说明的，并不预期是限制性的。
附图简述本发明在此处仅通过例子参考附图进行描述。现在特别详细地参考附图，要强调的是所显示的细节通过例子来进行并且仅用于本发明优选实施方案的举例说明性讨论的目的，并且为了提供被认为是本发明的原理和概念方面最有用和易于理解的描述而呈现。在这点上，不试图显示比基本理解本发明所需细节更多的本发明的结构细节，附图采用的描述使得本发明的几种形式如何能够在实践中体现对于本领域技术人员是显而易见的。
在附图中


图1a-d举例说明了用于转化测试植物的各种表达盒和载体的构建。作为本研究的部分合成的所有编码序列对于烟草中的表达是最优化的。
图2举例说明了各种共转化方法。每种表达盒由编码序列的短名表示。编码序列在表1中详细说明。每个共转化通过2个pBINPLUS二元载体来进行。每个长方形表示携带1、2或3个表达盒的单个pBINPLUS载体。启动子和终止子在实施例1中详细说明。
图3是转化体的多重PCR筛选，显示出对于胶原α1链(324bp片段)或胶原α2链(537bp片段)或二者阳性的植物。
图4是由共转化2、3和4产生的转基因植物的蛋白质印迹分析。从烟草共转化体#2、#3和#4中提取总可溶性蛋白，并用抗-胶原I抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)进行检测。大小标记是来自Fermentas Inc.的#SM0671。W.T.是野生型烟草。阳性胶原条带在对于I型胶原α1或α2或二者为PCR阳性的植物中可见。来自人胎盘的500ng I型胶原(来自Chemicon Inc.的#CC050，通过胃蛋白酶消化从人胎盘中提取)的阳性对照条带代表来自转基因植物的样品中的约0.3％总可溶性蛋白(约150μg)。如通过I型胶原抗体的抗羧基末端前肽(来自Chemicon Inc.的#MAB1913)所检测的，在人胶原样品中约140kDa的较大条带是含有其C-前肽的前胶原。在人胶原样品中约120kDa的较小条带是不含前肽的胶原。由于其罕见的组成，富含脯氨酸的蛋白质(包括胶原)作为具有高于预期的分子量的条带在聚丙烯酰胺凝胶上一致迁移。因此，分子量约95kDa、不含前肽的胶原链作为约120kDa的条带迁移。
图5是由共转化#8(携带与胶原链翻译地融合的质外体(appoplast)信号)产生的转基因植物的蛋白质印迹分析。从转基因烟草叶中提取总可溶性蛋白，并用抗-胶原I抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)进行检测。阳性胶原α2条带在植物8-141中可见。来自人胎盘的I型胶原(来自Chemicon Inc.的#CC050)充当对照。
图6a-b举例说明根据热处理和胰蛋白酶或胃蛋白酶消化证实的胶原三股螺旋装配和热稳定性，在图6a中-对来自烟草2-9(只表达胶原α1且不表达P4H)和3-5(表达胶原α1+2以及人P4Hα和β亚基)的总可溶性蛋白实施热处理(38℃或43℃15分钟)，随后为胰蛋白酶消化(室温20分钟)，并用抗-胶原I抗体在蛋白质印迹方法中进行检测。阳性对照是500ng人胶原I样品+野生型烟草的总可溶性蛋白。在图6b中-从转基因烟草13-6(表达胶原Iα1和α2链-由箭标指出，人P4Hα和β亚基以及人LH3)提取总可溶性蛋白，并实施热处理(33℃、38℃或42℃20分钟)，立即在冰上冷却以防止三股螺旋重新装配，并于室温(约22℃)与胃蛋白酶一起温育30分钟，随后在标准蛋白质印迹方法中用抗-胶原I抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)进行检测。阳性对照是～50ng人胶原I样品(来自Chemicon Inc.的#CC050，通过胃蛋白酶消化从人胎盘中提取)，将其加到从野生型烟草中提取的总可溶性蛋白中。
图7举例说明了对野生型烟草进行的RNA印迹分析。印迹用烟草P4H cDNA进行探测。
图8是由共转化2、3和13产生的转基因植物的蛋白质印迹分析。从烟草共转化体提取总可溶性蛋白，并用抗人P4Hα和β以及抗胶原I抗体进行检测。
优选实施方案的描述本发明是关于表达并积聚胶原的植物，所述植物可用于生产显示哺乳动物胶原特征的胶原和胶原纤维。
参考附图和附加的描述可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明在其应用方面不局限于下文描述中阐明或由实施例示例的细节。本发明能够是其他实施方案、或以各种方式加以实践或执行。同样，应当理解本文所采用的措辞和术语是用于描述的目的且不应被视为限制。
生产胶原的植物是本领域已知的。尽管此类植物可以用于生产胶原链以及胶原，但此类链是不正确地羟基化的，并因此无论是在植物中还是不在植物中，其自身的装配导致内在不稳定的胶原。
在将本发明变为实践的同时，本发明人设计了植物表达方法，它确保胶原链的正确羟基化并因此使得能够在植物中生产胶原，所述胶原紧密地模仿人I型胶原的特征(例如，温度稳定性)。
因此，根据本发明的一个方面，提供了基因修饰植物，它能够表达至少一种类型的胶原α链，并将其积聚在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中。
如本文所使用的，短语“基因修饰植物”指任何低等(例如藓类)或高等(维管)植物或组织或其被分离的细胞(例如细胞悬浮液)，它用外源性多核苷酸序列稳定或瞬时转化。植物的例子包括烟草、玉米、苜蓿、稻、马铃薯、大豆、番茄、小麦、大麦、低芥酸菜子、棉花、胡萝卜以及低等植物例如藓类。
如本文所使用的，短语“胶原链”指胶原亚基，例如胶原纤维的α1或2链，优选I型纤维。如本文所使用的，短语“胶原”指被装配的胶原三聚体，在I型胶原的情况下它包括2个α1链和1个α2链。胶原纤维是缺乏末端前肽C和N的胶原。
如本文所使用的，短语“缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室”指细胞的任何被区室化的区域，它不包括植物P4H或具有植物样P4H活性的酶。此类亚细胞区室的例子包括液泡、质外体和细胞质，以及细胞器例如叶绿体、线粒体等。
任何类型的胶原链都可以由本发明的基因修饰植物表达。例子包括形成原纤维的胶原(I、II、III、V和XI型)、形成网络的胶原(IV、VIII和X型)、与原纤维表面结合的胶原(IX、XII和XIV型)、作为跨膜蛋白存在的胶原(XIII和XVII型)、或形成11nm周期性珠状丝的胶原(VI型)。关于进一步的描述请参见Hulmes，2002。
优选地，表达的胶原链是I型胶原α1和/2链。表达的胶原α链可以由来源于任何哺乳动物的任何多核苷酸序列编码。优选地，编码胶原α链的序列是人的并且由SEQ ID NO1和4阐明。
一般地，在植物中表达的α胶原链可以包括或不包括其末端前肽(即前肽C和前肽N)。
Ruggiero等人(2000)指出前胶原经由植物蛋白水解活性的处理不同于在人中的正常处理，并且前肽C通过植物蛋白水解活性去除，尽管切割位点不明。前肽C的切割可以在三聚体装配之前(3种C-前肽的结合是发动三聚体装配所必需的)发生在前胶原肽上。
经由植物蛋白水解活性的N-前肽切割发生在成熟植物中而不发生在小植物中。此类切割去除来自N端肽的2个氨基酸(17个中的2个)。
C-前肽(以及较少程度上的N-前肽)在前胶原通过动物细胞的过程中保持前胶原可溶(Bulleid等人，2000)，并且预期在植物细胞中有类似作用。在前胶原分子分泌进入细胞外基质后或在这个过程中，通过前胶原N-和C-蛋白酶去除前肽，从而触发胶原分子自发地自身装配为原纤维(Hulmes，2002)。通过前胶原N-和C-蛋白酶去除前肽使前胶原的溶解性降低了＞10000倍，并且是发动胶原自身装配成纤维所必需和充分的。对这个装配过程关键的是在三股螺旋结构域末端被称为端肽的短的非三股螺旋肽，它确保原纤维结构内的胶原分子的正确记录，并降低自身装配的临界浓度(Bulleid等人，2000)。现有技术描述了在胶原生产过程中利用胃蛋白酶切割前肽(Bulleid等人2000)。然而胃蛋白酶破坏端肽，并且因此，胃蛋白酶提取的胶原不能形成有序的原纤维结构(Bulleid等人2000)。
形成人P4Hβ亚基的蛋白质二硫键异构酶(PDI)显示在三聚体装配之前与C-前肽结合，因此在链的装配过程中还充当分子侣伴(Ruggiero等人，2000)。在不同植物中表达的人前胶原I N-蛋白酶和前胶原C-蛋白酶的使用可以产生更类似于天然的人胶原的胶原，并且可以形成有序的原纤维结构。
在其中N或C前肽或二者包括在表达的胶原链中的情况下，本发明的基因修饰植物还可表达分别的蛋白酶(即，C或N或二者)。编码此类蛋白酶的多核苷酸序列由SEQ ID NO18(蛋白酶C)和20(蛋白酶N)示例。此类蛋白酶可以被这样表达，从而使得它们在与胶原链相同的亚细胞区室中积聚。
表达的胶原链在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中的积聚可以经由几种方法中的任何一种来实现。
例如，表达的胶原链可以包括用于将表达的蛋白靶向亚细胞区室例如质外体或细胞器(例如叶绿体)的信号序列。适当的信号序列的例子包括叶绿体转运肽(包括在Swiss-Prot的登录号P07689中，氨基酸1-57)和线粒体转运肽(包括在Swiss-Prot的登录号P46643中，氨基酸1-28)。下文实施例部分提供了适当的信号序列的另外例子以及关于在植物细胞的胶原链表达中采用此类信号序列的指导方针。
可替代地，当在植物中表达时，胶原链的序列可以以改变胶原细胞定位的方式进行修饰。
如上文所提及的，植物的ER包括不能使胶原链正确羟基化的P4H。胶原α链天然地包括ER靶向序列，它指导表达的胶原进入ER，在其中它被翻译后修饰(包括不正确的羟基化)。因此，ER靶向序列的去除将导致缺乏翻译后修饰(包括任何羟基化)的胶原链的细胞质积聚。
下文实施例部分的实施例1描述了缺乏ER序列的胶原序列的生产。
再可替代地，胶原链可以被表达并积聚在包含DNA的细胞器例如叶绿体或线粒体中。叶绿体表达的进一步描述在下文中提供。
如上文所提及的，α链的羟基化是稳定的I型胶原装配所必需的。因为通过本发明基因修饰植物表达的α链积聚在缺乏内源性P4H活性的区室内，所以必须从植物、植物组织或细胞中分离此类链并在体外进行羟基化。此类羟基化可以通过Turpeenniemi-Hujanen和Myllyla(Concomitant hydroxylation of proline and lysine residues in collagenusing purified enzymes in vitro.Biochim Biophys Acta.1984 Jul 16；800(l)59-65)所述方法实现。
尽管此类体外羟基化可以产生正确羟基化的胶原链，但它的实现是困难且代价高的。
为了克服体外羟基化的局限，本发明的基因修饰植物优选还共表达P4H，它能使胶原α链正确羟基化[即只在Gly-X-Y三联体的脯氨酸(Y)位置上羟基化]。P4H是由2个亚基α和β组成的酶。二者都是形成活性酶所必需的，而β亚基还具有侣伴功能。
通过本发明的基因修饰植物表达的P4H优选是人P4H，它由例如SEQ ID NO12和14编码。此外，还可使用显示增强的底物特异性的P4H突变体或P4H同源物。
适当的P4H同源物由NCBI编号NP_179363鉴定的鼠耳芥属(Arabidopsis)氧化还原酶示例。由本发明人进行的这种蛋白质序列和人P4Hα亚基的逐对比对揭示了任何已知的植物P4H同源物的功能结构域之间的最高同源性。
因为P4H需要与表达的胶原链共积聚，所以其编码序列优选相应地进行修饰(加入信号序列、可能阻止ER靶向的缺失，等等)。
在哺乳动物细胞中，胶原还通过赖氨酰羟化酶、半乳糖基转移酶和葡糖基转移酶进行修饰。这些酶序贯地将特定位置的赖氨酰残基修饰为羟赖氨酰、半乳糖基羟赖氨酰和葡糖基半乳糖基羟赖氨酰残基。单独的人的酶，赖氨酰羟化酶3(LH3)可以催化羟赖氨酸连接的碳水化合物形成中的所有3个连续步骤。
因此，本发明的基因修饰植物还优选表达哺乳动物LH3。编码LH3的序列例如SEQ ID NO22所阐明的那些可以用于此类用途。
上文描述的胶原链和修饰酶可以由稳定整合或瞬时表达的核酸构建体进行表达，所述核酸构建体包括编码α链和/或修饰酶(例如P4H和LH3)、置于植物功能启动子的转录控制下的多核苷酸序列。此类核酸构建体(它在本文中也被称为表达构建体)可以被设置为在遍及完整植物、限定的植物组织或限定的植物细胞、或在植物的限定发育阶段进行表达。此类构建体还可包括选择标记(例如抗生素抗性)、增强子元件和用于细菌复制的复制起点。
应当理解包括2种可表达的插入片段(例如2个α链类型、或α链和P4H)的构建体优选包括适合于每种插入片段的单独启动子，或可替代地，此类构建体可以表达包括来自单个启动子的2个插入序列的单个转录物嵌合体。在这种情况下，嵌合转录物包括在2个插入序列之间的IRES序列，从而使得下游插入片段可以从那里被翻译。
本发明的构建体可以采用众多植物功能表达启动子和增强子，它们可以是组织特异性、发育特异性、组成型或诱导型的，下文提供了一些例子。
如本说明书此处和随后的权利要求部分所使用的，短语“植物启动子”或“启动子”包括可以指导植物细胞(包括包含DNA的细胞器)中的基因表达的启动子。此类启动子可以来源于植物、细菌、病毒、真菌或动物来源。此类启动子可以是组成型的，即能够指导在多个植物组织中的高水平基因表达，组织特异性的，即能够指导在一种或多种特定植物组织中的基因表达，诱导型的，即能够在刺激下指导基因表达，或嵌合的，即由至少2个不同的启动子部分形成。
因此，所使用的植物启动子可以是组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或嵌合启动子。
组成型植物启动子的例子包括，但不限于，CaMV35S和CaMV19S启动子、FMV34S启动子、甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliformbadnavirus)启动子、CsVMV启动子、鼠耳芥ACT2/ACT8肌动蛋白启动子、鼠耳芥遍在蛋白UBQ1启动子、大麦叶硫素BTH6启动子和稻肌动蛋白启动子。
组织特异性启动子的例子包括，但不限于，豆菜豆蛋白贮存蛋白启动子、DLEC启动子、PHS启动子、玉米醇溶蛋白贮存蛋白启动子、来自大豆的羽扇豆球蛋白γ启动子、AT2S1基因启动子、来自鼠耳芥的ACT11肌动蛋白启动子、来自欧洲油菜(Brassica napus)的napA启动子和马铃薯patatin基因启动子。
诱导型启动子是由特异性的刺激例如应激条件(包括例如光、温度、化学制剂、干旱、高盐度、渗透压休克)、氧化剂条件或在致病性的情况下诱导的启动子，并且包括，但不限于，来源于豌豆rbcS基因的光诱导型启动子，来自苜蓿rbcS基因的启动子，在干旱时活化的启动子DRE、MYC和MYB；在高盐度和渗透压应激下活化的启动子INT、INPS、prxEa、Ha hsp17.7G4和RD21，以及在致病性应激下活化的启动子hsr203J和str246C。
优选地，本发明使用的启动子是强组成型启动子，从而使得构建体插入片段的超表达在植物转化后实现。
应当理解，本发明所使用的任何构建体类型都可以利用每种构建体类型中相同或不同的选择标记共转化到相同的植物中。可替代地，第一种构建体类型可以导入第一种植物中，而第二种构建体类型可以导入第二种等基因植物中，之后由此产生的转基因植物可以进行杂交并选择双重转化体的后代。此类后代的进一步自交可以用于产生2种构建体的纯合系。
存在将核酸构建体导入单子叶植物和双子叶植物的各种方法(Potrykus，I.，Annu.Rev.Plant.Physiol.，Plant.Mol.Biol.(1991)42205-225；Shimamoto等人，Nature(1989)338274-276)。此类方法依赖于核酸构建体或其部分稳定整合到植物基因组中，或在其中这些序列不由植物后代遗传的情况下依赖于核酸构建体的瞬时表达。
此外，存在可以将核酸构建体直接导入包含DNA的细胞器例如叶绿体的DNA中的几种方法。
存在实现外源序列例如包括在本发明的核酸构建体内的那些稳定地基因组整合到植物基因组中的2种基本方法(i)土壤杆菌属(Agrobaclerium)-介导的基因转移Klee等人(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38467-486；Klee和Rogers，CellCulture and Somatic Cell Genetics of Plants，第6卷，MolecularBiology of Plant Nuclear Genes，eds.Schell，J.，和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)第2-25页；Gatenby，Plant Biotechnology，eds.Kung，S.和Arntzen，C.J.，ButterworthPublishers，Boston，Mass.(1989)第93-112页。
(ii)DNA直接摄取Paszkowski等人，Cell Culture and SomaticCell Genetics of Plants，第6卷，Molecular Biology of Plant NuclearGenes eds.Schell，J.，和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)第52-68页；包括用于将DNA直接摄入原生质体中的方法，Toriyama，K.等人(1988)Bio/Technology 61072-1074。通过植物细胞短暂电休克诱导的DNA摄取Zhang等人Plant Cell Rep.(1988)7379-384.Fromm等人Nature(1986)319791-793。通过粒子轰击，Klein等人Bio/Technology(1988)6559-563；McCabe等人Bio/Technology(1988)6923-926；Sanford，Physiol.Plant.(1990)79206-209；通过使用微量移液管系统，Neuhaus等人，Theor.Appl.Genet.(1987)7530-36；Neuhaus和Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79213-217；或通过将DNA与发芽的花粉直接温育，DeWet等人Experimental Manipulation of Ovule Tissue，eds.Chapman，G.P.和Mantell，S.H.和Daniels，W.Longman，London，(1985)第197-209页；和Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83715-719，将DNA注射到植物细胞或组织中。
土壤杆菌属系统包括质粒载体的使用，所述质粒载体包含整合到植物基因组DNA中的限定的DNA片段。植物组织的接种方法依赖于植物物种和土壤杆菌属送递系统而变。广泛使用的方法是叶盘法，它可以由任何组织外植体来进行，所述外植体提供用于发动整个植物分化的良好来源。Horsch等人Plant Molecular Biology Manual A5，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht(1988)第1-9页。补充方法采用与真空渗透组合的土壤杆菌属送递系统。土壤杆菌属系统在转基因双子叶植物的制备中尤其可行。
存在直接将DNA转移到植物细胞中的各种方法。在电穿孔中，使原生质体短暂地暴露在强电场中。在显微注射中，利用极小的微量移液管将DNA机械地直接注射到细胞中。在微粒轰击中，DNA吸附在微粒例如硫酸镁晶体、钨颗粒或金颗粒上，并且微粒物理加速进入细胞或植物组织中。
转化后进行植物繁殖。最常见的植物繁殖法是通过种子。然而通过种子繁殖的再生具有由于杂合性而在农作物中缺少一致性的缺陷，因为根据孟德尔定律决定的遗传变异，种子通过植物产生。基本上，每个种子在遗传上不同并且每个将伴随其自身的特殊性状生长。因此，优选被转化的植物被这样生产，从而使得再生的植物具有与亲本转基因植物相同的性状和特征。因此，优选被转化的植物通过微繁殖(micropropagation)进行再生，所述微繁殖提供被转化植物的快速、一致的生殖。
可以用于瞬时表达包括在本发明的核酸构建体内的被分离核酸的瞬时表达法包括，但不限于，如上所述的显微注射和轰击，但在有利于瞬时表达的条件下，和病毒介导的表达，其中包括核酸构建体的被包装或未包装的重组病毒载体用于感染植物组织或细胞，从而使得其中确立的繁殖的重组病毒表达非病毒的核酸序列。
已显示对于植物宿主转化有用的病毒包括CaMV、TMV和BV。利用植物病毒的植物转化描述于美国专利号4,855,237(BGV)、EP-A67,553(TMV)、日本公开申请号63-14693(TMV)、EPA 194,809(BV)、EPA 278,667(BV)；和Gluzman，Y.等人，Communications in MolecularBiologyViral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，pp.172-189(1988)中。用于在多种宿主包括植物中表达外来DNA的假病毒颗粒描述于WO 87/06261中。
用于在植物中导入和表达非病毒性外源核酸序列的植物RNA病毒的构建由上述参考文献以及Dawson，W.O.等人，Virology(1989)172285-292；Takamatsu等人EMBO J.(1987)6307-311；French等人Science(1986)2311294-1297；和Takamatsu等人FEBS Letters(1990)26973-76证实。
当病毒是DNA病毒时，可以对病毒自身进行构建。可替代地，病毒可以首先克隆到细菌质粒中以用于容易地构建含有外来DNA的所需病毒载体。病毒随后可以从质粒中切除。如果病毒是DNA病毒，则可以将细菌的复制起点附着在病毒DNA上，所述病毒DNA随后通过细菌进行复制。这种DNA的转录和翻译将产生外壳蛋白，它将使病毒DNA壳体化。如果病毒是RNA病毒，则该病毒通常作为cDNA被克隆并插入质粒中。质粒随后用于制备所有构建体。RNA病毒随后通过转录质粒的病毒序列并翻译病毒基因以产生使病毒RNA壳体化的外壳蛋白来产生。
用于在植物中导入和表达非病毒性外源核酸序列的植物RNA病毒的构建由上述参考文献以及美国专利号5,316,931证实，所述外源核酸序列例如本发明构建体中包括的那些。
在一个实施方案中，提供了植物病毒性核酸，其中天然的外壳蛋白编码序列已从病毒核酸中缺失，已插入非天然的植物病毒外壳蛋白的编码序列和非天然的启动子，优选非天然的外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子，其能够在植物宿主中表达，包装重组的植物病毒核酸，并确保通过重组的植物病毒核酸全身地感染宿主。可替代地，外壳蛋白基因可以通过在其中插入非天然的核酸序列来灭活，从而产生蛋白质。重组的植物病毒核酸可以包含一个或多个另外的非天然的亚基因组启动子。每个非天然的亚基因组启动子都能够在植物宿主中转录或表达邻近基因或核酸序列，并且不能互相重组以及与天然的亚基因组启动子重组。如果包括超过一个的核酸序列，则插入的非天然(外来)核酸序列可以邻近天然的植物病毒亚基因组启动子、或邻近天然的和非天然的植物病毒亚基因组启动子。非天然的核酸序列在亚基因组启动子控制下在宿主植物中被转录或表达，以生产所需产品。
在第二个实施方案中，提供的重组的植物病毒核酸与第一个实施方案中的一样，只是除了将天然的外壳蛋白编码序列置于邻近一个非天然的外壳蛋白亚基因组启动子而不是非天然的外壳蛋白编码序列。
在第三个实施方案中，提供重组的植物病毒核酸，其中天然外壳蛋白的基因邻近其亚基因组启动子，且一个或多个非天然亚基因组启动子已插入到病毒核酸中。插入的非天然的亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达邻近基因，并且不能互相重组及与天然的亚基因组启动子重组。插入的非天然的核酸序列可以邻近非天然的亚基因组植物病毒启动子，从而使得所述序列在亚基因组启动子控制下在宿主植物中被转录或表达，以生产所需产品。
在第四个实施方案中，提供的重组的植物病毒核酸与第三个实施方案中的一样，只是除了天然的外壳蛋白编码序列由非天然的外壳蛋白编码序列替代。
病毒载体通过由重组的植物病毒核酸编码的外壳蛋白进行壳体化，以生产重组的植物病毒。重组的植物病毒核酸或重组的植物病毒用于感染适当的宿主植物。重组的植物病毒核酸能够在宿主中复制、在宿主中全身地扩散、并且在宿主中转录或表达外来基因(被分离的核酸)，以生产所需蛋白。
用于将外源核酸序列导入叶绿体基因组的技术是已知的。这种技术包括下列过程。首先，植物细胞被化学处理以便将每个细胞的叶绿体数目减少至约一个。随后，外源核酸经由粒子轰击导入细胞中以用于将至少一种外源核酸分子导入叶绿体中。选择外源核酸从而使得它能够经由同源重组整合到叶绿体基因组中，所述同源重组易于通过叶绿体固有的酶来实现。为此，外源核酸除了目的基因之外还包括至少一个核酸段，它来源于叶绿体基因组。此外，外源核酸包括选择标记，它通过序贯选择过程以用于确定所有或基本上所有的叶绿体基因组拷贝在此类选择后将包括外源核酸。关于这种技术的进一步的细节在美国专利号4,945,050和5,693,507中找到，所述专利引入本文作为参考。因此多肽可以通过叶绿体的蛋白质表达系统来生产并且变得整合到叶绿体内膜中。
上述转化方法可以用于在任何物种的植物、或植物组织或来源于那里的被分离的植物细胞中生产胶原链和/或修饰酶以及被装配的胶原(含或不含前肽)。
优选的植物是能够积聚大量本文描述的胶原链、胶原和/或加工酶的那些。还可根据其对应激条件的抗性和其中表达的组分或被装配的胶原可以被提取的容易性来选择此类植物。优选的植物的例子包括烟草、玉米、苜蓿、稻、马铃薯、大豆、番茄、小麦、大麦、低芥酸菜子和棉花。
胶原纤维广泛地用于食物和化妆品工业中。因此，尽管由植物表达的胶原纤维组分(α链)和修饰酶在胶原的工业合成中找到功用，但由于其简单性和成本效率，优选在植物中生产完整的胶原。
几种方法可以用于在植物中生成I型胶原。例如可以从表达胶原α1和P4H(和任选的LH3)的植物中分离胶原α1链并且将其与胶原α2链混合，所述胶原α2链从表达胶原α2和P4H(和任选的LH3以及蛋白酶C和/或N)的植物中分离。因为胶原α1链自动地自身装配为三股螺旋，所以在混合之前可能必须使此类同源三聚体变性，且与胶原α2链一起复性。
优选地，表达胶原α1和P4H(和任选的LH3以及蛋白酶C和/或N)的第一种植物可以与表达胶原α2的第二种(且优选等基因的)植物杂交，或可替代地，表达2种α链的第一种植物可以与表达P4H和任选的LH3以及蛋白酶C和/或N的第二种植物杂交。
应当指出尽管上述植物育种方法使用2种单独转化的植物，但使用3种或更多种单独转化的植物的方法也可采用，所述植物各自表达1种或2种组分。
本领域的普通技术人员知道各种植物育种技术并且因此本文不提供此类技术的进一步描述。
尽管植物育种方法是优选的，但应当指出表达胶原α1和2、P4H和LH3(和任选的蛋白酶C和/或N)的单个植物可以经由数个转化事件产生，每个所述转化事件被设计用于将再一个可表达的组分导入细胞中。在这种情况下，每个转化事件的稳定性可以利用特异性的选择标记进行验证。
在任何情况下，转化和植物育种方法都可以用于生成表达任何数目的组分的任何植物。目前优选的是表达胶原α1和2链、P4H、LH3和至少一种蛋白酶(例如蛋白酶C和/或N)的植物。如下文实施例部分将进一步描述的，此类植物积聚在最高达42℃的温度下显示出稳定性的胶原。
由育种产生的后代，或可替代地，多重转化的植物可以通过使用核酸或蛋白质探针(例如抗体)证实外源mRNA和/或多肽的存在来选择。后面的方法是优选的，因为它能够定位所表达的多肽组分(通过例如，探测分级分离的植物提取物)，并因此同样证实了用于正确加工和装配的潜力。适当的探针的例子在下文实施例部分提供。
一旦表达胶原的后代被鉴别，此类植物就进一步在使胶原链以及修饰酶最大化表达的条件下进一步培育。
因为游离的脯氨酸积聚可以促进不同的富含脯氨酸的蛋白质的过度生产，所述蛋白质包括由本发明的基因修饰植物表达的胶原链，所以优选的培育条件是增加被培育植物中游离脯氨酸积聚的那些。
游离脯氨酸响应于广泛的环境应激而在多种植物中积聚，所述环境应激包括剥夺、盐化、低温、高温、病原体感染、重金属毒性、无氧生活、养分缺乏、大气污染和紫外线照射(Hare和Cress，1997)。
游离脯氨酸还可响应于经由化合物例如ABA，或应激诱导化合物例如铜盐、百草枯(paraquate)、水杨酸等处理植物或土壤而积聚。
因此，表达胶原的后代可以在不同的应激条件(例如50mM-最高达250mM的不同的NaCl浓度)下生长。为了进一步增强胶原的生产，将检查各种应激条件对胶原表达的作用，并关于植物生活力、生物量和胶原积聚进行最优化。
植物组织/细胞优选在成熟期进行收获，并且利用众所周知的现有技术的提取方法分离胶原纤维，下文描述了一种此类方法。
转基因植物的叶子在液氮下被磨成粉末，并且于4℃在包含0.2MNaCl的0.5M乙酸中提取匀浆物60小时。通过离心去除不溶的材料。包含重组胶原的上清液在0.4M和0.7M NaCl下进行盐分级分离。包含重组的异源三聚体胶原的0.7M NaCl沉淀物溶解于0.1M乙酸中并针对其进行透析，并储存于-20℃(根据Ruggiero等人，2000)。
在检查下列实施例后本发明的其他目的、优点和新型特征对于本领域的普通技术人员而言将是显而易见的，所述实施例不预期是限制性的。另外，如上文所描绘的和下文权利要求部分所请求保护的本发明的各种实施方案和方面中的每一个在下列实施例中都能找到实验支持。
实施例现在参考下列实施例，所述实施例与上述说明书一起以非限制性的方式举例说明本发明。
一般地，本文所使用的术语和本发明中使用的实验程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中得到充分说明。参见，例如“Molecular CloningA laboratory Manual”Sambrook等人(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel等人，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to MolecularCloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等人(eds)，“Genome AnalysisA Laboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所阐明的方法；“Cell BiologyA Laboratory Handbook”，第I-III卷Cellis，J.E.，ed.(1994)；“Current Protocols in Immunology”第I-III卷Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites等人(eds)，“Basic and ClinicalImmunology”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(eds)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可用的免疫测定广泛描述于专利和科学文献中，参见，例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，eds.(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，Eds.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I，ed.(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”第1-317卷，Academic Press；“PCRProtocolsA Guide To Methods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，“Strategies for ProteinPurification and Characterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有这些都如本文完全阐明的那样引入本文作为参考。这个文件自始至终提供了其他的一般参考文献。其中的程序被认为是本领域众所周知的并且为了读者的方便而提供。其中包含的所有信息都引入本文作为参考。
实施例1构建体和转化方案
图1a-d中举例说明了在这项工作中使用的表达盒和载体的构建。这项工作中的所有编码序列都对于在烟草中的表达进行最优化，并与所需侧翼区(SEQ ID NO1、4、7、12、14、16、18、20、22)一起进行化学合成。
图1a-编码与液泡信号或质外体信号(由SEQ IDNO7编码)融合的、或不含信号的Col1和Col2的合成基因(SEQ ID1、4)在由菊花rbcS1启动子和5′UTR(SEQ ID NO10)以及菊花rbcS1 3′UTR和终止子(SEQ ID NO11)组成的表达盒中进行克隆。将完整的表达盒克隆到pBINPLUS植物转化载体的多克隆位点中(van Engelen等人，1995，Transgenic Res 4288-290)。
图1b-编码与液泡信号或质外体信号(由SEQ ID NO7编码)融合的、或不含信号的P4Hβ-人、P4Hα-人和P4H-植物(SEQ ID NO12、14和16)的合成基因在由载体pJD330携带的CaMV 35S启动子和TMVω序列和土壤杆菌属胭脂碱合成酶(NOS)终止子组成的表达盒中进行克隆(Galili等人，1987，Nucleic Acids Res 153257-3273)。将完整的表达盒克隆到携带Col1或Col2表达盒的pBINPLUS载体的多克隆位点中。
图1c-编码与液泡信号或质外体信号(由SEQ ID NO7编码)融合的蛋白酶C和蛋白酶N(SEQ ID NO18、20)的合成基因在由菊花rbcS1启动子和5′UTR(SEQ ID NO10)以及菊花rbcS13′UTR和终止子(SEQ ID NO11)组成的表达盒中进行克隆。将完整的表达盒克隆到pBINPLUS植物转化载体的多克隆位点中。
图1d-编码与液泡信号或质外体信号(由SEQ ID NO7编码)融合的、或不含信号的、具有侧翼的草莓镶脉病毒(SVBV)启动子(NCBI编号AF331666REGION623..950版本AF331666.1GI13345788)并由土壤杆菌属章鱼碱(octopin)合酶(OCS)终止子(NCBI编号Z37515REGION1344..1538版本Z37515.1GI886843)终止的LH3的合成基因(SEQ ID NO22)在携带Col1和P4Hβ表达盒的pBINPLUS载体的多克隆位点中进行克隆。
在图2中举例说明了利用
图1中描述的表达盒进入宿主植物的共转化方案。每个表达盒插入片段由编码序列的短名表示。编码序列和相关的SEQ ID NO描述于表1中。每次共转化由2个pBINPLUS二元载体来进行。每个长方形表示携带1、2或3个表达盒的单个pBINPLUS载体。启动子和终止子在
图1中详细说明。
实施例2植物胶原表达下表1中列出的编码蛋白质的合成的多核苷酸序列对于在烟草植物中的表达进行设计和最优化。
表1-表达的蛋白质的列表
信号肽(i)用于巯基蛋白酶aleurain前体(NCBI编号P05167GI113603)的大麦基因的液泡信号序列MAHARVLLLALAVLATAAVAVASSSSFADSNPIRPVTDRAASTLA(SEQ IDNO24)。
(ii)鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)内切-1，4-β-葡聚糖酶的质外体信号(Cell，NCBI编号CAA67156.1GI2440033)；SEQ ID NO.9，由SEQ ID NO.7编码。
质粒的构建如实施例1所教导的构建植物表达载体，每种被构建的表达载体的组成经由限制酶切分析和测序进行确认。
构建包括下列表达盒的表达载体1.胶原α12.胶原α1+人P4Hβ亚基3.胶原α1+人P4Hβ亚基+人LH34.胶原α25.胶原α2+人P4Hα亚基6.胶原α2+鼠耳芥P4H7.人P4Hβ亚基+人LH38.人P4Hα亚基上述编码序列中的每一种都与液泡转运肽或质外体转运肽翻译地融合，或在其中预期细胞质积聚的情况下，缺乏任何转运肽序列。
植物转化和PCR筛选烟草植物(烟草(Nicotiana tabacum)，Samsun NN)根据图2中教导的转化方案由上述表达载体进行转化。
所得的转基因植物经由多重PCR利用4种引物进行筛选，所述引物被设计为能够扩增胶原α1的324bp片段和胶原α2的537bp片段(表2)。图3举例说明了多重PCR筛选的结果。
表2-用于扩增胶原α1的324bp片段和胶原α2的537bp片段的多重PCR的引物列表
实施例3在转基因烟草植物中的人胶原的检测通过在0.5ml 50mM Tris-HCl pH＝7.5中与“完整的”蛋白酶抑制剂混合物(来自Roche Diagnostics GmbH的产品#1836145，1片剂/50ml缓冲液)一起磨碎500mg叶子，从烟草转化体2、3和4中提取总可溶性蛋白。粗提取物与250μl包含10％β-巯基乙醇和8％SDS的4×样品应用缓冲液混合，将样品煮沸7分钟并在13000rpm下离心8分钟。将20μl上清液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶中并在标准蛋白质印迹程序中用抗-胶原I(变性的)抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)进行测试(图4)。W.T.是野生型烟草。在对于I型胶原α1或α2或二者PCR阳性的植物中可见阳性胶原条带。来自人胎盘的500ng I型胶原(来自Chemicon Inc.的#CC050)的阳性对照条带代表来自转基因植物的样品中的约0.3％总可溶性蛋白(约150μg)。
当胶原靶向液泡时，检测到表达预期分子量的、最高达～1％总可溶性蛋白的胶原的植物(图4)。成功地实现了全长胶原亚细胞靶向质外体(图5)。在细胞质中表达胶原(即没有靶向肽)的植物没有将胶原积聚至可检测的水平，从而显示在植物中的胶原亚细胞靶向作用对于成功是关键的。
此外，与显示对缺少N-前肽的胶原实施重要的蛋白质水解作用的Ruggiero等人2000和Merle等人2002研究相反，使用本方法，含有C-前肽和N-前肽的全长胶原蛋白质以高水平积聚在亚细胞区室中。
现在的数据还清晰地显示各自表达不同胶原链类型的2种植物杂交是有利的，因为它使得能够选择表达最佳水平的每种链类型的植物和后续的植物杂交，以获得所需生产胶原的植物。
由本发明的植物生产的胶原包括天然的前肽，并因此预期形成比通过蛋白质水解纯化的人对照大的蛋白质。计算出的不含羟基化或糖基化的胶原α1和α2链分子量如下含有前肽的Col1-136kDa，不含前肽的Col1-95kDa、含有前肽的Col2-127kDa、不含前肽的Col2-92kDa。
如图4中可见的，转化体3-5和3-49中的Col1条带看起来比其他植物中的Col1条带大。这提示胶原链中通过由α和β亚基组成的人脯氨酸4-羟化酶全酶进行脯氨酸羟基化，所述α和β亚基在这些植物中共表达并靶向与人胶原链相同的亚细胞区室(例如液泡)。
实施例4在转基因植物中的胶原三股螺旋装配和热稳定性通过转基因植物的总粗蛋白提取物的热变性、随后为胰蛋白酶或胃蛋白酶消化，来测试在转基因植物中的胶原三股螺旋的装配和螺旋的热稳定性(图6a-b)。
在第一个实验中，来自烟草2-9(只表达胶原α1，且不表达P4H)和3-5(表达胶原α1+2和P4H)的总可溶性蛋白通过下列操作提取在0.5ml 50mM Tris-HCl pH＝7.5中磨碎500mg叶子，在13000rpm下离心10分钟，并收集上清液。对50μl上清液实施热处理(于33℃或43℃15分钟)，并随后立即置于冰上。通过向每种样品加入6μl溶于50mM Tris-HCl pH＝7.5的1mg/ml胰蛋白酶开始胰蛋白酶消化。样品在室温(约22℃)下温育20分钟。通过加入20μl包含10％β巯基乙醇和8％SDS的4×样品应用缓冲液来终止消化，将样品煮沸7分钟并在13000rpm下离心7分钟。将50μl上清液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶上并利用标准蛋白质印迹程序经由抗-胶原I抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)进行测试。阳性对照是～500ng人胶原I样品(来自Chemicon Inc.的#CC050，通过胃蛋白酶消化从人胎盘中提取)，将其加入从野生型烟草中提取的50μl总可溶性蛋白中。
如图6a中所示，在植物#3-5中形成的胶原三股螺旋以及对照人胶原在33℃对变性有抗性。相反，由植物#2-9形成的胶原在33℃变性。这种热稳定性方面的差异提示在转化体#3-5中的成功的三股螺旋装配和翻译后的脯氨酸羟基化，所述转化体#3-5表达胶原α1和胶原α2以及P4Hβ和α亚基。
转化体#2-9中的2个条带可以表示二聚体或三聚体，它们在与SDS和巯基乙醇一起煮沸7分钟后是稳定的。类似的条带在人胶原(上面的图)和转化体#3-5中可见。可能的解释是不同三股螺旋中的2种肽之间的共价键(交联)，所述共价键在2个赖氨酸通过赖氨酸氧化酶氧化脱氨后形成。
在第二个实验中，来自转基因烟草13-6(表达胶原Iα1和α2链-由箭标指出，人P4Hα和β亚基以及人LH3)的总可溶性蛋白通过下列操作提取在0.5ml 100mM Tris-HCl pH＝7.5和300mM NaCl中磨碎500mg叶子，在10000rpm下离心7分钟，并收集上清液。对50μl上清液实施热处理(于33℃、38℃或42℃20分钟)，并随后立即置于冰上。通过向每种样品加入溶于10mM乙酸的4.5μl 0.1M HCl和4μl 2.5mg/ml胃蛋白酶开始胃蛋白酶消化。样品在室温(约22℃)下温育30分钟。通过加入5μl无缓冲的1M Tris来终止消化。每种样品与22μl包含10％β巯基乙醇和8％SDS的4×样品应用缓冲液混合，煮沸7分钟并在13000rpm下离心7分钟。将40μl上清液加载到10％聚丙烯酰胺凝胶上并在标准蛋白质印迹程序中用抗-胶原I抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)进行测试。阳性对照是加入从野生型烟草中提取的总可溶性蛋白中的～50ng人胶原I(来自Chemicon Inc.的#CC050，通过胃蛋白酶消化从人胎盘中提取)。
如图6b中举例说明的，在植物#13-6中形成的胶原三股螺旋在42℃对变性有抗性。前肽的切割首先在33℃可见，并且当温度升至38℃并再升至42℃时效力逐渐增加。被切割的胶原三股螺旋结构域在凝胶上显示出的迁移与胃蛋白酶处理的人胶原的迁移相似。在这个实验中使用的人胶原通过胃蛋白酶的蛋白水解作用从人胎盘中提取出来，并且因此缺少前肽和某些端肽。
实施例5植物P4H表达天然的植物P4H的诱导烟草P4H cDNA被克隆并用作探针以测定将诱导内源性P4H表达的条件和处理。RNA印迹分析(图7)清晰地显示，P4H以相对高的水平表达于苗端并以低水平表达于叶中。P4H水平在磨损处理(在下面的图中的“创伤”)后4小时在叶中被显著诱导。利用其他应激条件达到类似结果(未显示)。
转基因烟草植物中入P4Hα和β亚基以及胶原α1和α2链的检测使用抗人P4Hα亚基抗体(来自ICN Biomedicals Inc.的#63-163)、抗人P4Hβ亚基抗体(来自Chemicon Inc.的#MAB2701)和抗胶原I抗体(来自Chemicon Inc.的#AB745)实现转基因烟草植物中人P4Hα和β亚基以及I型胶原α1和α2链的检测。用这些抗体探测的蛋白质印迹结果显示于图8中。
在植物13-6(还转化有人LH3)中确认P4Hα、P4Hβ和胶原Iα1和α2条带的表达。计算出的包括液泡信号肽的P4Hα和β的分子量分别为65.5kDa和53.4kDa。计算出的含有前肽、不含羟基化或糖基化的胶原α1和α2链的分子量分别为136kDa和127kDa。
应当理解本发明的某些特征还可与单个实施方案组合提供，所述特征为了清晰起见在分开的实施方案的背景中进行描述。相反地，本发明的各种特征还可分开或以任何适当的亚组合提供，所述特征为了简短起见在单个实施方案的背景中进行描述。
尽管本发明已结合其具体实施方案进行了描述，但明显的是，多种替代方案、修饰和改变对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，它预期包含落在附加权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代方案、修饰和改变。本说明书中提到的所有公开出版物、专利和专利申请以及GenBank编号都整体引入本说明书作为参考，其程度相当于每个单独的公开出版物、专利或专利申请或GenBank编号被具体地和单独地说明引入本文作为参考。此外，本申请中的任何参考文献的引用或鉴定不应被解释为承认此类参考文献可作为本发明的现有技术。
参考文献(其他参考文献在文件中引用)1.Bulleid NJ，John DC，Kadler KE.Recombinant expression systems for theproduction of collagen.Biochem Soc Trans.2000；28(4)350-3.Review.PMID10961917[PubMed-indexed for MEDLINE]2.Hare PD，Cress WA.Metabolic implications of stress-induced prolineaccumulation in plants.Plant Growth Regulation 1997；2179-102.
3.Hieta R，Myllyharju J.Cloning and characterization of a low molecularweight prolyl 4-hydroxylase from Arabidopsis thaliana.Effective hydroxylation ofproline-rich，collagen-like，and hypoxia-inducible transcription factor alpha-likepeptides.J Biol Chem.2002 Jun 28；277(26)23965-71.Epub 2002 Apr 25.PMID11976332[PubMed-indexed for MEDLINE]4.Hulmes DJ.Building collagen molecules，fibrils，and suprafibrillar structures.J Struct Biol.2002 Jan-Feb；137(1-2)2-10.Review.PMID12064927[PubMed-indexed for MEDLINE]5.Inkinen K.Connective tissue formation in wound healing.An experimentalstudy.Academic Dissertation，September 2003.University of Helsinki，Faculty ofScience，Department of Biosciences，Division of Biochemistry(ISBN 952-10-1313-3)http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/mat/bioti/vk/inkinen/6.Merle C，Perret S，Lacour T，Jonval V，Hudaverdian S，Garrone R，RuggieroF，Theisen M.Hydroxylated human homotrimeric collagen I in Agrobacteriumtumefaciens-mediated transient expression and in transgenic tobacco plant.FEBSLett.2002 Mar 27；515(1-3)114-8.PMID11943205[PubMed-indexed forMEDLINE]7.Olsen D，Yang C，Bodo M，Chang R，Leigh S，Baez J，Carmichael D，PeralaM，Hamalainen ER，Jarvinen M，Polarek J.Recombinant collagen and gelatin for drugdelivery.Adv Drug Deliv Rev.2003 Nov 28；55(12)1547-67.PMID14623401[PubMed-in process]8.Ruggiero F，Exposito JY，Boumat P，Gruber V，Perret S，Comte J，Olagnier B，Garrone R，Theisen M.Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenictobacco plants.FEBS Lett.2000 Mar 3；469(1)132-6.PMID10708770[PubMed-indexed for MEDLINE]9.Tanaka M，Sato K，Uchida T.Plant prolyl hydroxylase recognizes poly(L-proline)II helix.J Biol Chem.1981 Nov 25；256(22)11397-400.PMID6271746[PubMed-indexed for MEDLINE]10.Wang C，Luosujarvi H，Heikkinen J，Risteli M，Uitto L，Myllyla R.The thirdactivity for lysyl hydroxylase 3galactosylation of hydroxylysyl residues in collagensin vitro.Matrix Biol.2002 Nov；21(7)559-66.PMID12475640[PubMed-indexedfor MEDLINE]
序列表<110>CollPlant Ltd.
<120>生产胶原的植物及其生成和使用方法<130>CPCH0761218P<160>28<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>4662<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有与人胶原α1(I)链融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列编码区和侧翼区的合成序列<400>1gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag60atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg120aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aaccatggct180cacgctcgtg ttctcctcct cgctctcgct gttttggcaa cagctgctgt ggctgtggct240tctagttctt cttttgctga ttcaaaccct attagacctg ttactgatag agcagcttcc300actttggctc aattgcaaga ggagggccag gttgagggcc aagatgagga tatccctcca360attacatgcg tgcaaaatgg cttgcgttac cacgataggg atgtgtggaa acctgaacct420tgtcgtatct gtgtgtgtga taacggcaag gtgctctgcg atgatgttat ctgcgatgag480acaaaaaatt gccctggcgc tgaagttcct gagggcgagt gttgccctgt gtgccctgat540ggttccgagt ccccaactga tcaggaaact actggcgtgg agggcccaaa aggagatact600ggtccacgtg gtcctagggg tccagcaggt cctccaggta gagatggtat tccaggccag660
cctggattgc caggaccacc aggcccacct ggcccaccag gacctcctgg tcttggtgga720aatttcgctc cacaactctc ttatggctat gatgagaagt caacaggtgg tatttccgtt780ccaggtccta tgggaccatc cggaccaaga ggtctcccag gtcctccagg tgctcctgga840cctcaaggct ttcaaggacc tccaggcgaa ccaggagaac caggcgcttc tggaccaatg900ggcccaaggg gaccacctgg cccaccagga aaaaatggcg atgatggcga agctggaaag960cctggtcgtc ctggagagag aggtcctcct ggcccacagg gtgcaagagg cttgccagga1020actgctggct tgcctggaat gaagggacat aggggcttct ccggcctcga tggcgctaag1080ggtgatgctg gccctgctgg accaaagggc gagccaggtt cccctggaga aaacggtgct1140cctggacaaa tgggtcctcg tggacttcca ggagaaaggg gtcgtccagg cgctccagga1200ccagcaggtg ctaggggaaa cgatggtgca acaggcgctg ctggccctcc tggcccaact1260ggtcctgctg gccctccagg attcccaggc gcagttggag ctaaaggaga agcaggacca1320cagggcccta ggggttctga aggacctcag ggtgttagag gtgaaccagg tcctccaggc1380ccagctggag cagctggtcc agcaggaaat ccaggtgctg atggtcaacc tggagctaag1440ggcgctaatg gcgcaccagg tatcgcaggc gcaccaggtt ttcctggcgc tagaggccca1500agtggtcctc aaggaccagg tggaccacca ggtccaaaag gcaattctgg cgaacctggc1560gctccaggtt ctaaaggaga tactggtgct aaaggcgaac caggacctgt tggtgttcag1620ggtcctcctg gtcctgctgg agaagaagga aaaagaggtg ctcgtggaga accaggacca1680actggacttc ctggacctcc tggtgaacgt ggcggacctg gctcaagggg tttccctgga1740gctgatggag tggcaggtcc aaaaggccct gctggagaga gaggttcacc aggtccagct1800ggtcctaagg gctcccctgg tgaagcaggt agaccaggcg aagcaggatt gccaggcgca1860aagggattga caggctctcc tggtagtcct ggcccagatg gaaaaacagg cccaccaggt1920ccagcaggac aagatggacg tccaggccca ccaggtcctc ctggagcaag gggacaagct1980
ggcgttatgg gttttccagg acctaaaggt gctgctggag agccaggaaa ggcaggtgaa2040agaggagttc ctggtccacc aggagcagtg ggtcctgctg gcaaagatgg tgaagctgga2100gcacagggcc ctccaggccc tgctggccca gctggcgaac gtggagaaca aggcccagct2160ggtagtccag gatttcaagg attgcctggc cctgctggcc ctccaggaga agcaggaaaa2220cctggagaac aaggagttcc tggtgatttg ggagcacctg gaccttcagg agcacgtggt2280gaaagaggct tccctggcga gaggggtgtt caaggtccac caggtccagc aggacctaga2340ggtgctaatg gcgctcctgg caacgatgga gcaaaaggtg atgctggtgc tcctggcgca2400cctggaagtc agggtgctcc tggattgcaa ggaatgcctg gagagagggg tgctgctggc2460ttgccaggcc caaagggcga taggggtgat gctggaccaa aaggtgctga tggatcccca2520ggaaaagatg gagttcgtgg tcttactggc ccaatcggac ctccaggccc tgctggcgct2580ccaggtgata agggcgaaag tggcccaagt ggacctgctg gacctactgg tgctagaggt2640gcacctggtg ataggggtga acctggacca cctggtccag ctggttttgc tggtcctcct2700ggagctgatg gacaacctgg cgcaaagggt gaaccaggtg atgctggcgc aaagggagat2760gctggtccac ctggacctgc tggtccagca ggcccccctg ggccaatcgg taatgttgga2820gcaccaggtg ctaagggagc taggggttcc gctggtccac ctggagcaac aggatttcca2880ggcgctgctg gtagagttgg cccaccaggc ccatccggaa acgcaggccc tcctggtcct2940ccaggtcctg ctggcaagga gggtggcaaa ggaccaaggg gcgaaactgg ccctgctggt3000agacctggcg aagttggccc tcctggacca ccaggtccag caggagaaaa aggttcccca3060ggagctgatg gcccagctgg tgctccagga actccaggcc ctcaaggtat tgctggacag3120agaggcgttg tgggactccc tggtcaaagg ggagagagag gatttccagg cttgccagga3180cctagtggag aacctggaaa acaaggccca tcaggcgcta gtggagagcg tggacctcct3240ggccctatgg gacctcctgg attggctggc ccacctggcg aatcaggtcg tgaaggcgca3300
ccaggcgcag aaggatcacc tggaagagat ggatcccctg gtgctaaagg cgatcgtgga3360gaaactggtc cagcaggccc accaggcgca ccaggtgcac ctggcgctcc aggacctgtg3420ggaccagctg gaaaatccgg agataggggc gagacaggcc cagcaggacc agctggacct3480gttggccctg ctggcgctcg tggaccagca ggacctcaag gaccaagggg agataaggga3540gaaacaggcg aacaaggcga taggggcatt aagggtcata ggggttttag tggcctccag3600ggtcctcctg gcccacctgg atcaccagga gaacagggac catctggtgc ttccggccca3660gctggtccaa gaggacctcc aggatcagct ggtgcacctg gaaaagatgg tcttaacggt3720ctcccaggac caatcggccc tccaggacct agaggaagaa caggagatgc tggccctgtt3780ggccctccag gacctcctgg tccaccaggt ccacctggtc ctccatcagc tggattcgat3840ttttcatttc ttccacagcc accacaagag aaagctcacg atggcggcag atattaccgt3900gctgatgatg ctaacgttgt tagggataga gatttggaag tggatacaac tttgaaatcc3960ctctcccagc aaattgaaaa cattagatct ccagaaggtt cacgtaaaaa cccagctaga4020acatgtcgtg atttgaaaat gtgtcactcc gattggaaaa gtggtgaata ctggattgat4080ccaaatcagg gctgtaatct cgatgctatc aaagttttct gtaacatgga aacaggcgaa4140acatgcgttt atcctactca accttccgtg gctcagaaaa attggtacat ctcaaaaaat4200cctaaagata agaggcacgt ttggttcggt gaaagtatga ctgatggatt tcaatttgag4260tacggcggtc aaggtagtga tccagctgat gtggctattc aactcacatt tttgcgtctt4320atgtccacag aggcatcaca aaacatcact taccactgca aaaacagtgt ggcttatatg4380gatcaacaaa caggaaacct taagaaggct cttcttttga agggctcaaa cgagattgag4440attagagcag agggcaactc aaggtttact tattcagtta ctgttgatgg ctgcacttca4500catactggcg cttggggtaa aacagttatc gagtataaga ctacaaaaac atcaagactc4560ccaatcattg atgttgctcc tctcgatgtt ggcgctcctg atcaagagtt cggttttgat4620
gtgggcccag tttgtttcct ctaatgagct cgcggccgca tc 4662<210>2<211>4662<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>与人胶原α1(I)链融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列和侧翼区的合成序列<220>
<221>CDS<222>(175)..(4644)<400>2gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag 60atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg 120aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aacc atg 177Met1gct cac gct cgt gtt ctc ctc ctc gct ctc gct gtt ttg gca aca gct 225Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr Ala5 10 15gct gtg gct gtg gct tct agt tct tct ttt gct gat tca aac cct att 273Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro Ile20 25 30aga cct gtt act gat aga gca gct tcc act ttg gct caa ttg caa gag 321Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Gln Glu35 40 45gag ggc cag gtt gag ggc caa gat gag gat atc cct cca att aca tgc 369Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys50 55 60 65gtg caa aat ggc ttg cgt tac cac gat agg gat gtg tgg aaa cct gaa 417Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu
70 75 80cct tgt cgt atc tgt gtg tgt gat aac ggc aag gtg ctc tgc gat gat465Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp Asp85 90 95gtt atc tgc gat gag aca aaa aat tgc cct ggc gct gaa gtt cct gag513Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu100 105 110ggc gag tgt tgc cct gtg tgc cct gat ggt tcc gag tcc cca act gat561Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr Asp115 120 125cag gaa act act ggc gtg gag ggc cca aaa gga gat act ggt cca cgt609Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg130 135 140 145ggt cct agg ggt cca gca ggt cct cca ggt aga gat ggt att cca ggc657Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly150 155 160cag cct gga ttg cca gga cca cca ggc cca cct ggc cca cca gga cct705Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro165 170 175cct ggt ctt ggt gga aat ttc gct cca caa ctc tct tat ggc tat gat753Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp180 185 190gag aag tca aca ggt ggt att tcc gtt cca ggt cct atg gga cca tcc801Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser Val Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser195 200 205gga cca aga ggt ctc cca ggt cct cca ggt gct cct gga cct caa ggc849Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly210 215 220 225ttt caa gga cct cca ggc gaa cca gga gaa cca ggc gct tct gga cca897Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly Pro230 235 240atg ggc cca agg gga cca cct ggc cca cca gga aaa aat ggc gat gat945Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp Asp
245 250 255ggc gaa gct gga aag cct ggt cgt cct gga gag aga ggt cct cct ggc 993Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly260 265 270cca cag ggt gca aga ggc ttg cca gga act gct ggc ttg cct gga atg1041Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly Met275 280 285aag gga cat agg ggc ttc tcc ggc ctc gat ggc gct aag ggt gat gct1089Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala290 295 300 305ggc cct gct gga cca aag ggc gag cca ggt tcc cct gga gaa aac ggt1137Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn Gly310 315 320gct cct gga caa atg ggt cct cgt gga ctt cca gga gaa agg ggt cgt1185Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg325 330 335cca ggc gct cca gga cca gca ggt gct agg gga aac gat ggt gca aca1233Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Thr340 345 350ggc gct gct ggc cct cct ggc cca act ggt cct gct ggc cct cca gga1281Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly355 360 365ttc cca ggc gca gtt gga gct aaa gga gaa gca gga cca cag ggc cct1329Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly Pro370 375 380 385agg ggt tct gaa gga cct cag ggt gtt aga ggt gaa cca ggt cct cca1377Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro390 395 400ggc cca gct gga gca gct ggt cca gca gga aat cca ggt gct gat ggt1425Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp Gly405 410 415caa cct gga gct aag ggc gct aat ggc gca cca ggt atc gca ggc gca1473Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly Ala
420 425 430cca ggt ttt cct ggc gct aga ggc cca agt ggt cct caa gga cca ggt1521Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro Gly435 440 445gga cca cca ggt cca aaa ggc aat tct ggc gaa cct ggc gct cca ggt1569Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly450 455 460 465tct aaa gga gat act ggt gct aaa ggc gaa cca gga cct gtt ggt gtt1617Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Val470 475 480cag ggt cct cct ggt cct gct gga gaa gaa gga aaa aga ggt gct cgt1665Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg485 490 495gga gaa cca gga cca act gga ctt cct gga cct cct ggt gaa cgt ggc1713Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly500 505 510gga cct ggc tca agg ggt ttc cct gga gct gat gga gtg gca ggt cca1761Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro515 520 525aaa ggc cct gct gga gag aga ggt tca cca ggt cca gct ggt cct aag1809Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys530 535 540 545ggc tcc cct ggt gaa gca ggt aga cca ggc gaa gca gga ttg cca ggc1857Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly550 555 560gca aag gga ttg aca ggc tct cct ggt agt cct ggc cca gat gga aaa1905Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys565 570 575aca ggc cca cca ggt cca gca gga caa gat gga cgt cca ggc cca cca1953Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro580 585 590ggt cct cct gga gca agg gga caa gct ggc gtt atg ggt ttt cca gga2001Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly Val Met Gly Phe Pro Gly
595 600 605cct aaa ggt gct gct gga gag cca gga aag gca ggt gaa aga gga gtt2049Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val610 615 620 625cct ggt cca cca gga gca gtg ggt cct gct ggc aaa gat ggt gaa gct2097Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala630 635 640gga gca cag ggc cct cca ggc cct gct ggc cca gct ggc gaa cgt gga2145Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly645 650 655gaa caa ggc cca gct ggt agt cca gga ttt caa gga ttg cct ggc cct2193Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro660 665 670gct ggc cct cca gga gaa gca gga aaa cct gga gaa caa gga gtt cct2241Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro675 680 685ggt gat ttg gga gca cct gga cct tca gga gca cgt ggt gaa aga ggc2289Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly690 695 700 705ttc cct ggc gag agg ggt gtt caa ggt cca cca ggt cca gca gga cct2337Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro710 715 720aga ggt gct aat ggc gct cct ggc aac gat gga gca aaa ggt gat gct2385Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala725 730 735ggt gct cct ggc gca cct gga agt cag ggt gct cct gga ttg caa gga2433Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly740 745 750atg cct gga gag agg ggt gct gct ggc ttg cca ggc cca aag ggc gat2481Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp755 760 765agg ggt gat gct gga cca aaa ggt gct gat gga tcc cca gga aaa gat2529Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys Asp
770 775 780 785gga gtt cgt ggt ctt act ggc cca atc gga cct cca ggc cct gct ggc2577Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly790 795 800gct cca ggt gat aag ggc gaa agt ggc cca agt gga cct gct gga cct2625Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro805 810 815act ggt gct aga ggt gca cct ggt gat agg ggt gaa cct gga cca cct2673Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro820 825 830ggt cca gct ggt ttt gct ggt cct cct gga gct gat gga caa cct ggc2721Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly835 840 845gca aag ggt gaa cca ggt gat gct ggc gca aag gga gat gct ggt cca2769Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro850 855 860 865cct gga cct gct ggt cca gca ggc ccc cct ggg cca atc ggt aat gtt2817Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val870 875 880gga gca cca ggt gct aag gga gct agg ggt tcc gct ggt cca cct gga2865Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly885 890 895gca aca gga ttt cca ggc gct gct ggt aga gtt ggc cca cca ggc cca2913Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro900 905 910tcc gga aac gca ggc cct cct ggt cct cca ggt cct gct ggc aag gag2961Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu915 920 925ggt ggc aaa gga cca agg ggc gaa act ggc cct gct ggt aga cct ggc3009Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly930 935 940 945gaa gtt ggc cct cct gga cca cca ggt cca gca gga gaa aaa ggt tcc3057Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser
950 955 960cca gga gct gat ggc cca gct ggt gct cca gga act cca ggc cct caa3105Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln965 970 975ggt att gct gga cag aga ggc gtt gtg gga ctc cct ggt caa agg gga3153Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly980 985 990gag aga gga ttt cca ggc ttg cca gga cct agt gga gaa cct gga aaa 3201Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys995 1000 1005caa ggc cca tca ggc gct agt gga gag cgt gga cct cct ggc cct 3246Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro1010 1015 1020atg gga cct cct gga ttg gct ggc cca cct ggc gaa tca ggt cgt 3291Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Arg1025 1030 1035gaa ggc gca cca ggc gca gaa gga tca cct gga aga gat gga tcc 3336Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly Ser1040 1045 1050cct ggt gct aaa ggc gat cgt gga gaa act ggt cca gca ggc cca 3381Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro1055 1060 1065cca ggc gca cca ggt gca cct ggc gct cca gga cct gtg gga cca 3426Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly Pro1070 1075 1080gct gga aaa tcc gga gat agg ggc gag aca ggc cca gca gga cca 3471Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro1085 1090 1095gct gga cct gtt ggc cct gct ggc gct cgt gga cca gca gga cct 3516Ala Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro1100 1105 1110caa gga cca agg gga gat aag gga gaa aca ggc gaa caa ggc gat 3561Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp
1115 1120 1125agg ggc att aag ggt cat agg ggt ttt agt ggc ctc cag ggt cct3606Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro1130 1135 1140cct ggc cca cct gga tca cca gga gaa cag gga cca tct ggt gct3651Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala1145 1150 1155tcc ggc cca gct ggt cca aga gga cct cca gga tca gct ggt gca3696Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala1160 1165 1170cct gga aaa gat ggt ctt aac ggt ctc cca gga cca atc ggc cct3741Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro1175 1180 1185cca gga cct aga gga aga aca gga gat gct ggc cct gtt ggc cct3786Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro1190 1195 1200cca gga cct cct ggt cca cca ggt cca cct ggt cct cca tca gct3831Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala1205 1210 1215gga ttc gat ttt tca ttt ctt cca cag cca cca caa gag aaa gct3876Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala1220 1225 1230cac gat ggc ggc aga tat tac cgt gct gat gat gct aac gtt gtt3921His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val Val1235 1240 1245agg gat aga gat ttg gaa gtg gat aca act ttg aaa tcc ctc tcc3966Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser1250 1255 1260cag caa att gaa aac att aga tct cca gaa ggt tca cgt aaa aac4011Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn1265 1270 1275cca gct aga aca tgt cgt gat ttg aaa atg tgt cac tcc gat tgg4056Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser Asp Trp
1280 1285 1290aaa agt ggt gaa tac tgg att gat cca aat cag ggc tgt aat ctc4101Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn Leu1295 1300 1305gat gct atc aaa gtt ttc tgt aac atg gaa aca ggc gaa aca tgc4146Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys1310 1315 1320gtt tat cct act caa cct tcc gtg gct cag aaa aat tgg tac atc4191Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr Ile1325 1330 1335tca aaa aat cct aaa gat aag agg cac gtt tgg ttc ggt gaa agt4236Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser1340 1345 1350atg act gat gga ttt caa ttt gag tac ggc ggt caa ggt agt gat4281Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp1355 1360 1365cca gct gat gtg gct att caa ctc aca ttt ttg cgt ctt atg tcc4326Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser1370 1375 1380aca gag gca tca caa aac atc act tac cac tgc aaa aac agt gtg4371Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val1385 1390 1395gct tat atg gat caa caa aca gga aac ctt aag aag gct ctt ctt4416Ala Tyr Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu1400 1405 1410ttg aag ggc tca aac gag att gag att aga gca gag ggc aac tca4461Leu Lys Gly Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser1415 1420 1425agg ttt act tat tca gtt act gtt gat ggc tgc act tca cat act4506Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr1430 1435 1440ggc gct tgg ggt aaa aca gtt atc gag tat aag act aca aaa aca4551Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr
1445 1450 1455tca aga ctc cca atc att gat gtt gct cct ctc gat gtt ggc gct4596Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala1460 1465 1470cct gat caa gag ttc ggt ttt gat gtg ggc cca gtt tgt ttc ctc4641Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro Val Cys Phe Leu1475 1480 1485taa tgagctcgcg gccgcatc 4662<210>3<211>1489<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>与人胶原α1(I)链融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列和侧翼区的合成序列<400>3Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Gln35 40 45Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr50 55 60Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro65 70 75 80
Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp85 90 95Asp Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro100 105 110Glu Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr115 120 125Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro130 135 140Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro145 150 155 160Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly165 170 175Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr180 185 190Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser Val Pro Gly Pro Met Gly Pro195 200 205Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln210 215 220Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly225 230 235 240Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp245 250 255
Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro260 265 270Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly275 280 285Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp290 295 300Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn305 310 315 320Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly325 330 335Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala340 345 350Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro355 360 365Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly370 375 380Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro385 390 395 400Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp405 410 415Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly420 425 430
Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro435 440 445Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro450 455 460Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly465 470 475 480Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala485 490 495Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg500 505 510Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly515 520 525Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro530 535 540Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro545 550 555 560Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly565 570 575Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro580 585 590Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly Val Met Gly Phe Pro595 600 605
Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly610 615 620Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu625 630 635 640Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg645 650 655Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly660 665 670Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val675 680 685Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg690 695 700Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly705 710 715 720Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp725 730 735Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln740 745 750Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly755 760 765Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys770 775 780
Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala785 790 795 800Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly805 810 815Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro820 825 830Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro835 840 845Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly850 855 860Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn865 870 875 880Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro885 890 895Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly900 905 910Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys915 920 925Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro930 935 940Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly945 950 955 960
Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro965 970 975Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg980 985 990Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly995 1000 1005Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly1010 1015 1020Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly1025 1030 1035Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly1040 1045 1050Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly1055 1060 1065Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly1070 1075 1080Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly1085 1090 1095Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly1100 1105 1110Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly1115 1120 1125
Asp Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly1130 1135 1140Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly1145 1150 1155Ala Ser Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly1160 1165 1170Ala Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly1175 1180 1185Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly1190 1195 1200Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser1205 1210 1215Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys1220 1225 1230Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val1235 1240 1245Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys Ser Leu1250 1255 1260Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg Lys1265 1270 1275Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser Asp1280 1285 1290
Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn1295 1300 1305Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr1310 1315 1320Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr1325 1330 1335Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu1340 1345 1350Ser Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser1355 1360 1365Asp Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met1370 1375 1380Ser Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser1385 1390 1395Val Ala Tyr Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu1400 1405 1410Leu Leu Lys Gly Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn1415 1420 1425Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His1430 1435 1440Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys1445 1450 1455
Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly1460 1465 1470Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro Val Cys Phe1475 1480 1485Leu<210>4<211>4362<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有与人胶原α2(I)链融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列编码区和侧翼区的合成序列<400>4gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag60atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg120aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aaccatggct180cacgctcgtg ttctcctcct cgctctcgct gttttggcaa cagctgctgt ggctgtggct240tcaagttcta gttttgctga ttccaaccca attcgtccag ttactgatag agcagcttcc300actttggctc aattgcttca agaagaaact gtgaggaagg gccctgctgg cgataggggc360cctaggggcg aaaggggtcc accaggacct ccaggcaggg atggcgaaga tggtccaact420ggccctcctg gacctcctgg ccctccaggg ccacccggct tgggcggaaa cttcgcagct480caatacgatg gcaagggtgt tggtcttggt cctggtccta tgggcttgat gggacctaga540ggcccacctg gtgctgctgg tgctcctgga ccacagggtt ttcagggacc agctggcgag600ccaggagagc caggccaaac aggaccagct ggtgcaaggg gacctgctgg acctcctgga660
aaagctggtg aagatggtca cccaggcaaa ccaggacgtc ctggcgaaag aggtgttgtt720ggaccacaag gcgctagggg atttccaggt acacctggat tgccaggttt taagggcatt780cgtggtcata acggcctcga tggattgaag ggacagcctg gcgcacctgg cgttaagggt840gaacctggag caccaggtga aaacggtact cctggccaga ctggtgcaag aggactccca900ggtgaaaggg gtagagttgg tgctcctgga cctgctggag ctaggggtag tgatggtagt960gttggtcctg tgggccctgc tggtccaatc ggttccgctg gcccacctgg attcccaggc1020gctccaggac ctaaaggaga aatcggtgct gtgggtaacg caggtcctac tggtccagca1080ggtcctcgtg gagaagtggg attgccagga ctttctggtc cagtgggccc tccaggcaac1140cctggagcta acggcttgac aggagctaaa ggcgcagcag gactccctgg agtggctggc1200gcaccaggat tgcctggtcc aaggggtatc ccaggccctg ttggcgcagc tggagctact1260ggtgcacgtg gacttgttgg cgaaccaggc cctgctggat caaaaggcga gtctggaaat1320aagggagaac ctggttctgc tggacctcaa ggtcctcctg gaccttctgg agaagaagga1380aaaaggggac caaatggcga ggctggatca gcaggtccac caggaccacc tggacttcgt1440ggatcccctg gtagtagagg acttccaggc gctgatggta gagcaggcgt tatgggacca1500ccaggaagta gaggagcatc cggtccagca ggagttaggg gtcctaacgg agatgctggt1560agaccaggtg aaccaggtct tatgggccca aggggcctcc caggtagtcc aggaaatatc1620ggccctgctg gaaaagaagg ccctgttgga cttccaggta ttgatggacg tcctggccct1680attggcccag caggtgcaag aggagaacct ggcaatattg gatttccagg accaaagggt1740ccaacaggcg atcctggaaa aaatggagat aagggtcatg ctggattggc aggcgcaagg1800ggcgctcctg gtccagatgg aaacaacggc gcacagggtc cacctggccc tcagggtgtt1860caaggcggaa aaggcgaaca aggcccagct ggaccaccag gctttcaagg cttgccagga1920ccaagtggtc cagcaggtga agttggcaag ccaggcgagc gtggacttca tggcgagttt1980
ggactccctg gaccagcagg accaaggggt gaaagaggcc ctcctggaga gagtggcgct2040gctggaccaa caggcccaat cggtagtaga ggtcctagtg gacctccagg cccagatgga2100aataagggtg aaccaggagt tgtgggcgct gttggaacag ctggtccttc aggaccatca2160ggactcccag gcgagagagg cgctgctggc attcctggag gaaaaggtga aaaaggcgaa2220cctggcctcc gtggcgaaat cggaaatcct ggacgtgatg gtgctcgtgg tgcacacggc2280gctgtgggcg ctccaggccc tgctggtgct actggtgata gaggagaggc tggcgcagct2340ggcccagcag gtcctgctgg cccaaggggt agtcctggtg aaagaggcga agttggacct2400gctggcccta acggctttgc tggccctgct ggagcagcag gtcaacctgg cgctaaaggt2460gaaaggggcg gaaagggccc aaaaggtgaa aatggcgttg tgggaccaac tggtccagtg2520ggcgcagctg gacctgctgg tccaaatgga ccaccaggac cagcaggtag tagaggagat2580ggtggacctc caggaatgac aggttttcca ggtgctgctg gtagaacagg acctcctggt2640cctagtggta tttctggtcc accaggacca ccaggtcctg ctggaaaaga aggattgagg2700ggtccacgtg gtgatcaagg accagtgggc agaactggtg aagttggcgc agtgggacca2760cctggttttg ctggagaaaa gggcccttct ggagaggcag gaacagctgg tcctcctggt2820acacctggac ctcaaggact tttgggtgca cctggtattc tcggattgcc aggaagtagg2880ggcgaacgtg gacttcctgg cgtggcagga gcagttggag aacctggccc tctcggaatc2940gcaggcccac caggcgcaag aggaccacca ggagctgttg gatcaccagg cgtgaatggt3000gcacctggcg aggctggtcg tgatggaaac ccaggaaatg atggcccacc aggaagagat3060ggtcaacctg gacacaaagg cgagaggggc tacccaggaa atattggccc agttggtgct3120gctggcgcac caggcccaca cggtccagtt ggaccagcag gaaaacacgg taatcgtggc3180gaaacaggcc cttcaggccc agtgggacct gctggtgctg ttggcccaag aggaccatct3240ggacctcaag gcattagagg cgataaggga gagcctggcg aaaaaggacc tagaggcttg3300
cctggtttta aaggacacaa cggtctccaa ggacttccag gtatcgctgg tcatcatgga3360gatcagggtg ctcctggatc agtgggtcca gcaggtccta gaggcccagc aggcccttcc3420ggtccagcag gaaaggatgg acgtactggc caccctggaa ctgtgggccc tgctggaatt3480agaggtcctc aaggtcatca gggccctgct ggccctccag gtccaccagg tcctccaggc3540ccaccaggag tttcaggtgg tggttacgat tttggttacg atggtgattt ttaccgtgct3600gatcaaccta gaagtgctcc ttctctccgt cctaaagatt atgaagttga tgctactttg3660aaatcactta acaaccagat tgagactctt ctcacacctg agggatcaag aaagaatcca3720gcacgtacat gccgtgatct cagacttagt cacccagagt ggtcaagtgg ctattattgg3780attgatccta atcagggttg tacaatggag gctatcaaag tttactgtga ttttccaact3840ggagagacat gtattagggc acaacctgag aacattccag ctaaaaattg gtatcgttcc3900tctaaagata agaaacatgt ttggctcgga gagactatta acgctggttc tcagttcgag3960tataatgttg agggcgttac ttctaaagag atggcaactc agctcgcttt tatgagattg4020ctcgctaact acgcatccca aaacatcact tatcactgca aaaattccat tgcatatatg4080gatgaggaga caggaaattt gaagaaagca gttattctcc aaggtagtaa cgatgttgag4140cttgtggctg agggaaatag tagattcact tacacagttt tggtggatgg atgctcaaag4200aaaactaatg agtggggcaa gacaatcatt gagtacaaga caaataagcc ttctaggctc4260ccatttctcg atattgcacc tcttgatatc ggaggagctg atcacgagtt ttttgttgat4320atcggacctg tttgttttaa gtaatgagct cgcggccgca tc 4362<210>5<211>4362<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>与人胶原α2(I)链融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列和侧翼区的合成序列<220>
<221>CDS<222>(175)..(4344)<400>5gcgatgcatg taatgtcatg agccacatga tccaatggcc acaggaacgt aagaatgtag 60atagatttga ttttgtccgt tagatagcaa acaacattat aaaaggtgtg tatcaatacg 120aactaattca ctcattggat tcatagaagt ccattcctcc taagtatcta aacc atg177Met1gct cac gct cgt gtt ctc crc ctc gct ctc gct gtt ttg gca aca gct225Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr Ala5 10 15gct gtg gct gtg gct tca agt tct agt ttt gct gat tcc aac cca att273Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro Ile20 25 30cgt cca gtt act gat aga gca gct tcc act ttg gct caa ttg ctt caa321Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Leu Gln35 40 45gaa gaa act gtg agg aag ggc cct gct ggc gat agg ggc cct agg ggc369Glu Glu Thr Val Arg Lys Gly Pro Ala Gly Asp Arg Gly Pro Arg Gly50 55 60 65gaa agg ggt cca cca gga cct cca ggc agg gat ggc gaa gat ggt cca417Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Glu Asp Gly Pro70 75 80act ggc cct cct gga cct cct ggc cct cca ggg cca ccc ggc ttg ggc465Thr Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly85 90 95gga aac ttc gca gct caa tac gat ggc aag ggt gtt ggt ctt ggt cct513Gly Asn Phe Ala Ala Gln Tyr Asp Gly Lys Gly Val Gly Leu Gly Pro100 105 110
ggt cct atg ggc ttg atg gga cct aga ggc cca cct ggt gct gct ggt561Gly Pro Met Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly115 120 125gct cct gga cca cag ggt ttt cag gga cca gct ggc gag cca gga gag609Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Glu130 135 140 145cca ggc caa aca gga cca gct ggt gca agg gga cct gct gga cct cct657Pro Gly Gln Thr Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro150 155 160gga aaa gct ggt gaa gat ggt cac cca ggc aaa cca gga cgt cct ggc705Gly Lys Ala Gly Glu Asp Gly His Pro Gly Lys Pro Gly Arg Pro Gly165 170 175gaa aga ggt gtt gtt gga cca caa ggc gct agg gga ttt cca ggt aca753Glu Arg Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly Thr180 185 190cct gga ttg cca ggt ttt aag ggc att cgt ggt cat aac ggc ctc gat801Pro Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg Gly His Asn Gly Leu Asp195 200 205gga ttg aag gga cag cct ggc gca cct ggc gtt aag ggt gaa cct gga849Gly Leu Lys Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Pro Gly210 215 220 225gca cca ggt gaa aac ggt act cct ggc cag act ggt gca aga gga ctc897Ala Pro Gly Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala Arg Gly Leu230 235 240cca ggt gaa agg ggt aga gtt ggt gct cct gga cct gct gga gct agg945Pro Gly Glu Arg Gly Arg Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Arg245 250 255ggt agt gat ggt agt gtt ggt cct gtg ggc cct gct ggt cca atc ggt993Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile Gly260 265 270tcc gct ggc cca cct gga ttc cca ggc gct cca gga cct aaa gga gaa 1041Ser Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly Glu275 280 285
atc ggt gct gtg ggt aac gca ggt cct act ggt cca gca ggt cct cgt1089Ile Gly Ala Val Gly Asn Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro Arg290 295 300 305gga gaa gtg gga ttg cca gga ctt tct ggt cca gtg ggc cct cca ggc1137Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Leu Ser Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly310 315 320aac cct gga gct aac ggc ttg aca gga gct aaa ggc gca gca gga ctc1185Asn Pro Gly Ala Asn Gly Leu Thr Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Leu325 330 335cct gga gtg gct ggc gca cca gga ttg cct ggt cca agg ggt atc cca1233Pro Gly Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Ile Pro340 345 350ggc cct gtt ggc gca gct gga gct act ggt gca cgt gga ctt gtt ggc1281Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg Gly Leu Val Gly355 360 365gaa cca ggc cct gct gga tca aaa ggc gag tct gga aat aag gga gaa1329Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Lys Gly Glu Ser Gly Asn Lys Gly Glu370 375 380 385cct ggt tct gct gga cct caa ggt cct cct gga cct tct gga gaa gaa1377Pro Gly Ser Ala Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Glu Glu390 395 400gga aaa agg gga cca aat ggc gag gct gga tca gca ggt cca cca gga1425Gly Lys Arg Gly Pro Asn Gly Glu Ala Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly405 410 415cca cct gga ctt cgt gga tcc cct ggt agt aga gga ctt cca ggc gct1473Pro Pro Gly Leu Arg Gly Ser Pro Gly Ser Arg Gly Leu Pro Gly Ala420 425 430gat ggt aga gca ggc gtt atg gga cca cca gga agt aga gga gca tcc1521Asp Gly Arg Ala Gly Val Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Ala Ser435 440 445ggt cca gca gga gtt agg ggt cct aac gga gat gct ggt aga cca ggt1569Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly Arg Pro Gly450 455 460 465
gaa cca ggt ctt atg ggc cca agg ggc ctc cca ggt agt cca gga aat1617Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly Asn470 475 480atc ggc cct gct gga aaa gaa ggc cct gtt gga ctt cca ggt att gat1665Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Ile Asp485 490 495gga cgt cct ggc cct att ggc cca gca ggt gca aga gga gaa cct ggc1713Gly Arg Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly500 505 510aat att gga ttt cca gga cca aag ggt cca aca ggc gat cct gga aaa1761Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp Pro Gly Lys515 520 525aat gga gat aag ggt cat gct gga ttg gca ggc gca agg ggc gct cct1809Asn Gly Asp Lys Gly His Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg Gly Ala Pro530 535 540 545ggt cca gat gga aac aac ggc gca cag ggt cca cct ggc cct cag ggt1857Gly Pro Asp Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly550 555 560gtt caa ggc gga aaa ggc gaa caa ggc cca gct gga cca cca ggc ttt1905Val Gln Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe565 570 575caa ggc ttg cca gga cca agt ggt cca gca ggt gaa gtt ggc aag cca1953Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val Gly Lys Pro580 585 590ggc gag cgt gga ctt cat ggc gag ttt gga ctc cct gga cca gca gga2001Gly Glu Arg Gly Leu His Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly595 600 605cca agg ggt gaa aga ggc cct cct gga gag agt ggc gct gct gga cca2049Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly Pro610 615 620 625aca gge cca atc ggt agt aga ggt cct agt gga cct cca ggc cca gat2097Thr Gly Pro Ile Gly Ser Arg Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Asp630 635 640
gga aat aag ggt gaa cca gga gtt gtg ggc gct gtt gga aca gct ggt2145Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Val Val Gly Ala Val Gly Thr Ala Gly645 650 655cct tca gga cca tca gga ctc cca ggc gag aga ggc gct gct ggc att2193Pro Ser Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile660 665 670cct gga gga aaa ggt gaa aaa ggc gaa cct ggc ctc cgt ggc gaa atc2241Pro Gly Gly Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Leu Arg Gly Glu Ile675 680 685gga aat cct gga cgt gat ggt gct cgt ggt gca cac ggc gct gtg ggc2289Gly Asn Pro Gly Arg Asp Gly Ala Arg Gly Ala His Gly Ala Val Gly690 695 700 705gct cca ggc cct gct ggt gct act ggt gat aga gga gag gct ggc gca2337Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly Ala710 715 720gct ggc cca gca ggt cct gct ggc cca agg ggt agt cct ggt gaa aga2385Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu Arg725 730 735ggc gaa gtt gga cct gct ggc cct aac ggc ttt gct ggc cct gct gga2433Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Phe Ala Gly Pro Ala Gly740 745 750gca gca ggt caa cct ggc gct aaa ggt gaa agg ggc gga aag ggc cca2481Ala Ala Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Gly Lys Gly Pro755 760 765aaa ggt gaa aat ggc gtt gtg gga cca act ggt cca gtg ggc gca gct2529Lys Gly Glu Asn Gly Val Val Gly Pro Thr Gly Pro Val Gly Ala Ala770 775 780 785gga cct gct ggt cca aat gga cca cca gga cca gca ggt agt aga gga2577Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg Gly790 795 800gat ggt gga cct cca gga atg aca ggt ttt cca ggt gct gct ggt aga2625Asp Gly Gly Pro Pro Gly Met Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly Arg805 810 815
aca gga cct cct ggt cct agt ggt att tct ggt cca cca gga cca cca2673Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ile Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro820 825 830ggt cct gct gga aaa gaa gga ttg agg ggt cca cgt ggt gat caa gga2721Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Leu Arg Gly Pro Arg Gly Asp Gln Gly835 840 845cca gtg ggc aga act ggt gaa gtt ggc gca gtg gga cca cct ggt ttt2769Pro Val Gly Arg Thr Gly Glu Val Gly Ala Val Gly Pro Pro Gly Phe850 855 860 865gct gga gaa aag ggc cct tct gga gag gca gga aca gct ggt cct cct2817Ala Gly Glu Lys Gly Pro Ser Gly Glu Ala Gly Thr Ala Gly Pro Pro870 875 880ggt aca cct gga cct caa gga ctt ttg ggt gca cct ggt att ctc gga2865Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly885 890 895ttg cca gga agt agg ggc gaa cgt gga ctt cct ggc gtg gca gga gca2913Leu Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala900 905 910gtt gga gaa cct ggc cct ctc gga atc gca ggc cca cca ggc gca aga2961Val Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Pro Pro Gly Ala Arg915 920 925gga cca cca gga gct gtt gga tca cca ggc gtg aat ggt gca cct ggc3009Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Ser Pro Gly Val Asn Gly Ala Pro Gly930 935 940 945gag gct ggt cgt gat gga aac cca gga aat gat ggc cca cca gga aga3057Glu Ala Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Asn Asp Gly Pro Pro Gly Arg950 955 960gat ggt caa cct gga cac aaa ggc gag agg ggc tac cca gga aat att3105Asp Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Glu Arg Gly Tyr Pro Gly Asn Ile965 970 975ggc cca gtt ggt gct gct ggc gca cca ggc cca cac ggt cca gtt gga3153Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Pro Gly Pro His Gly Pro Val Gly980 985 990
cca gca gga aaa cac ggt aat cgt ggc gaa aca ggc cct tca ggc cca 3201Pro Ala Gly Lys His Gly Asn Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ser Gly Pro995 1000 1005gtg gga cct gct ggt gct gtt ggc cca aga gga cca tct gga cct3246Val Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro1010 1015 1020caa ggc att aga ggc gat aag gga gag cct ggc gaa aaa gga cct3291Gln Gly Ile Arg Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Glu Lys Gly Pro1025 1030 1035aga ggc ttg cct ggt ttt aaa gga cac aac ggt ctc caa gga ctt3336Arg Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly His Asn Gly Leu Gln Gly Leu1040 1045 1050cca ggt atc gct ggt cat cat gga gat cag ggt gct cct gga tca3381Pro Gly Ile Ala Gly His His Gly Asp Gln Gly Ala Pro Gly Ser1055 1060 1065gtg ggt cca gca ggt cct aga ggc cca gca ggc cct tcc ggt cca3426Val Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly Pro1070 1075 1080gca gga aag gat gga cgt act ggc cac cct gga act gtg ggc cct3471Ala Gly Lys Asp Gly Arg Thr Gly His Pro Gly Thr Val Gly Pro1085 1090 1095gct gga att aga ggt cct caa ggt cat cag ggc cct gct ggc cct3516Ala Gly Ile Arg Gly Pro Gln Gly His Gln Gly Pro Ala Gly Pro1100 1105 1110cca ggt cca cca ggt cct cca ggc cca cca gga gtt tca ggt ggt3561Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Ser Gly Gly1115 1120 1125ggt tac gat ttt ggt tac gat ggt gat ttt tac cgt gct gat caa3606Gly Tyr Asp Phe Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Tyr Arg Ala Asp Gln1130 1135 1140cct aga agt gct cct tct ctc cgt cct aaa gat tat gaa gtt gat3651Pro Arg Ser Ala Pro Ser Leu Arg Pro Lys Asp Tyr Glu Val Asp1145 1150 1155
gct act ttg aaa tca ctt aac aac cag att gag act ctt ctc aca3696Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln Ile Glu Thr Leu Leu Thr1160 1165 1170cct gag gga tca aga aag aat cca gca cgt aca tgc cgt gat ctc3741Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu1175 1180 1185aga ctt agt cac cca gag tgg tca agt ggc tat tat tgg att gat3786Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ile Asp1190 1195 1200cct aat cag ggt tgt aca atg gag gct atc aaa gtt tac tgt gat3831Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Glu Ala Ile Lys Val Tyr Cys Asp1205 1210 1215ttt cca act gga gag aca tgt att agg gca caa cct gag aac att3876Phe Pro Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg Ala Gln Pro Glu Asn Ile1220 1225 1230cca gct aaa aat tgg tat cgt tcc tct aaa gat aag aaa cat gtt3921Pro Ala Lys Asn Trp Tyr Arg Ser Ser Lys Asp Lys Lys His Val1235 1240 1245tgg ctc gga gag act att aac gct ggt tct cag ttc gag tat aat3966Trp Leu Gly Glu Thr Ile Asn Ala Gly Ser Gln Phe Glu Tyr Asn1250 1255 1260gtt gag ggc gtt act tct aaa gag atg gca act cag ctc gct ttt4011Val Glu Gly Val Thr Ser Lys Glu Met Ala Thr Gln Leu Ala Phe1265 1270 1275atg aga ttg ctc gct aac tac gca tcc caa aac atc act tat cac4056Met Arg Leu Leu Ala Asn Tyr Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His1280 1285 1290tgc aaa aat tcc att gca tat atg gat gag gag aca gga aat ttg4101Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp Glu Glu Thr Gly Asn Leu1295 1300 1305aag aaa gca gtt att ctc caa ggt agt aac gat gtt gag ctt gtg4146Lys Lys Ala Val Ile Leu Gln Gly Ser Asn Asp Val Glu Leu Val1310 1315 1320
gct gag gga aat agt aga ttc act tac aca gtt ttg gtg gat gga4191Ala Glu Gly Ash Ser Arg Phe Thr Tyr Thr Val Leu Val Asp Gly1325 1330 1335tgc tca aag aaa act aat gag tgg ggc aag aca atc att gag tac4236Cys Ser Lys Lys Thr Asn Glu Trp Gly Lys Thr Ile Ile Glu Tyr1340 1345 1350aag aca aat aag cct tct agg ctc cca ttt ctc gat att gca cct4281Lys Thr Asn Lys Pro Set Arg Leu Pro Phe Leu Asp Ile Ala Pro1355 1360 1365ctt gat atc gga gga gct gat cac gag ttt ttt gtt gat atc gga4326Leu Asp Ile Gly Gly Ala Asp His Glu Phe Phe Val Asp Ile Gly1370 1375 1380cct gtt tgt ttt aag taa tgagctcgcg gccgcatc 4362Pro Val Cys Phe Lys1385<210>6<211>1389<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有与人胶原α2(I)链融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列编码区和侧翼区的合成序列<400>6Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Set Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Set Thr Leu Ala Gln Leu Leu35 40 45
Gln Glu Glu Thr Val Arg Lys Gly Pro Ala Gly Asp Arg Gly Pro Arg50 55 60Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Glu Asp Gly65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu85 90 95Gly Gly Asn Phe Ala Ala Gln Tyr Asp Gly Lys Gly Val Gly Leu Gly100 105 110Pro Gly Pro Met Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ala Ala115 120 125Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly130 135 140Glu Pro Gly Gln Thr Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly Pro145 150 155 160Pro Gly Lys Ala Gly Glu Asp Gly His Pro Gly Lys Pro Gly Arg Pro165 170 175Gly Glu Arg Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Phe Pro Gly180 185 190Thr Pro Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly Ile Arg Gly His Asn Gly Leu195 200 205Asp Gly Leu Lys Gly Gln Pro Gly Ala Pro Gly Val Lys Gly Glu Pro210 215 220
Gly Ala Pro Gly Glu Asn Gly Thr Pro Gly Gln Thr Gly Ala Arg Gly225 230 235 240Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala245 250 255Arg Gly Ser Asp Gly Ser Val Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Ile260 265 270Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Pro Lys Gly275 280 285Glu Ile Gly Ala Val Gly Asn Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ala Gly Pro290 295 300Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Leu Ser Gly Pro Val Gly Pro Pro305 310 315 320Gly Asn Pro Gly Ala Asn Gly Leu Thr Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly325 330 335Leu Pro Gly Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Pro Gly Pro Arg Gly Ile340 345 350Pro Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Arg Gly Leu Val355 360 365Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Lys Gly Glu Ser Gly Asn Lys Gly370 375 380Glu Pro Gly Ser Ala Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Glu385 390 395 400
Glu Gly Lys Arg Gly Pro Asn Gly Glu Ala Gly Ser Ala Gly Pro Pro405 410 415Gly Pro Pro Gly Leu Arg Gly Ser Pro Gly Ser Arg Gly Leu Pro Gly420 425 430Ala Asp Gly Arg Ala Gly Val Met Gly Pro Pro Gly Ser Arg Gly Ala435 440 445Ser Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly Asp Ala Gly Arg Pro450 455 460Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly465 470 475 480Asn Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val Gly Leu Pro Gly Ile485 490 495Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Ala Arg Gly Glu Pro500 505 510Gly Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Thr Gly Asp Pro Gly515 520 525Lys Asn Gly Asp Lys Gly His Ala Gly Leu Ala Gly Ala Arg Gly Ala530 535 540Pro Gly Pro Asp Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln545 550 555 560Gly Val Gln Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly565 570 575
Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Val Gly Lys580 585 590Pro Gly Glu Arg Gly Leu His Gly Glu Phe Gly Leu Pro Gly Pro Ala595 600 605Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gly Ala Ala Gly610 615 620Pro Thr Gly Pro Ile Gly Ser Arg Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro625 630 635 640Asp Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Val Val Gly Ala Val Gly Thr Ala645 650 655Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly660 665 670Ile Pro Gly Gly Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Leu Arg Gly Glu675 680 685Ile Gly Asn Pro Gly Arg Asp Gly Ala Arg Gly Ala His Gly Ala Val690 695 700Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Asp Arg Gly Glu Ala Gly705 710 715 720Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ser Pro Gly Glu725 730 735Arg Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Phe Ala Gly Pro Ala740 745 750
Gly Ala Ala Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Arg Gly Gly Lys Gly755 760 765Pro Lys Gly Glu Asn Gly Val Val Gly Pro Thr Gly Pro Val Gly Ala770 775 780Ala Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ser Arg785 790 795 800Gly Asp Gly Gly Pro Pro Gly Met Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala Gly805 810 815Arg Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ile Ser Gly Pro Pro Gly Pro820 825 830Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Leu Arg Gly Pro Arg Gly Asp Gln835 840 845Gly Pro Val Gly Arg Thr Gly Glu Val Gly Ala Val Gly Pro Pro Gly850 855 860Phe Ala Gly Glu Lys Gly Pro Ser Gly Glu Ala Gly Thr Ala Gly Pro865 870 875 880Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ile Leu885 890 895Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Leu Pro Gly Val Ala Gly900 905 910Ala Val Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Pro Pro Gly Ala915 920 925
Arg Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Ser Pro Gly Val Asn Gly Ala Pro930 935 940Gly Glu Ala Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Asn Asp Gly Pro Pro Gly945 950 955 960Arg Asp Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Glu Arg Gly Tyr Pro Gly Asn965 970 975Ile Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ala Pro Gly Pro His Gly Pro Val980 985 990Gly Pro Ala Gly Lys His Gly Asn Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ser Gly995 1000 1005Pro Val Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly1010 1015 1020Pro Gln Gly Ile Arg Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Glu Lys Gly1025 1030 1035Pro Arg Gly Leu Pro Gly Phe Lys Gly His Asn Gly Leu Gln Gly1040 1045 1050Leu Pro Gly Ile Ala Gly His His Gly Asp Gln Gly Ala Pro Gly1055 1060 1065Ser Val Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly1070 1075 1080Pro Ala Gly Lys Asp Gly Arg Thr Gly His Pro Gly Thr Val Gly1085 1090 1095
Pro Ala Gly Ile Arg Gly Pro Gln Gly His Gln Gly Pro Ala Gly1100 1105 1110Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Val Ser Gly1115 1120 1125Gly Gly Tyr Asp Phe Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Tyr Arg Ala Asp1130 1135 1140Gln Pro Arg Ser Ala Pro Ser Leu Arg Pro Lys Asp Tyr Glu Val1145 1150 1155Asp Ala Thr Leu Lys Ser Leu Asn Asn Gln Ile Glu Thr Leu Leu1160 1165 1170Thr Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp1175 1180 1185Leu Arg Leu Ser His Pro Glu Trp Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ile1190 1195 1200Asp Pro Asn Gln Gly Cys Thr Met Glu Ala Ile Lys Val Tyr Cys1205 1210 1215Asp Phe Pro Thr Gly Glu Thr Cys Ile Arg Ala Gln Pro Glu Asn1220 1225 1230Ile Pro Ala Lys Asn Trp Tyr Arg Ser Ser Lys Asp Lys Lys His1235 1240 1245Val Trp Leu Gly Glu Thr Ile Asn Ala Gly Ser Gln Phe Glu Tyr1250 1255 1260
Asn Val Glu Gly Val Thr Ser Lys Glu Met Ala Thr Gln Leu Ala1265 1270 1275Phe Met Arg Leu Leu Ala Asn Tyr Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr1280 1285 1290His Cys Lys Asn Ser Ile Ala Tyr Met Asp Glu Glu Thr Gly Asn1295 1300 1305Leu Lys Lys Ala Val Ile Leu Gln Gly Ser Asn Asp Val Glu Leu1310 1315 1320Val Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Thr Val Leu Val Asp1325 1330 1335Gly Cys Ser Lys Lys Thr Asn Glu Trp Gly Lys Thr Ile Ile Glu1340 1345 1350Tyr Lys Thr Asn Lys Pro Ser Arg Leu Pro Phe Leu Asp Ile Ala1355 1360 1365Pro Leu Asp Ile Gly Gly Ala Asp His Glu Phe Phe Val Asp Ile1370 1375 1380Gly Pro Val Cys Phe Lys1385<210>7<211>127<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有拟南芥内切-1，4-β-葡聚糖酶的质外体信号编码区和侧翼区的合成序列
<400>7gccatggcta ggaagtcttt gattttccca gtgattcttc ttgctgtgct tcttttctct60ccacctattt actctgctgg acacgattat agggatgctc ttaggaagtc atctatggct120caattgc 127<210>8<211>127<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>拟南芥内切-1，4-β-葡聚糖酶的质外体信号和侧翼区的合成序列<220>
<221>CDS<222>(10)..(120)<400>8gccatggct agg aag tct ttg att ttc cca gtg att ctt ctt gct gtg ctt51Arg Lys Ser Leu Ile Phe Pro Val Ile Leu Leu Ala Val Leu1 5 10ctt ttc tct cca cct att tac tct gct gga cac gat tat agg gat gct 99Leu Phe Ser Pro Pro Ile Tyr Ser Ala Gly His Asp Tyr Arg Asp Ala15 20 25 30ctt agg aag tca tct atg gct caattgc 127Leu Arg Lys Ser Ser Met Ala35<210>9<211>37<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>拟南芥内切-1，4-β-葡聚糖酶的质外体信号和侧翼区的合成序列<400>9
Arg Lys Ser Leu Ile Phe Pro Val Ile Leu Leu Ala Val Leu Leu Phe1 5 10 15Ser Pro Pro Ile Tyr Ser Ala Gly His Asp Tyr Arg Asp Ala Leu Arg20 25 30Lys Ser Ser Met Ala35<210>10<211>1037<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>菊花rbcS1启动子和5’UTR<400>10aaatggcgcg ccaagcttag acaaacaccc cttgttatac aaagaatttc gctttacaaa60atcaaattcg agaaaataat atatgcacta aataagatca ttcggatcca atctaaccaa120ttacgatacg ctttgggtac acttgatttt tgtttcagta gttacatata tcttgtttta180tatgctatct ttaaggatct tcactcaaag actatttgtt gatgttcttg atggggctcg240gaagatttga tatgatacac tctaatcttt aggagatacc agccaggatt atattcagta300agacaatcaa attttacgtg ttcaaactcg ttatcttttc atttaatgga tgagccagaa360tctctataga atgattgcaa tcgagaatat gttcggccga tatccctttg ttggcttcaa420tattctacat atcacacaag aatcgaccgt attgtaccct ctttccataa aggaacacac480agtatgcaga tgcttttttc ccacatgcag taacataggt attcaaaaat ggctaaaaga540agttggataa caaattgaca actatttcca tttctgttat ataaatttca caacacacaa600aagcccgtaa tcaagagtct gcccatgtac gaaataactt ctattatttg gtattgggcc660
taagcccagc tcagagtacg tgggggtacc acatatagga aggtaacaaa atactgcaag720atagccccat aacgtaccag cctctcctta ccacgaagag ataagatata agacccaccc780tgccacgtgt cacatcgtca tggtggttaa tgataaggga ttacatcctt ctatgtttgt840ggacatgatg catgtaatgt catgagccac atgatccaat ggccacagga acgtaagaat900gtagatagat ttgattttgt ccgttagata gcaaacaaca ttataaaagg tgtgtatcaa960tacgaactaa ttcactcatt ggattcatag aagtccattc ctcctaagta tctaaacata1020tgcaattgtc gactaaa 1037<210>11<211>975<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>菊花rbcS1 3’UTR和终止子<400>11aaaaggatcc gcggccgcat aagttttact atttaccaag acttttgaat attaaccttc60ttgtaacgag tcggttaaat ttgattgttt agggttttgt attatttttt tttggtcttt120taattcatca ctttaattcc ctaattgtct gttcatttcg ttgtttgttt ccggatcgat180aatgaaatgt aagagatatc atatataaat aataaattgt cgtttcatat ttgcaatctt240tttttacaaa cctttaatta attgtatgta tgacattttc ttcttgttat attaggggga300aataatgtta aataaaagta caaaataaac tacagtacat cgtactgaat aaattaccta360gccaaaaagt acacctttcc atatacttcc tacatgaagg cattttcaac attttcaaat420aaggaatgct acaaccgcat aataacatcc acaaattttt ttataaaata acatgtcaga480cagtgattga aagattttat tatagtttcg ttatcttctt ttctcattaa gcgaatcact540acctaacacg tcattttgtg aaatattttt tgaatgtttt tatatagttg tagcattcct600
cttttcaaat tagggtttgt ttgagatagc atttcagccg gttcatacaa cttaaaagca660tactctaatg ctggaaaaaa gactaaaaaa tcttgtaagt tagcgcagaa tattgaccca720aattatatac acacatgacc ccatatagag actaattaca cttttaacca ctaataatta780ttactgtatt ataacatcta ctaattaaac ttgtgagttt ttgctagaat tattatcata840tatactaaaa ggcaggaacg caaacattgc cccggtactg tagcaactac ggtagacgca900ttaattgtct atagtggacg cattaattaa ccaaaaccgc ctctttcccc ttcttcttga960agcttgagct ctttt 975<210>12<211>1633<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有与人脯氨酰4-羟化酶β亚基融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列编码区和侧翼区的合成序列<400>12ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact60gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg120actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tggatgctcc agaagaggag180gatcacgttc ttgtgcttag gaagtctaac ttcgctgaag ctcttgctgc tcacaagtac240cttcttgtgg agttttatgc tccttggtgc ggacattgca aagctcttgc tccagagtat300gctaaggctg ctggaaagtt gaaggctgag ggatctgaaa ttaggcttgc taaagtggat360gctactgagg agtctgatct tgctcaacag tacggagtta ggggataccc aactattaag420ttcttcagga acggagatac tgcttctcca aaggagtata ctgctggaag ggaggctgat480gatattgtga actggcttaa gaagagaact ggaccagctg ctactactct tccagatgga540gctgctgctg aatctcttgt ggagtcatct gaggtggcag tgattggatt cttcaaggat600
gtggagtctg attctgctaa gcagttcctt caagctgctg aggctattga tgatattcca660ttcggaatta cttctaactc tgatgtgttc tctaagtacc agcttgataa ggatggagtg720gtgcttttca agaaattcga tgagggaagg aacaatttcg agggagaggt gacaaaggag780aaccttcttg atttcattaa gcacaaccag cttccacttg tgattgagtt cactgagcag840actgctccaa agattttcgg aggagagatt aagactcaca ttcttctttt ccttccaaag900tctgtgtctg attacgatgg aaagttgtct aacttcaaga ctgctgctga gtctttcaag960ggaaagattc ttttcatttt cattgattct gatcacactg ataaccagag gattcttgag1020ttcttcggac ttaagaagga agagtgccca gctgttaggc ttattactct tgaggaggag1080atgactaagt acaagccaga gtctgaagaa cttactgctg agaggattac tgagttctgc1140cacagattcc ttgagggaaa gattaagcca caccttatgt ctcaagagct tccagaggat1200tgggataagc agccagttaa ggtgttggtg ggtaaaaact tcgaggatgt ggctttcgat1260gagaagaaga acgtgttcgt ggagttctac gcaccttggt gtggtcactg taagcagctt1320gctccaattt gggataagtt gggagagact tacaaggatc acgagaacat tgtgattgct1380aagatggatt ctactgctaa cgaggtggag gctgttaagg ttcactcttt cccaactttg1440aagttcttcc cagcttctgc tgataggact gtgattgatt acaacggaga aaggactctt1500gatggattca agaagttcct tgagtctgga ggacaagatg gagctggaga tgatgatgat1560cttgaggatt tggaagaagc tgaggagcca gatatggagg aggatgatga tcagaaggct1620gtgtgatgag ctc 1633<210>13<211>537<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有与人脯氨酰4-羟化酶β亚基融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列和侧翼区的合成序列<400>13Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Val35 40 45Asp Met Asp Ala Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Arg Lys50 55 60Ser Asn Phe Ala Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu65 70 75 80Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr85 90 95Ala Lys Ala Ala Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu100 105 110Ala Lys Val Asp Ala Thr Glu Glu Set Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly115 120 125Val Arg Gly Tyr Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ala130 135 140Set Pro Lys Glu Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp Asp Ile Val Asn145 150 155 160
Trp Leu Lys Lys Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr Leu Pro Asp Gly165 170 175Ala Ala Ala Glu Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly180 185 190Phe Phe Lys Asp Val Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln Phe Leu Gln Ala195 200 205Ala Glu Ala Ile Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp210 215 220Val Phe Ser Lys Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys225 230 235 240Lys Phe Asp Glu Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu Val Thr Lys Glu245 250 255Asn Leu Leu Asp Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro Leu Val Ile Glu260 265 270Phe Thr Glu Gln Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr275 280 285His Ile Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Asp Gly Lys290 295 300Leu Ser Asn Phe Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu305 310 315 320Phe Ile Phe Ile Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu325 330 335
Phe Phe Gly Leu Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr340 345 350Leu Glu Glu Glu Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu Thr355 360 365Ala Glu Arg Ile Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile370 375 380Lys Pro His Leu Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lys Gln385 390 395 400Pro Val Lys Val Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala Phe Asp405 410 415Glu Lys Lys Asn Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His420 425 430Cys Lys Gln Leu Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr Tyr Lys435 440 445Asp His Glu Asn Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala Asn Glu450 455 460Val Glu Ala Val Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro465 470 475 480Ala Ser Ala Asp Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg Thr Leu485 490 495Asp Gly Phe Lys Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly Ala Gly500 505 510
Asp Asp Asp Asp Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asp Met515 520 525Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys Ala Val530 535<210>14<211>1723<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有与人脯氨酰4-羟化酶α-1亚基融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列编码区和侧翼区的合成序列<400>14ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact60gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg120actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tgcacccagg attcttcact180tctattggac agatgactga tcttattcac actgagaagg atcttgtgac ttctcttaag240gattacatta aggctgagga ggataagttg gagcagatta agaagtgggc tgagaagttg300gataggctta cttctactgc tacaaaagat ccagagggat tcgttggtca tccagtgaac360gctttcaagt tgatgaagag gcttaacact gagtggagtg agcttgagaa ccttgtgctt420aaggatatgt ctgatggatt catttctaac cttactattc agaggcagta cttcccaaat480gatgaggatc aagtgggagc tgctaaggct cttcttaggc ttcaggatac ttacaacctt540gatactgata caatttctaa gggaaacctt ccaggagtta agcacaagtc tttccttact600gctgaggatt gcttcgagct tggaaaggtt gcatacactg aggctgatta ctaccacact660gagctttgga tggaacaagc tcttaggcaa cttgatgagg gagagatttc tactattgat720aaggtgtcag tgcttgatta cctttcttac gctgtgtacc agcagggtga tcttgataag780
gctcttttgc ttactaagaa gttgcttgag cttgatccag aacatcagag ggctaacgga840aaccttaagt acttcgagta cattatggct aaggaaaagg atgtgaacaa gtctgcttct900gatgatcagt ctgatcaaaa gactactcca aagaagaagg gagtggctgt tgattatctt960cctgagaggc agaagtatga gatgttgtgt aggggagagg gtattaagat gactccaagg1020aggcagaaga agttgttctg caggtatcac gatggaaaca ggaacccaaa gttcattctt1080gctccagcta agcaagaaga tgagtgggat aagccaagga ttattaggtt ccacgatatt1140atttctgatg ctgagattga gattgtgaag gatcttgcta agccaagact taggagggct1200actatttcta accctattac tggtgatctt gagactgtgc actacaggat ttctaagtct1260gcttggcttt ctggatacga gaacccagtg gtgtctagga ttaacatgag gattcaggat1320cttactggac ttgatgtgtc tactgctgag gagcttcaag ttgctaacta cggagttgga1380ggacaatatg agccacactt cgatttcgct aggaaggatg agccagatgc ttttaaggag1440cttggaactg gaaacaggat tgctacttgg cttttctaca tgtctgatgt ttctgctgga1500ggagctactg ttttcccaga agtgggagct tctgtttggc caaagaaggg aactgctgtg1560ttctggtaca accttttcgc ttctggagag ggagattact ctactaggca tgctgcttgc1620ccagttcttg ttggaaacaa gtgggtgtca aacaagtggc ttcatgagag gggacaagag1680tttagaaggc catgcactct ttctgagctt gagtgatgag ctc 1723<210>15<211>567<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有与人脯氨酰4-羟化酶α-1亚基融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列和侧翼区的合成序列<400>15
Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Val35 40 45Asp Met His Pro Gly Phe Phe Thr Ser Ile Gly Gln Met Thr Asp Leu50 55 60Ile His Thr Glu Lys Asp Leu Val Thr Ser Leu Lys Asp Tyr Ile Lys65 70 75 80Ala Glu Glu Asp Lys Leu Glu Gln Ile Lys Lys Trp Ala Glu Lys Leu85 90 95Asp Arg Leu Thr Ser Thr Ala Thr Lys Asp Pro Glu Gly Phe Val Gly100 105 110His Pro Val Asn Ala Phe Lys Leu Met Lys Arg Leu Asn Thr Glu Trp115 120 125Ser Glu Leu Glu Asn Leu Val Leu Lys Asp Met Ser Asp Gly Phe Ile130 135 140Ser Asn Leu Thr Ile Gln Arg Gln Tyr Phe Pro Asn Asp Glu Asp Gln145 150 155 160Val Gly Ala Ala Lys Ala Leu Leu Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Asn Leu165 170 175
Asp Thr Asp Thr Ile Ser Lys Gly Asn Leu Pro Gly Val Lys His Lys180 185 190Ser Phe Leu Thr Ala Glu Asp Cys Phe Glu Leu Gly Lys Val Ala Tyr195 200 205Thr Glu Ala Asp Tyr Tyr His Thr Glu Leu Trp Met Glu Gln Ala Leu210 215 220Arg Gln Leu Asp Glu Gly Glu Ile Ser Thr Ile Asp Lys Val Ser Val225 230 235 240Leu Asp Tyr Leu Ser Tyr Ala Val Tyr Gln Gln Gly Asp Leu Asp Lys245 250 255Ala Leu Leu Leu Thr Lys Lys Leu Leu Glu Leu Asp Pro Glu His Gln260 265 270Arg Ala Asn Gly Asn Leu Lys Tyr Phe Glu Tyr Ile Met Ala Lys Glu275 280 285Lys Asp Val Asn Lys Ser Ala Ser Asp Asp Gln Ser Asp Gln Lys Thr290 295 300Thr Pro Lys Lys Lys Gly Val Ala Val Asp Tyr Leu Pro Glu Arg Gln305 310 315 320Lys Tyr Glu Met Leu Cys Arg Gly Glu Gly Ile Lys Met Thr Pro Arg325 330 335Arg Gln Lys Lys Leu Phe Cys Arg Tyr His Asp Gly Asn Arg Asn Pro340 345 350
Lys Phe Ile Leu Ala Pro Ala Lys Gln Glu Asp Glu Trp Asp Lys Pro355 360 365Arg Ile Ile Arg Phe His Asp Ile Ile Ser Asp Ala Glu Ile Glu Ile370 375 380Val Lys Asp Leu Ala Lys Pro Arg Leu Arg Arg Ala Thr Ile Ser Asn385 390 395 400Pro Ile Thr Gly Asp Leu Glu Thr Val His Tyr Arg Ile Ser Lys Ser405 410 415Ala Trp Leu Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Val Val Ser Arg Ile Asn Met420 425 430Arg Ile Gln Asp Leu Thr Gly Leu Asp Val Ser Thr Ala Glu Glu Leu435 440 445Gln Val Ala Asn Tyr Gly Val Gly Gly Gln Tyr Glu Pro His Phe Asp450 455 460Phe Ala Arg Lys Asp Glu Pro Asp Ala Phe Lys Glu Leu Gly Thr Gly465 470 475 480Asn Arg Ile Ala Thr Trp Leu Phe Tyr Met Ser Asp Val Ser Ala Gly485 490 495Gly Ala Thr Val Phe Pro Glu Val Gly Ala Ser Val Trp Pro Lys Lys500 505 510Gly Thr Ala Val Phe Trp Tyr Asn Leu Phe Ala Ser Gly Glu Gly Asp515 520 525
Tyr Ser Thr Arg His Ala Ala Cys Pro Val Leu Val Gly Asn Lys Trp530 535 540Val Ser Asn Lys Trp Leu His Glu Arg Gly Gln Glu Phe Arg Arg Pro545 550 555 560Cys Thr Leu Ser Glu Leu Glu565<210>16<211>928<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有与植物脯氨酰4-羟化酶植物融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列编码区和侧翼区的合成序列<400>16ctcgagtaaa ccatggctca tgctagggtt ttgcttttgg ctcttgctgt tcttgctact60gctgctgttg ctgtggcttc ttcttcatct ttcgctgatt ctaacccaat taggccagtg120actgatagag ctgcttctac tcttgctcaa ttggtcgaca tgcttggtat tctttctctt180ccaaacgcta acaggaactc ttctaagact aacgatctta ctaacattgt gaggaagtct240gagacttctt ctggagatga ggagggaaat ggagaaagat gggtggaagt gatttcttgg300gagccaaggg ctgttgttta ccacaacttc cttactaatg aggagtgcga gcaccttatt360tctcttgcta agccatctat ggtgaagtct actgtggtgg atgagaaaac tggaggatct420aaggattcaa gagtgaggac ttcatctggt actttcctta ggaggggaca tgatgaagtt480gtggaagtta ttgagaagag gatttctgat ttcactttca ttccagtgga gaacggagaa540ggacttcaag ttcttcacta ccaagtggga caaaagtacg agccacacta cgattacttc600cttgatgagt tcaacactaa gaacggagga cagaggattg ctactgtgct tatgtacctt660
tctgatgtgg atgatggagg agagactgtt tttccagctg ctaggggaaa catttctgct720gttccttggt ggaacgagct ttctaagtgt ggaaaggagg gactttctgt gcttccaaag780aaaagggatg ctcttctttt ctggaacatg aggccagatg cttctcttga tccatcttct840cttcatggag gatgcccagt tgttaaggga aacaagtggt catctactaa gtggttccac900gtgcacgagt tcaaggtgta atgagctc 928<210>17<211>302<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有与植物脯氨酰4-羟化酶植物融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列和侧翼区的合成序列<400>17Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Val35 4 0 45Asp Met Leu Gly Ile Leu Ser Leu Pro Asn Ala Asn Arg Asn Ser Ser50 55 60Lys Thr Asn Asp Leu Thr Asn Ile Val Arg Lys Ser Glu Thr Ser Ser65 70 75 80Gly Asp Glu Glu Gly Asn Gly Glu Arg Trp Val Glu Val Ile Ser Trp
85 90 95Glu Pro Arg Ala Val Val Tyr His Asn Phe Leu Thr Asn Glu Glu Cys100 105 110Glu His Leu Ile Ser Leu Ala Lys Pro Ser Met Val Lys Ser Thr Val115 120 125Val Asp Glu Lys Thr Gly Gly Ser Lys Asp Ser Arg Val Arg Thr Ser130 135 140Ser Gly Thr Phe Leu Arg Arg Gly His Asp Glu Val Val Glu Val Ile145 150 155 160Glu Lys Arg Ile Ser Asp Phe Thr Phe Ile Pro Val Glu Asn Gly Glu165 170 175Gly Leu Gln Val Leu His Tyr Gln Val Gly Gln Lys Tyr Glu Pro His180 185 190Tyr Asp Tyr Phe Leu Asp Glu Phe Asn Thr Lys Asn Gly Gly Gln Arg195 200 205Ile Ala Thr Val Leu Met Tyr Leu Ser Asp Val Asp Asp Gly Gly Glu210 215 220Thr Val Phe Pro Ala Ala Arg Gly Asn Ile Ser Ala Val Pro Trp Trp225 230 235 240Asn Glu Leu Ser Lys Cys Gly Lys Glu Gly Leu Ser Val Leu Pro Lys245 250 255Lys Arg Asp Ala Leu Leu Phe Trp Asn Met Arg Pro Asp Ala Ser Leu
260 265 270Asp Pro Ser Ser Leu His Gly Gly Cys Pro Val Val Lys Gly Asn Lys275 280 285Trp Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Val His Glu Phe Lys Val290 295 300<210>18<211>2689<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有人前胶原C-蛋白酶编码区和侧翼区的合成序列<400>18agatctatcg atgcatgcca tggtaccgcg ccatggctca attggctgca acatcaaggc60ctgaaagagt ttggccagat ggtgttattc ctttcgttat tggtggaaac tttactggat120ctcagagagc agtttttaga caagctatga gacattggga aaagcacact tgtgtgacat180tccttgaaag gactgatgaa gattcttata ttgtgttcac ataccgtcca tgtggatgct240gctcatatgt tggtagaagg ggaggaggtc cacaagcaat ttctattgga aaaaactgcg300ataagttcgg aattgtggtg catgaattgg gacatgttgt tggtttctgg cacgaacaca360caaggccaga tagggatagg cacgtgtcta ttgtgaggga aaacattcag ccaggtcaag420agtacaattt tcttaagatg gaacctcaag aggtggaatc tctcggagag acttacgact480tcgactccat catgcactac gcaaggaata ctttcagcag gggcatcttc ttggatacca540ttgtgcctaa gtacgaggtg aacggcgtta agccacctat tggtcaaagg actaggctct600ctaagggtga tattgcacag gctaggaagc tctacaaatg tccagcatgc ggagaaactc660ttcaggattc cactggcaac ttctcatctc cagagtaccc aaacggatac tctgctcata720
tgcactgtgt ttggaggatc tcagtgactc ctggagagaa gatcatcctc aacttcactt780ccctcgatct ctatcgttct aggctctgtt ggtacgacta tgtggaagtg agagatggct840tctggagaaa ggctccactt agaggaaggt tctgcggatc taaacttcct gagccaatcg900tgtctactga ttccagattg tgggtggagt tcaggtcctc ttctaattgg gttggcaagg960gcttttttgc tgtgtacgag gctatttgtg gcggcgacgt gaaaaaggac tacggacata1020ttcaaagtcc aaattaccca gatgattacc gtccttcaaa agtgtgtatt tggaggattc1080aagtgagtga gggtttccat gttggattga cattccaatc tttcgaaatt gagagacacg1140attcatgcgc atacgattat ttggaagtga gagatggaca ctctgaatct tctacactta1200ttggaaggta ctgcggttat gagaaacctg atgatattaa gtctacttct agtaggttgt1260ggcttaaatt tgtgtcagat ggttctatta acaaggctgg tttcgcagtg aacttcttca1320aggaagtgga tgaatgctca agacctaaca gaggaggatg tgagcaaaga tgccttaaca1380ctttgggaag ttacaagtgt tcttgcgatc ctggatacga gttggctcct gataagagaa1440gatgcgaagc tgcttgcggt ggttttttga caaaattgaa cggatctatt acttctcctg1500gatggccaaa agagtaccca cctaataaga attgcatttg gcagcttgtt gcacctactc1560agtaccgtat ttcattgcaa ttcgattttt tcgagactga gggtaatgat gtgtgcaagt1620acgatttcgt ggaagtgaga tcaggtctta ctgctgatag taaattgcac ggaaagttct1680gcggatctga aaaaccagaa gtgattacat cacagtacaa caatatgagg gtggagttca1740aatctgataa tactgtttct aaaaaaggtt ttaaggcaca tttcttttct gataaggacg1800agtgctctaa agataatggt ggttgccagc aggattgcgt gaacacattc ggttcatatg1860agtgccaatg ccgtagtgga tttgttcttc acgataacaa acatgattgc aaagaggcag1920gttgcgatca caaggtgaca tctacttcag gtactatcac atctccaaac tggcctgata1980agtatccttc aaaaaaagaa tgtacatggg caatttcttc tacaccaggt catagggtta2040
agttgacatt catggagatg gatattgaga gtcaaccaga gtgcgcttat gatcatcttg2100aggtgttcga tggaagggat gctaaggctc ctgttcttgg tagattctgt ggtagtaaaa2160agccagaacc agtgcttgca acaggatcta ggatgttcct tagattctac tctgataact2220cagttcagag gaaaggattc caagctagtc acgcaactga atgcggtgga caagttagag2280cagatgttaa gactaaggat ctttactcac acgcacagtt cggagataac aactaccctg2340gaggagttga ttgcgagtgg gttattgtgg ctgaagaggg atacggagtt gagcttgttt2400tccagacatt cgaggtggag gaggaaactg attgcggtta cgattatatg gaactttttg2460atggatacga tagtactgct ccaagacttg gaaggtattg tggtagtggt ccaccagaag2520aggtgtactc agctggagat agtgttcttg ttaagttcca cagtgatgat acaattacta2580agaagggatt ccatcttaga tatacttcaa ctaagtttca ggatactctt cattctagga2640agtaatgagc tcgcggccgc atccaagctt ctgcagacgc gtcgacgtc2689<210>19<211>870<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有人前胶原C-蛋白酶和侧翼区的合成序列<400>19Met Ala Gin Leu Ala Ala Thr Ser Arg Pro Glu Arg Val Trp Pro Asp1 5 10 15Gly Val Ile Pro Phe Val Ile Gly Gly Asn Phe Thr Gly Ser Gln Arg20 25 30Ala Val Phe Arg Gln Ala Met Arg His Trp Glu Lys His Thr Cys Val35 40 45
Thr Phe Leu Glu Arg Thr Asp Glu Asp Ser Tyr Ile Val Phe Thr Tyr50 55 60Arg Pro Cys Gly Cys Cys Ser Tyr Val Gly Arg Arg Gly Gly Gly Pro65 70 75 80Gln Ala Ile Ser Ile Gly Lys Asn Cys Asp Lys Phe Gly Ile Val Val85 90 95His Glu Leu Gly His Val Val Gly Phe Trp His Glu His Thr Arg Pro100 105 110Asp Arg Asp Arg His Val Ser Ile Val Arg Glu Asn Ile Gln Pro Gly115 120 125Gln Glu Tyr Asn Phe Leu Lys Met Glu Pro Gln Glu Val Glu Ser Leu130 135 140Gly Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ser Ile Met His Tyr Ala Arg Asn Thr145 150 155 160Phe Ser Arg Gly Ile Phe Leu Asp Thr Ile Val Pro Lys Tyr Glu Val165 170 175Asn Gly Val Lys Pro Pro Ile Gly Gln Arg Thr Arg Leu Ser Lys Gly180 185 190Asp Ile Ala Gln Ala Arg Lys Leu Tyr Lys Cys Pro Ala Cys Gly Glu195 200 205Thr Leu Gln Asp Ser Thr Gly Asn Phe Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Asn210 215 220
Gly Tyr Ser Ala His Met His Cys Val Trp Arg Ile Ser Val Thr Pro225 230 235 240Gly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Phe Thr Ser Leu Asp Leu Tyr Arg Ser245 250 255Arg Leu Cys Trp Tyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Asp Gly Phe Trp Arg260 265 270Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu Pro Glu Pro275 280 285Ile Val Ser Thr Asp Ser Arg Leu Trp Val Glu Phe Arg Ser Ser Ser290 295 300Asn Trp Val Gly Lys Gly Phe Phe Ala Val Tyr Glu Ala Ile Cys Gly305 310 315 320Gly Asp Val Lys Lys Asp Tyr Gly His Ile Gln Ser Pro Asn Tyr Pro325 330 335Asp Asp Tyr Arg Pro Ser Lys Val Cys Ile Trp Arg Ile Gln Val Ser340 345 350Glu Gly Phe His Val Gly Leu Thr Phe Gln Ser Phe Glu Ile Glu Arg355 360 365His Asp Ser Cys Ala Tyr Asp Tyr Leu Glu Val Arg Asp Gly His Ser370 375 380Glu Ser Ser Thr Leu Ile Gly Arg Tyr Cys Gly Tyr Glu Lys Pro Asp385 390 395 400
Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Phe Val Ser Asp405 410 415Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Phe Ala Val Asn Phe Phe Lys Glu Val420 425 430Asp Glu Cys Ser Arg Pro Asn Arg Gly Gly Cys Glu Gln Arg Cys Leu435 440 445Asn Thr Leu Gly Ser Tyr Lys Cys Ser Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu450 455 460Ala Pro Asp Lys Arg Arg Cys Glu Ala Ala Cys Gly Gly Phe Leu Thr465 470 475 480Lys Leu Asn Gly Ser Ile Thr Ser Pro Gly Trp Pro Lys Glu Tyr Pro485 490 495Pro Asn Lys Asn Cys Ile Trp Gln Leu Val Ala Pro Thr Gln Tyr Arg500 505 510Ile Ser Leu Gln Phe Asp Phe Phe Glu Thr Glu Gly Asn Asp Val Cys515 520 525Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Arg Ser Gly Leu Thr Ala Asp Ser Lys530 535 540Leu His Gly Lys Phe Cys Gly Ser Glu Lys Pro Glu Val Ile Thr Ser545 550 555 560Gln Tyr Asn Asn Met Arg Val Glu Phe Lys Ser Asp Asn Thr Val Ser565 570 575
Lys Lys Gly Phe Lys Ala His Phe Phe Ser Asp Lys Asp Glu Cys Ser580 585 590Lys Asp Asn Gly Gly Cys Gln Gln Asp Cys Val Asn Thr Phe Gly Ser595 600 605Tyr Glu Cys Gln Cys Arg Ser Gly Phe Val Leu His Asp Asn Lys His610 615 620Asp Cys Lys Glu Ala Gly Cys Asp His Lys Val Thr Ser Thr Ser Gly625 630 635 640Thr Ile Thr Ser Pro Asn Trp Pro Asp Lys Tyr Pro Ser Lys Lys Glu645 650 655Cys Thr Trp Ala Ile Ser Ser Thr Pro Gly His Arg Val Lys Leu Thr660 665 670Phe Met Glu Met Asp Ile Glu Ser Gln Pro Glu Cys Ala Tyr Asp His675 680 685Leu Glu Val Phe Asp Gly Arg Asp Ala Lys Ala Pro Val Leu Gly Arg690 695 700Phe Cys Gly Ser Lys Lys Pro Glu Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser Arg705 710 715 720Met Phe Leu Arg Phe Tyr Ser Asp Asn Ser Val Gln Arg Lys Gly Phe725 730 735Gln Ala Ser His Ala Thr Glu Cys Gly Gly Gln Val Arg Ala Asp Val740 745 750
Lys Thr Lys Asp Leu Tyr Ser His Ala Gln Phe Gly Asp Asn Asn Tyr755 760 765Pro Gly Gly Val Asp Cys Glu Trp Val Ile Val Ala Glu Glu Gly Tyr770 775 780Gly Val Glu Leu Val Phe Gln Thr Phe Glu Val Glu Glu Glu Thr Asp785 790 795 800Cys Gly Tyr Asp Tyr Met Glu Leu Phe Asp Gly Tyr Asp Ser Thr Ala805 810 815Pro Arg Leu Gly Arg Tyr Cys Gly Ser Gly Pro Pro Glu Glu Val Tyr820 825 830Ser Ala Gly Asp Ser Val Leu Val Lys Phe His Ser Asp Asp Thr Ile835 840 845Thr Lys Lys Gly Phe His Leu Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Phe Gln Asp850 855 860Thr Leu His Ser Arg Lys865 870<210>20<211>2912<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有人前胶原I N-蛋白酶编码区和侧翼区的合成序列<400>20gcgccatggc tcaattgagg agaagggcta ggagacacgc agctgatgat gattacaaca 60
ttgaagtttt gcttggtgtt gatgatagtg tggtgcaatt ccacggaaaa gagcatgttc120agaaatatct tttgacactt atgaatattg tgaacgaaat ctaccatgat gagtctttgg180gagcacacat taacgtggtt cttgtgagga ttattcttct ttcatacggt aaatctatgt240cacttattga gattggaaac ccttctcagt ctcttgagaa tgtgtgcaga tgggcatacc300ttcaacagaa gcctgatact ggacacgatg agtatcacga tcacgctatt ttccttacaa360ggcaggattt cggtccaagt ggaatgcaag gatatgctcc tgttactggt atgtgccacc420ctgttaggtc ttgtacactt aaccacgagg atggtttttc atctgctttc gtggtggctc480atgagacagg tcatgttttg ggaatggaac atgatggaca gggtaataga tgtggagatg540aagtgagact tggttcaatt atggctcctc ttgttcaagc tgcttttcat aggttccact600ggagtaggtg ttcacagcaa gagttgagta gataccttca ttcttacgat tgcttgcttg660atgatccatt tgctcatgat tggccagctt tgcctcaact tcctggattg cactactcta720tgaacgagca gtgcagattt gatttcggtc ttggttacat gatgtgcaca gctttcagga780ctttcgatcc atgcaaacag ttgtggtgtt cacacccaga taacccatat ttctgtaaaa840caaaaaaagg tccaccactt gatggtacta tgtgcgcacc tggaaagcac tgcttcaagg900gacactgcat ttggcttact cctgatattc ttaaaaggga tggatcatgg ggagcttggt960ctccattcgg aagttgctca agaacttgcg gaacaggtgt taagtttaga actaggcagt1020gcgataatcc acaccctgct aatggtggta gaacttgctc tggacttgct tacgattttc1080agttgtgttc taggcaagat tgccctgata gtcttgctga ttttagagaa gagcaatgta1140gacagtggga tctttacttt gagcacggcg acgctcagca ccactggctt ccacacgagc1200atagagatgc aaaagaaagg tgtcaccttt attgcgagag tagagagact ggagaggtgg1260tgtcaatgaa gagaatggtg cacgatggta caaggtgttc ttataaggat gcattctctt1320tgtgtgtgag gggagattgc aggaaagtgg gttgtgatgg agtgattgga tctagtaagc1380
aagaagataa gtgcggagtg tgcggaggag ataactctca ttgcaaggtt gtgaaaggaa1440cttttacaag atcaccaaaa aaacacggtt acattaagat gttcgaaatt cctgctggag1500caaggcattt gcttattcag gaagtggatg caacatctca ccacttggca gtgaaaaacc1560ttgagactgg aaaattcatt ttgaacgagg agaacgatgt tgatgcatct agtaagactt1620tcattgcaat gggtgttgaa tgggagtata gggatgagga tggaagggaa acacttcaaa1680caatgggtcc tcttcatgga acaattactg tgttggtgat tccagtggga gatacaaggg1740tgtcattgac atacaagtat atgattcacg aggatagtct taacgttgat gataacaacg1800ttttggaaga agattctgtg gtttacgagt gggctcttaa gaaatggtca ccttgctcta1860agccatgtgg tggaggaagt cagttcacta agtatggttg taggaggagg cttgatcata1920agatggttca taggggattt tgcgcagcac ttagtaagcc aaaggcaatt aggagggctt1980gtaaccctca agaatgctea caaccagttt gggtgacagg agagtgggag ccatgttcac2040aaacatgcgg aagaactgga atgcaagtta gatcagttag atgcattcaa cctcttcatg2100ataacactac aagaagtgtg cacgcaaaac actgtaacga tgctaggcca gagagtagaa2160gagcttgctc tagggaactt tgccctggta gatggagggc aggaccttgg agtcagtgct2220ctgtgacatg tggaaacggt actcaggaaa gacctgttcc atgtagaact gctgatgata2280gtttcggaat ttgtcaggag gaaaggccag aaacagctag gacttgtaga cttggacctt2340gtcctaggaa tatttctgat cctagtaaaa aatcatacgt ggtgcaatgg ttgagtaggc2400cagatccaga ttcaccaatt aggaagattt cttcaaaagg acactgccag ggtgataaga2460gtattttctg cagaatggaa gttcttagta ggtactgttc tattccaggt tataacaaac2520tttcttgtaa gagttgcaac ttgtataaca atcttactaa cgtggagggt agaattgaac2580ctccaccagg aaagcacaac gatattgatg tgtttatgcc tactcttcct gtgccaacag2640ttgcaatgga agttagacct tctccatcta ctccacttga ggtgccactt aatgcatcaa2700
gtactaacgc tactgaggat cacccagaga ctaacgcagt tgatgagcct tataagattc2760acggacttga ggatgaggtt cagccaccaa accttattcc taggaggcca agtccttacg2820aaaaaactag aaatcagagg attcaggagc ttattgatga gatgaggaaa aaggagatgc2880ttggaaagtt ctaatgagct cgcggccgca tc 2912<210>21<211>962<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有人前胶原IN-蛋白酶和侧翼区的合成序列<400>21Met Ala Gln Leu Arg Arg Arg Ala Arg Arg His Ala Ala Asp Asp Asp1 5 10 15Tyr Asn Ile Glu Val Leu Leu Gly Val Asp Asp Ser Val Val Gln Phe20 25 30His Gly Lys Glu His Val Gln Lys Tyr Leu Leu Thr Leu Met Asn Ile35 40 45Val Asn Glu Ile Tyr His Asp Glu Ser Leu Gly Ala His Ile Asn Val50 55 60Val Leu Val Arg Ile Ile Leu Leu Ser Tyr Gly Lys Ser Met Ser Leu65 70 75 80Ile Glu Ile Gly Asn Pro Ser Gln Ser Leu Glu Asn Val Cys Arg Trp85 90 95Ala Tyr Leu Gln Gln Lys Pro Asp Thr Gly His Asp Glu Tyr His Asp
100 105 110His Ala Ile Phe Leu Thr Arg Gln Asp Phe Gly Pro Ser Gly Met Gln115 120 125Gly Tyr Ala Pro Val Thr Gly Met Cys His Pro Val Arg Ser Cys Thr130 135 140Leu Asn His Glu Asp Gly Phe Ser Ser Ala Phe Val Val Ala His Glu145 150 155 160Thr Gly His Val Leu Gly Met Glu His Asp Gly Gln Gly Asn Arg Cys165 170 175Gly Asp Glu Val Arg Leu Gly Ser Ile Met Ala Pro Leu Val Gln Ala180 185 190Ala Phe His Arg Phe His Trp Ser Arg Cys Ser Gln Gln Glu Leu Ser195 200 205Arg Tyr Leu His Ser Tyr Asp Cys Leu Leu Asp Asp Pro Phe Ala His210 215 220Asp Trp Pro Ala Leu Pro Gln Leu Pro Gly Leu His Tyr Ser Met Asn225 230 235 240Glu Gln Cys Arg Phe Asp Phe Gly Leu Gly Tyr Met Met Cys Thr Ala245 250 255Phe Arg Thr Phe Asp Pro Cys Lys Gln Leu Trp Cys Ser His Pro Asp260 265 270Asn Pro Tyr Phe Cys Lys Thr Lys Lys Gly Pro Pro Leu Asp Gly Thr
275 280 285Met Cys Ala Pro Gly Lys His Cys Phe Lys Gly His Cys Ile Trp Leu290 295 300Thr Pro Asp Ile Leu Lys Arg Asp Gly Ser Trp Gly Ala Trp Ser Pro305 310 315 320Phe Gly Ser Cys Ser Arg Thr Cys Gly Thr Gly Val Lys Phe Arg Thr325 330 335Arg Gln Cys Asp Asn Pro His Pro Ala Asn Gly Gly Arg Thr Cys Ser340 345 350Gly Leu Ala Tyr Asp Phe Gln Leu Cys Ser Arg Gln Asp Cys Pro Asp355 360 365Ser Leu Ala Asp Phe Arg Glu Glu Gln Cys Arg Gln Trp Asp Leu Tyr370 375 380Phe Glu His Gly Asp Ala Gln His His Trp Leu Pro His Glu His Arg385 390 395 400Asp Ala Lys Glu Arg Cys His Leu Tyr Cys Glu Ser Arg Glu Thr Gly405 410 415Glu Val Val Ser Met Lys Arg Met Val His Asp Gly Thr Arg Cys Ser420 425 430Tyr Lys Asp Ala Phe Ser Leu Cys Val Arg Gly Asp Cys Arg Lys Val435 440 445Gly Cys Asp Gly Val Ile Gly Ser Ser Lys Gln Glu Asp Lys Cys Gly
450 455 460Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser His Cys Lys Val Val Lys Gly Thr Phe465 470 475 480Thr Arg Ser Pro Lys Lys His Gly Tyr Ile Lys Met Phe Glu Ile Pro485 490 495Ala Gly Ala Arg His Leu Leu Ile Gln Glu Val Asp Ala Thr Ser His500 505 510His Leu Ala Val Lys Asn Leu Glu Thr Gly Lys Phe Ile Leu Asn Glu515 520 525Glu Asn Asp Val Asp Ala Ser Ser Lys Thr Phe Ile Ala Met Gly Val530 535 540Glu Trp Glu Tyr Arg Asp Glu Asp Gly Arg Glu Thr Leu Gln Thr Met545 550 555 560Gly Pro Leu His Gly Thr Ile Thr Val Leu Val Ile Pro Val Gly Asp565 570 575Thr Arg Val Ser Leu Thr Tyr Lys Tyr Met Ile His Glu Asp Ser Leu580 585 590Asn Val Asp Asp Asn Asn Val Leu Glu Glu Asp Ser Val Val Tyr Glu595 600 605Trp Ala Leu Lys Lys Trp Ser Pro Cys Ser Lys Pro Cys Gly Gly Gly610 615 620Ser Gln Phe Thr Lys Tyr Gly Cys Arg Arg Arg Leu Asp His Lys Met
625 630 635 640Val His Arg Gly Phe Cys Ala Ala Leu Ser Lys Pro Lys Ala Ile Arg645 650 655Arg Ala Cys Asn Pro Gln Glu Cys Ser Gln Pro Val Trp Val Thr Gly660 665 670Glu Trp Glu Pro Cys Ser Gln Thr Cys Gly Arg Thr Gly Met Gln Val675 680 685Arg Ser Val Arg Cys Ile Gln Pro Leu His Asp Asn Thr Thr Arg Ser690 695 700Val His Ala Lys His Cys Asn Asp Ala Arg Pro Glu Ser Arg Arg Ala705 710 715 720Cys Ser Arg Glu Leu Cys Pro Gly Arg Trp Arg Ala Gly Pro Trp Ser725 730 735Gln Cys Ser Val Thr Cys Gly Asn Gly Thr Gln Glu Arg Pro Val Pro740 745 750Cys Arg Thr Ala Asp Asp Ser Phe Gly Ile Cys Gln Glu Glu Arg Pro755 760 765Glu Thr Ala Arg Thr Cys Arg Leu Gly Pro Cys Pro Arg Asn Ile Ser770 775 780Asp Pro Ser Lys Lys Ser Tyr Val Val Gln Trp Leu Ser Arg Pro Asp785 790 795 800Pro Asp Ser Pro Ile Arg Lys Ile Ser Ser Lys Gly His Cys Gln Gly
805 810 815Asp Lys Ser Ile Phe Cys Arg Met Glu Val Leu Ser Arg Tyr Cys Ser820 825 830Ile Pro Gly Tyr Asn Lys Leu Ser Cys Lys Ser Cys Asn Leu Tyr Asn835 840 845Asn Leu Thr Asn Val Glu Gly Arg Ile Glu Pro Pro Pro Gly Lys His850 855 860Asn Asp Ile Asp Val Phe Met Pro Thr Leu Pro Val Pro Thr Val Ala865 870 875 880Met Glu Val Arg Pro Ser Pro Ser Thr Pro Leu Glu Val Pro Leu Asn885 890 895Ala Ser Ser Thr Asn Ala Thr Glu Asp His Pro Glu Thr Asn Ala Val900 905 910Asp Glu Pro Tyr Lys Ile His Gly Leu Glu Asp Glu Val Gln Pro Pro915 920 925Asn Leu Ile Pro Arg Arg Pro Ser Pro Tyr Glu Lys Thr Arg Asn Gln930 935 940Arg Ile Gln Glu Leu Ile Asp Glu Met Arg Lys Lys Glu Met Leu Gly945 950 955 960Lys Phe<210>22
<2ll>2888<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有与人赖氨酰羟化酶3融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列编码区和侧翼区的合成序列<400>22gcgaattcgc tagctatcac tgaaaagaca gcaagacaat ggtgtctcga tgcaccagaa60ccacatcttt gcagcagatg tgaagcagcc agagtggtcc acaagacgca ctcagaaaag120gcatcttcta ccgacacaga aaaagacaac cacagctcat catccaacat gtagactgtc180gttatgcgtc ggctgaagat aagactgacc ccaggccagc actaaagaag aaataatgca240agtggtccta gctccacttt agctttaata attatgtttc attattattc tctgcttttg300ctctctatat aaagagcttg tattttcatt tgaaggcaga ggcgaacaca cacacagaac360ctccctgctt acaaaccaga tcttaaacca tggctcacgc tagggttttg cttcttgctc420ttgctgttct tgctactgct gctgttgctg tggcttcttc aagttctttc gctgattcta480acccaattag gccagtgact gatagagctg cttctactct tgctcaattg agatctatgt540ctgatagacc aaggggaagg gatccagtta atccagagaa gttgcttgtg attactgtgg600ctactgctga gactgaagga taccttagat tccttaggag tgctgagttc ttcaactaca660ctgtgaggac tcttggactt ggagaagaat ggaggggagg agatgttgct agaactgttg720gaggaggaca gaaagtgaga tggcttaaga aagagatgga gaagtacgct gatagggagg780atatgattat tatgttcgtg gattcttacg atgtgattct tgctggatct ccaactgagc840ttttgaagaa attcgttcag tctggatcta ggcttctttt ctctgctgag tctttttgtt900ggccagaatg gggacttgct gagcaatatc cagaagtggg aactggaaag agattcctta960actctggagg attcattgga ttcgctacta ctattcacca gattgtgagg cagtggaagt1020acaaggatga cgatgatgat cagcttttct acactaggct ttaccttgat ccaggactta1080
gggagaagtt gtctcttaac cttgatcaca agtctaggat tttccagaac cttaacggtg1140ctcttgatga ggttgtgctt aagttcgata ggaacagagt gaggattagg aacgtggctt1200acgatactct tcctattgtg gtgcatggaa acggaccaac aaaactccag cttaactacc1260ttggaaacta cgttccaaac ggatggactc cagaaggagg atgtggattc tgcaatcagg1320ataggagaac tcttccagga ggacaaccac caccaagagt tttccttgct gtgttcgttg1380aacagccaac tccattcctt ccaagattcc ttcagaggct tcttcttttg gattacccac1440cagatagggt gacacttttc cttcacaaca acgaggtttt ccacgagcca cacattgctg1500attcttggcc acagcttcag gatcatttct ctgctgtgaa gttggttggt ccagaagaag1560ctctttctcc aggagaagct agggatatgg ctatggattt gtgcaggcag gatccagagt1620gcgagttcta cttctctctt gatgctgatg ctgtgcttac taaccttcag actcttagga1680ttcttattga ggagaacagg aaagtgattg ctccaatgct ttctaggcac ggaaagttgt1740ggtctaattt ctggggtgct ctttctcctg atgagtacta cgctagatca gaggactacg1800tggagcttgt tcagagaaag agagtgggag tttggaacgt tccttatatt tctcaggctt1860acgtgattag gggagatact cttaggatgg agcttccaca gagggatgtt ttctctggat1920ctgatactga tccagatatg gctttctgca agtctttcag ggataaggga attttccttc1980acctttctaa ccagcatgag ttcggaagat tgcttgctac ttcaagatac gatactgagc2040accttcatcc tgatctttgg cagattttcg ataacccagt ggattggaag gagcagtaca2100ttcacgagaa ctactctagg gctcttgaag gagaaggaat tgtggagcaa ccatgcccag2160atgtttactg gttcccactt ctttctgagc aaatgtgcga tgagcttgtt gctgagatgg2220agcattacgg acaatggagt ggaggtagac atgaggattc taggcttgct ggaggatacg2280agaacgttcc aactgtggat attcacatga agcaagtggg atacgaggat caatggcttc2340agcttcttag gacttatgtg ggaccaatga ctgagtctct tttcccagga taccacacta2400
aggctagggc tgttatgaac ttcgttgtga ggtatcgtcc agatgagcaa ccatctctta2460ggccacacca cgattcttct actttcactc ttaacgtggc tcttaaccac aagggacttg2520attatgaggg aggaggatgc cgtttcctta gatacgattg cgtgatttct tcaccaagaa2580agggatgggc tcttcttcat ccaggaaggc ttactcatta ccacgaggga cttccaacta2640cttggggaac tagatatatt atggtgtctt tcgtggatcc atgactgctt taatgagata2700tgcgagacgc ctatgatcgc atgatatttg ctttcaattc tgttgtgcac gttgtaaaaa2760acctgagcat gtgtagctca gatccttacc gccggtttcg gttcattcta atgaatatat2820cacccgttac tatcgtattt ttatgaataa tattctccgt tcaatttact gattgtccag2880aattcgcg 2888<210>23<211>764<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有与人赖氨酰羟化酶3融合的大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的维管信号序列和侧翼区的合成序列<400>23Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala Gln Leu Arg35 40 45Ser Met Ser Asp Arg Pro Arg Gly Arg Asp Pro Val Asn Pro Glu Lys
50 55 60Leu Leu Val Ile Thr Val Ala Thr Ala Glu Thr Glu Gly Tyr Leu Arg65 70 75 80Phe Leu Arg Ser Ala Glu Phe Phe Asn Tyr Thr Val Arg Thr Leu Gly85 90 95Leu Gly Glu Glu Trp Arg Gly Gly Asp Val Ala Arg Thr Val Gly Gly100 105 110Gly Gln Lys Val Arg Trp Leu Lys Lys Glu Met Glu Lys Tyr Ala Asp115 120 125Arg Glu Asp Met Ile Ile Met Phe Val Asp Ser Tyr Asp Val Ile Leu130 135 140Ala Gly Ser Pro Thr Glu Leu Leu Lys Lys Phe Val Gln Ser Gly Ser145 150 155 160Arg Leu Leu Phe Ser Ala Glu Ser Phe Cys Trp Pro Glu Trp Gly Leu165 170 175Ala Glu Gln Tyr Pro Glu Val Gly Thr Gly Lys Arg Phe Leu Asn Ser180 185 190Gly Gly Phe Ile Gly Phe Ala Thr Thr Ile His Gln Ile Val Arg Gln195 200 205Trp Lys Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Asp Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Leu210 215 220Tyr Leu Asp Pro Gly Leu Arg Glu Lys Leu Ser Leu Asn Leu Asp His
225 230 235 240Lys Ser Arg Ile Phe Gln Asn Leu Asn Gly Ala Leu Asp Glu Val Val245 250 255Leu Lys Phe Asp Arg Asn Arg Val Arg Ile Arg Asn Val Ala Tyr Asp260 265 270Thr Leu Pro Ile Val Val His Gly Asn Gly Pro Thr Lys Leu Gln Leu275 280 285Asn Tyr Leu Gly Asn Tyr Val Pro Asn Gly Trp Thr Pro Glu Gly Gly290 295 300Cys Gly Phe Cys Asn Gln Asp Arg Arg Thr Leu Pro Gly Gly Gln Pro305 310 315 320Pro Pro Arg Val Phe Leu Ala Val Phe Val Glu Gln Pro Thr Pro Phe325 330 335Leu Pro Arg Phe Leu Gln Arg Leu Leu Leu Leu Asp Tyr Pro Pro Asp340 345 350Arg Val Thr Leu Phe Leu His Asn Asn Glu Val Phe His Glu Pro His355 360 365Ile Ala Asp Ser Trp Pro Gln Leu Gln Asp His Phe Ser Ala Val Lys370 375 380Leu Val Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ser Pro Gly Glu Ala Arg Asp Met385 390 395 400Ala Met Asp Leu Cys Arg Gln Asp Pro Glu Cys Glu Phe Tyr Phe Ser
405 410 415Leu Asp Ala Asp Ala Val Leu Thr Asn Leu Gln Thr Leu Arg Ile Leu420 425 430Ile Glu Glu Asn Arg Lys Val Ile Ala Pro Met Leu Ser Arg His Gly435 440 445Lys Leu Trp Ser Asn Phe Trp Gly Ala Leu Ser Pro Asp Glu Tyr Tyr450 455 460Ala Arg Ser Glu Asp Tyr Val Glu Leu Val Gln Arg Lys Arg Val Gly465 470 475 480Val Trp Asn Val Pro Tyr Ile Ser Gln Ala Tyr Val Ile Arg Gly Asp485 490 495Thr Leu Arg Met Glu Leu Pro Gln Arg Asp Val Phe Ser Gly Ser Asp500 505 510Thr Asp Pro Asp Met Ala Phe Cys Lys Ser Phe Arg Asp Lys Gly Ile515 520 525Phe Leu His Leu Ser Asn Gln His Glu Phe Gly Arg Leu Leu Ala Thr530 535 540Ser Arg Tyr Asp Thr Glu His Leu His Pro Asp Leu Trp Gln Ile Phe545 550 555 560Asp Asn Pro Val Asp Trp Lys Glu Gln Tyr Ile His Glu Asn Tyr Ser565 570 575Arg Ala Leu Glu Gly Glu Gly Ile Val Glu Gln Pro Cys Pro Asp Val
580 585 590Tyr Trp Phe Pro Leu Leu Ser Glu Gln Met Cys Asp Glu Leu Val Ala595 600 605Glu Met Glu His Tyr Gly Gln Trp Ser Gly Gly Arg His Glu Asp Ser610 615 620Arg Leu Ala Gly Gly Tyr Glu Asn Val Pro Thr Val Asp Ile His Met625 630 635 640Lys Gln Val Gly Tyr Glu Asp Gln Trp Leu Gln Leu Leu Arg Thr Tyr645 650 655Val Gly Pro Met Thr Glu Ser Leu Phe Pro Gly Tyr His Thr Lys Ala660 665 670Arg Ala Val Met Asn Phe Val Val Arg Tyr Arg Pro Asp Glu Gln Pro675 680 685Ser Leu Arg Pro His His Asp Ser Ser Thr Phe Thr Leu Asn Val Ala690 695 700Leu Asn His Lys Gly Leu Asp Tyr Glu Gly Gly Gly Cys Arg Phe Leu705 710 715 720Arg Tyr Asp Cys Val Ile Ser Ser Pro Arg Lys Gly Trp Ala Leu Leu725 730 735His Pro Gly Arg Leu Thr His Tyr His Glu Gly Leu Pro Thr Thr Trp740 745 750Gly Thr Arg Tyr Ile Met Val Ser Phe Val Asp Pro
755 760<210>24<211>45<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>大麦巯基蛋白酶aleurain前体基因的液泡信号序列<400>24Met Ala His Ala Arg Val Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Ala Val Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro20 25 30Ile Arg Pro Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Ala35 40 45<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>单链DNA寡核苷酸<400>25atcaccagga gaacagggac catc 24<210>26<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>26tccacttcca aatctctatc cctaacaac 29<210>27<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>单链DNA寡核苷酸<400>27aggcattaga ggcgataagg gag 23<210>28<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>单链DNA寡核苷酸<400>28tcaatccaat aatagccact tgaccac 2权利要求
1.在植物或被分离的植物细胞中生产胶原的方法，其包括在所述植物或所述被分离的植物细胞中，以能够使所述至少一种类型的所述胶原α链和所述外源性P4H积聚在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中的方式，表达至少一种类型的胶原α链和外源性P4H，从而在所述植物中生产胶原。
2.权利要求1的方法，其进一步包括在所述缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中表达外源性LH3。
3.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
4.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链缺乏ER靶向序列或保留序列。
5.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链表达于包含DNA的植物细胞器中。
6.权利要求1的方法，其中所述外源性P4H包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
7.权利要求1的方法，其中所述外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
8.权利要求1的方法，其中所述外源性P4H表达于包含DNA的植物细胞器中。
9.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链是α1链。
10.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链是α2链。
11.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链包括C-末端和/或N-末端前肽。
12.权利要求1的方法，其中所述植物选自烟草、玉米、苜蓿、稻、马铃薯、大豆、番茄、小麦、大麦、低芥酸菜子、胡萝卜和棉花。
13.权利要求1的方法，其中所述至少一种类型的所述胶原α链或所述外源性P4H只表达于所述植物的部分中。
14.权利要求13的方法，其中所述植物的所述部分是叶、种子、根、块茎或茎。
15.权利要求1的方法，其中所述外源性P4H能够使所述至少一种类型的所述胶原α链的Gly-X-Y三联体的Y位置特异性羟基化。
16.权利要求14的方法，其中所述外源性P4H是人P4H。
17.权利要求1的方法，其中对所述植物实施应激条件。
18.权利要求17的方法，其中所述应激条件选自干旱、盐度、损伤、寒冷和喷射应激诱导化合物。
19.基因修饰植物或被分离的植物细胞，其能够积聚具有羟基化模式的胶原α链，所述羟基化模式与当所述胶原α链表达于人细胞中时产生的模式相同。
20.基因修饰植物或被分离的植物细胞，其能够在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中积聚胶原α链。
21.权利要求19或20的基因修饰植物，其进一步包括外源性P4H。
22.权利要求20的基因修饰植物，其中所述至少一种类型的所述胶原α链包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
23.权利要求19或20的基因修饰植物，其中所述至少一种类型的所述胶原α链缺乏ER靶向序列或保留序列。
24.权利要求19或20的基因修饰植物，其中所述至少一种类型的所述胶原α链表达于包含DNA的植物细胞器中。
25.权利要求21的基因修饰植物，其中所述外源性P4H包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
26.权利要求21的基因修饰植物，其中所述外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
27.权利要求21的基因修饰植物，其中所述外源性P4H表达于包含DNA的植物细胞器中。
28.权利要求19或20的基因修饰植物，其中所述胶原α链是α1链。
29.权利要求19或20的基因修饰植物，其中所述胶原α链是α2链。
30.权利要求19或20的基因修饰植物，其中所述胶原α链包括C-末端和/或N-末端前肽。
31.植物系统，其包括能够积聚胶原α1链的第一种基因修饰植物，和能够积聚胶原α2链的第二种基因修饰植物。
32.权利要求31的植物系统，其中所述第一种基因修饰植物和所述第二种基因修饰植物中的至少一种进一步包括外源性P4H。
33.生产原纤维胶原的方法，其包括(a)在第一种植物中表达胶原α1链；(b)在第二种植物中表达胶原α2链，其中在所述第一种植物和所述第二种植物中的表达被这样设置，从而使得所述胶原α1链和所述胶原α2链各自能够在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中积聚；和(c)使所述第一种植物与所述第二种植物杂交，并选择表达所述胶原α1链和所述胶原α2链的后代，从而生产原纤维胶原。
34.权利要求30的方法，其进一步包括在所述第一种植物和所述第二种植物的每一种中表达外源性P4H。
35.权利要求33的方法，其中所述胶原α1链和所述胶原α2链中的每一种包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
36.权利要求1的方法，其中所述胶原α1链和所述胶原α2链中的每一种缺乏ER靶向序列或保留序列。
37.权利要求1的方法，其中步骤(a)和(b)经由在包含DNA的植物细胞器中的表达来实现。
38.权利要求34的方法，其中所述外源性P4H包括用于靶向质外体或液泡的信号肽。
39.权利要求34的方法，其中所述外源性P4H缺乏ER靶向序列或保留序列。
40.权利要求34的方法，其中所述外源性P4H表达于包含DNA的植物细胞器中。
41.权利要求1的方法，其中所述胶原α1链和所述胶原α2链中的每一种包括C-末端和/或N-末端前肽。
42.权利要求34的方法，其中所述外源性P4H能够使所述至少一种类型的所述胶原α链的Gly-X-Y三联体的Y位置特异性羟基化。
43.权利要求34的方法，其中所述外源性P4H是人P4H。
44.权利要求1的方法，其中对所述第一种植物与所述第二种植物实施应激条件。
45.权利要求44的方法，其中所述应激条件选自干旱、盐度、损伤、重金属毒性和寒冷应激。
46.生产原纤维胶原的方法，其包括(a)在第一种植物中表达胶原α1链和胶原α2链，其中在所述第一种植物中的表达被这样设置，从而使得所述胶原α1链和所述胶原α2链各自能够在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中积聚；(b)在第二种植物中表达能够在所述缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中积聚的外源性P4H；和(c)使所述第一种植物与所述第二种植物杂交，并选择表达所述胶原α1链、所述胶原α2链和所述P4H的后代，从而生产原纤维胶原。
47.核酸构建体，其包括置于在植物细胞中起作用的启动子的转录控制下、编码人P4H的多核苷酸。
48.权利要求47的核酸构建体，其中所述启动子选自CaMV 35S启动子、遍在蛋白启动子、rbcS启动子和SVBV启动子。
49.基因修饰植物或被分离的植物细胞，其能够表达胶原α1链、胶原α2链、P4H、LH3以及蛋白酶C和/或蛋白酶N。
50.权利要求49的基因修饰植物或被分离的植物细胞，其中所述胶原α1链和所述胶原α2链各自能够在缺乏内源性植物P4H活性的亚细胞区室中积聚。
51.基因修饰植物或被分离的植物细胞，其能够积聚具有温度稳定性特征的胶原，所述特征与哺乳动物胶原的特征相同。
52.权利要求51的基因修饰植物或被分离的植物细胞，其中所述胶原是I型胶原。
53.权利要求51的基因修饰植物或被分离的植物细胞，其中所述哺乳动物胶原是人胶原。
全文摘要
提供了在植物中生产胶原的方法和生产胶原的植物。该方法通过以能够使胶原α链积聚在缺乏内源性P4H活性的亚细胞区室中的方式，在植物中表达至少一种类型的胶原α链来实现，从而在植物中生产胶原。
文档编号A01H5/00GK101065491SQ200580040821
公开日2007年10月31日 申请日期2005年9月28日 优先权日2004年9月29日
发明者O·肖塞约夫, H·斯泰恩 申请人:胶原植物有限公司