具有对环境胁迫增加的耐性的植物细胞和植物的制作方法

专利名称：具有对环境胁迫增加的耐性的植物细胞和植物的制作方法
本申请基于2004年9月24日申请的在先提交美国专利申请号60/613,154和2004年10月14日申请的在先提交美国专利申请号60/618,737并对它们的利益要求权利。
本发明总体上涉及包含失活或下调的基因的经转化的植物细胞和植物，其中失活或下调的基因引起与未转化的野生型细胞相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性，以及产生此类植物细胞或植物的方法。
本发明还总体上涉及具有与相应的未转化野生型植物细胞相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的经转化的植物细胞，其中与未转化的野生型植物细胞相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性通过失活或下调的基因受到改变，产生、筛选和繁殖此类植物细胞或植物的方法以及检测植物细胞或植物中胁迫的方法。
本发明尤其涉及经转化的植物细胞和植物，其包含失活或下调的基因，其中失活或下调的基因引起与未转化的野生型细胞相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性，优选地通过改变代谢活性引起，以及产生此类植物细胞或植物的方法。
非生物性环境胁迫如干旱胁迫、盐胁迫、热胁迫和寒胁迫是植物生长和产量的主要限制性因素(Boyer.1982.Science 218，443-448)。由这些胁迫所引起主要作物如稻、玉米(corn)和小麦的作物损失和作物产量损失代表重要的经济和政治因素并且在许多欠发达和第三世界国家中造成食品短缺。
植物在其生活周期中经常暴露于环境水含量降低的环境。大多数植物已经演化出对这些少水或脱水(干旱)条件的自我保护策略。然而，当干旱过于严重并且持续时间太长，对多数作物植物的植物发育、生长和产量的影响严重。持续暴露于干旱引起植物代谢上的重大改变。这些代谢上的重大变化最终引起细胞死亡并且因此引起产量损失。
开发胁迫耐受性植物是具有解决这些问题中某些问题或至少促进其解决的潜力的策略(McKersie和Leshem，1994.Stress and Stress Coping inCultivated Plants，Kluwer Academic Publishers)。然而，开发对这些类型的胁迫表现抗性(耐性)的新植物品系的常规植物育种策略进展相对缓慢并且需要用于与所需要品系杂交的特定抗性品系。有限的胁迫耐受的种质资源和亲缘较远的植物种间杂交的不兼容性是常规育种中遇到的严重问题。此外，引起干旱、寒冷和盐耐性的细胞过程在本质上复杂并涉及细胞适应的多重机制以及多种代谢途径(McKersie和Leshem，1994.Stress andStress Coping in Cultivated Plants，Kluwer Academic Publishers)。胁迫抗性的这种多因素性质不仅使耐性育种基本不成功，而且还限制了使用生物技术方法从遗传上设计耐胁迫植物的能力。
旱胁迫、热胁迫、寒胁迫和盐胁迫具有对植物生长重要的共同主题，即水的可获得性。植物在其整个生活周期内暴露于环境水含量降低的环境。大多数植物已经演化出对于这些环境的自我保护策略。然而，当干旱条件太严重性并且持续时间太长，对大多数作物植物的植物发育、生长和产量的影响严重。因为在某些土壤中的高盐含量导致可得到用于细胞摄取的水更少，所以其效应类似于在干旱条件下观察到的效应。此外，在冰冻温度下，植物细胞因从质外体开始并从共质体抽取水分而形成冰导致失水(McKersie和Leshem，1994.Stress and Stress Coping in Cultivated Plants，Kluwer Academic Publishers)。通常，植物对这类胁迫条件中每种胁迫条件的分子应答机制相似。
目前研究的结果表明干旱耐性是复杂的量的特性并且仍然没有真正的诊断性标志可用。高盐浓度或脱水可以在干旱胁迫期间在细胞水平导致损害，但是确切的伤害并没有完全阐明(Bray，1997.Trends Plant Sci.2，48-54)。缺少机制性理解使设计转基因方法以改进干旱耐性难以进行。然而，损害的重要后果可能是产生引起细胞损伤的活性氧自由基，如脂的过氧化作用或者蛋白质和核酸修饰。已描述了氧自由基化学和它们与细胞器如细胞膜反应的细节(McKersie和Leshem，1994.Stress and Stress Coping inCultivated Plants，Kluwer Academic Publishers)。
植物细胞中存在多个氧活化的位点，它们受高度控制并且严格偶联以防止释放中间产物(McKersie和Leshem，1994.Stress and Stress Coping inCultivated Plants，Kluwer Academic Publishers)。在非生物性胁迫环境下，这种控制或偶联有可能发生故障并且此过程“功能紊乱”，释放活化氧。当这些解偶联事件持续时间短并且氧清除系统能够使多种形式的活化氧脱毒时，这些解偶联事件无害。当活化氧的产生超过植物脱毒活化氧的能力时，有害的退行性反应发生。在亚细胞水平，膜的解离和蛋白质聚集是常见现象。因此产生和清除活化氧之间的平衡对维持植物活跃生长和代谢以及整个环境性(非生物性)胁迫耐性和/或抗性重要。
阻止或减少干旱反应时氧自由基的累积是设计耐性的潜在方法(Allen，1995.Plant Physiol.107，1049-1054)。抗氧化酶或ROS-清除酶的过量表达是用于诱导功能性脱毒系统的一种可能方法。例如，表达Mn-超氧化物歧化酶的转基因苜蓿植物倾向在水匮乏胁迫后具有减少的损伤(McKersie等，1996.Plant Physiol.111，1177-1181)。相同的这些转基因植物在田间试验中具有增加的生物质产量(McKersie等，1999.Plant Physiology，119839-847；McKersie等，1996.Plant Physiol.111，1177-1181)。过量产生渗压剂如甘露醇、果聚糖、脯氨酸或甜菜碱的转基因植物也显示对某些形式的非生物性胁迫增加的抗性并且已经提出合成的渗压剂充当ROS清除剂(Tarczynski.等1993 Science 259，508-510；Sheveleva，.等1997.PlantPhysiol.115，1211-1219)。
本发明目的是鉴定当基因失活或下调时能够赋予植物胁迫抗性的新的独特基因。
本发明又一目的是鉴定、产生和繁殖新的独特的胁迫耐性和/或抗性的植物细胞或植物以及诱导和检测植物或植物细胞中胁迫耐性和/或抗性的方法。本发明又一目的是鉴定检测植物或植物细胞中的胁迫耐性和/或抗性的新方法。
本发明提供经转化的植物细胞，其优选具有与相应的未转化野生型植物细胞相比改变的代谢活性，其中与相应的未转化野生型植物细胞相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性因失活或下调的基因而改变。
本发明提供具有与相应的未转化野生型植物细胞相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的经转化的植物细胞，其中对环境胁迫增加的耐性和/或抗性因失活或下调的基因而改变。
如本文中所用，术语“失活或下调的基因”意指转基因地减少或缺失SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867的核酸表达，引起与相应的未转化野生型植物细胞相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。
在本发明的转基因植物细胞中，减少或缺失所述核酸的表达引起与相应的未转化野生型植物细胞相比较对环境胁迫增加的耐性。因此环境胁迫选自盐度、干旱、温度、金属、化学性、病原性和氧化胁迫，或其组合，优选地是干旱和/或温度胁迫。
术语“表达”指编码的基因片段或基因的转录和/或翻译。通常，得到的产物是mRNA或蛋白质。然而，表达产物还可以包括功能性RNA如反义核酸、tRNA、snRNA、rRNA、RNAi、siRNA、核酶等。表达可以是全身性、局部性或暂时的，例如限于某些细胞类型、组织、器官或时间段。
除非另外说明，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本上下文中可以互换。除非另外说明，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本上下文中可以互换。术语“序列”可能涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于术语“序列”在其中使用的上下文。如本文中所用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”指任意长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸或脱氧核苷酸。本类术语仅指分子的一级结构。
因此，如本文中所用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”包括双链和单练的DNA和RNA。它们还包括已知形式的修饰，例如甲基化、“加帽”、以类似物替换一个或多个天然存在的核苷酸。优选地，本发明的DNA或RNA序列包含编码本文中所定义的多肽的编码序列。
“编码序列”是当置于适宜的调节序列控制下转录为mRNA和/或翻译为多肽的核苷酸序列。编码序列的边界由5′末端的翻译起始密码子和3′末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，虽然内含子也可以在某些环境下存在。
为了本发明目的，复数通常包括单数并且反之亦然。
术语“减少”、“降低”或“缺失”涉及相应特性在生物或生物的部分如组织、种子、根、叶、花等中或在细胞中的改变。在“特性的改变”中，应当理解为基因产物的活性、表达水平或数量或代谢物的含量在特定体积内或在蛋白质特定的量上相对于对照、参考或野生型的相应体积或蛋白质的量受到改变。优选地，当减少、降低或缺失涉及基因产物活性的减少、降低或缺失时，体积内的整体活性优选地减少、降低或缺失，无论基因产物量或该基因产物的特异活性或两者是否减少、降低或缺失或者编码该基因产物的核酸序列或基因的数量、稳定性或翻译效率是否减少、降低或缺失。
术语“减少”、“降低”或“缺失”包括所述特性仅在本发明主题的部分中的改变，例如，修饰作用可以在细胞的区室如细胞器内存在，或在植物的部分，如组织、种子、根、叶、花等中存在，但是当检测完整主体即完整细胞或植物时，修饰作用检测不到。优选地，“减少”、“降低”或“缺失”在细胞水平上存在，因此术语“活性的减少、降低或缺失”或“代谢物含量的减少、降低或缺失”涉及与野生型细胞相比细胞水平的减少、降低或缺失。此外，术语“减少”、“降低”或“缺失”包括所述特性仅在本发明方法中所用生物的不同生长相期间的改变，例如减少、降低或缺失仅在种子生长期间或开花期间发生。此外，该术语包括短暂的减少、降低或缺失，例如由于所用RNAi未整合至生物的基因组内并且因此仅具有瞬时效果。
因此，术语术语“减少”、“降低”或“缺失”意指酶或其他蛋白质或调节性RNA的特异活性以及化合物或代谢物，例如多肽、核酸分子或本发明的精细化学品或编码性mRNA或DNA的量可以在一定体积内减少、降低或缺失。
术语“野生型”、“对照”或“参考”可以互换并且可以是细胞或生物的部分如器官或组织，或者生物尤其微生物或植物，其未受根据本文中所述的本发明方法修饰或处理。因此用作野生型、对照或参考的细胞或生物的部分如器官或组织，或者生物尤其微生物或植物尽可能地与细胞、生物或其部分对应，并且除了在本发明方法的结果的方面以外，在其它任何特性上与本发明的主题尽可能相同。因此，野生型、对照或参考完全相同或尽可能完全相同地受到处理，也即仅不影响所测试特性的品质的条件或特性可以不同。
优选地，任何比较均在相似条件下开展。术语“相似条件”意指这样的全部条件，例如培养条件或生长条件、测定条件(如缓冲液组成、温度、底物、病原株、浓度等)在待比较的实验间保持相同。
“参考”、“对照”或“野生型”优选地是这样的对象，例如细胞器、细胞、组织或生物尤其植物或微生物，其根据本发明未受本文中所述的本发明方法修饰或处理并且在任何其它特性上尽可能与本发明对象相似。参考、对照或野生型在其基因组、转录组、蛋白质组或代谢组方面尽可能与本发明的对象相似。优选地，优选地，术语“参考-”、“对照-”或“野生型-”细胞器、-细胞、-组织或-生物尤其植物或微生物涉及这样的细胞器、细胞、组织或生物尤其植物或微生物，其与本发明的细胞器、细胞、组织或生物尤其微生物或植物，或其部分优选地95％、更优选地98％、甚至更优选地99.00％、尤其99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、99.90％、99.99％、99.999％或更多在遗传上几乎相同。最优选地，“参考”、“对照”或“野生型”优选地是这样的对象，例如细胞器、细胞、组织或生物尤其植物或微生物，其除了核酸分子或由它们所编码的基因产物根据本发明方法进行改变以外，与根据本发明所用的生物、细胞或细胞器在遗传上相同。
优选地，参考、对照或野生型仅在本发明的多肽和RNA的细胞活性上与本发明对象不同，例如因为本发明核酸分子水平的减少、降低或缺失或本发明的多肽和RNA的特异活性减少、降低或缺失，例如是因为或由于蛋白质和RNA的水平或活性，这意指其生物学活性和/或其生物化学或遗传原因。
术语“表达”意指将基因转录为结构性RNA(rRNA、tRNA、miRNA)或信使RNA(mRNA)，随后信使RNA翻译为蛋白质。表达可以实验地通过例如RNA印迹、qRT PCR、连缀转录分析或者蛋白质印迹和其他免疫分析法检测。表达的减少、降低或缺失的结果意指基因减少、降低或缺失的转录导致出现相关的表型性状，例如增强的或增加的胁迫耐性。
因此，优选的参考对象是本发明方法的起始对象。优选地，将该参考和本发明主题在标准化和归一化后与例如总RNA、DNA或蛋白质的量或者参考基因如持家基因例如遍在蛋白的活性或表达相比较。
存在一系列这样的机制，通过此类机制对本发明多肽的修饰可以直接或间接地影响胁迫耐性。例如，可以减少、降低或缺失本发明多肽的分子数或特异活性或者本发明核酸分子的表达量。然而，例如通过修饰对基因的调节作用或通过减少或降低由本发明核酸分子编码的mRNA或基因产物的稳定性，还有可能减少、降低或缺失在生物中天然存在的基因的表达。
这还类似地适用于组合地减少、降低或缺失本发明核酸分子或其基因产物的表达以及同时对其它活性如赋予胁迫耐性的酶的操作。
减少、降低、缺失或调节作用根据本发明可以是组成型的，例如原因在于稳定持久的转基因表达或在于编码本发明核酸分子的相应内源性基因内的稳定突变或在于对赋予本发明多肽表达的基因的表达或行为的调节，或者是短暂的，例如原因在于瞬时转化或临时添加调节剂如激动剂或拮抗剂，或者是诱导型的，例如在以携带受到诱导型启动子控制的本发明的双链RNA核酸分子、反义核酸分子、核酶的诱导型构建体转化并添加例如四环素或如下文所述的诱导物后。
与对照、参考或野生型相比，在活性上的减少、降低或缺失优选地为至少10％、优选地至少30％或至少60％、特别优选地至少70％、80％、85％、90％或更高、极特别优选地是至少95％、更优选地是至少99％或更高。在活性上的减少、降低或缺失最优选地达到100％。
在本上下文中，失活意指所编码多肽的酶活性或生物学活性在生物或在细胞如在植物或植物细胞中不再可检测到。为了本发明目的，下调(＝减少)意指所编码的多肽的酶活性或生物学活性与未处理的生物的活性相比部分地或基本完全地减少。这可以通过不同的细胞生物学机制加以实现。在本上下文中，活性可以在完整的生物中或在多细胞生物情况下在生物的独立部分例如当是植物时，在组织如种子、叶、根或其他部分内受到下调。在本上下文中，酶活性或生物学活性与对照、参考或野生型相比减少至少10％、有利地至少20％、优选地至少30％、特别优选地至少40％、50％或60％、极特别优选地至少70％、80％、85％或90％或更高，极特别优选地是至少95％、更优选地是至少99％或更高。在活性上的减少、降低或缺失最优选地达到100％。
用于减少由本发明核酸编码的蛋白质或本发明核酸序列本身的量(＝表达)、活性或功能的多种策略包括在本发明中。技术人员将意识到可以获得用于以所需方式影响蛋白质的量、活性或功能的一系列不同方法。
术语“生物学活性”意指本发明蛋白质的生物学功能。与术语“生物学活性”相反，术语“活性”意指在产生由本发明方法所产生化合物上的增加。术语“生物学活性”优选地指酶功能、转运载体功能、DNA包装功能、热休克蛋白功能、重组作用蛋白质功能、β-半乳糖苷酶功能、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶CTR1功能、脂肪酶功能、烯酰CoA水合酶功能、UDP-葡萄糖葡糖基转移酶功能、细胞分裂蛋白质功能、黄酮醇合酶功能、三酰甘油脂肪酶、MADS盒蛋白功能、果胶酯酶功能、果胶甲酯酶功能、钙转运ATP酶功能、蛋白激酶功能、溶血磷脂酶功能、叶绿素A-B结合蛋白功能、Ca2+转运ATP酶样蛋白质功能、过氧化物酶功能、疾病抗性RPP5样蛋白功能或者肽或蛋白质在生物、组织、细胞或细胞区室中的调节功能。合适的底物是低分子量化合物并且还是某蛋白质的蛋白质相互作用伴侣(partner)。术语生物学功能的“减少”指在生物、组织、细胞或细胞区室中蛋白质在除非另外说明否则相同的条件下(例如培养条件、植物年龄以及等等)，例如通过本文如下所述的方法与对其未施用此方法的相同属和种的野生型相比，例如对至少一种底物的结合能力或结合强度的定量性减少。还将减少理解为意指修饰底物的专一性，如其可以表达为值kcat/Km。在本上下文中，与未处理的生物相比，减少至少10％、有利地至少20％、优选地至少30％、特别优选地至少40％、50％或60％、极特别优选地至少70％、80％、90％或95％的功能有利。特别有利的实施方案是使功能失活。蛋白质的结合伴侣可以用技术人员熟悉的方式进行鉴定，例如通过酵母双杂交系统。
修饰，即减少，可以由内源性或外源性因素引起。例如活性在生物或其部分中的减少可以通过将化学性化合物如拮抗剂添加至植物的介质、营养基、土壤或植物本身引起。
将经转化的植物细胞与相应非转化的相同属和种的野生型在除非另外说明否则相同的条件下(例如培养条件、植物年龄以及等等)比较。在本上下文中，与未转化的生物相比，至少10％、有利地至少20％、优选地至少30％、特别优选地至少40％、50％或60％、极特别优选地至少70％、80％、90％、95％或甚至100％或更高的改变有利。
在本发明中，基因在植物细胞的失活或下调引起与相应的未转化野生型植物细胞相比改变的代谢活性。一种优选的野生型植物细胞是未转化的拟南芥菜属(Arabidopsis)植物细胞。本文的实例是拟南芥菜属野生型C24(英国诺丁汉姆拟南芥菜贮藏中心UK；NASC Stock N906)。
其他优选的野生型植物细胞是来源自如下所选植物的未转化的植物细胞玉米、小麦、黑麦(rye)、燕麦(oat)、黑小麦(triticale)、稻(rice)、大麦(barley)、大豆(soybean)、花生(peanut)、棉花(cotton)、欧洲油菜(rapeseed)、卡诺拉油菜(canola)、木薯(manihot)、胡椒(pepper)、向日葵(sunflower)、亚麻(flax)、琉璃苣(borage)、红花(safflower)、胡麻(linseed)、报春花(primrose)、欧洲油菜(rapseed)、甘蓝型油菜(turnip rape)、万寿菊(tagetes)、茄科植物(solanaceousplants)、马铃薯(potato)、烟草(tabacoo)、茄子(eggplant)、番茄(tomato)、野豌豆属(Vicia)物种、豌豆(pea)、苜蓿(alfaalfa)、咖啡(coffee)、可可(cacao)、茶(tae)、柳属(Salix)物种、油棕榈(oil palm)、椰子(coconut)、多年生草本和饲料作物。
更优选的野生型植物细胞是亚麻属(Linum)植物的未转化细胞，优选地是亚麻(linum usitatissimum)，更优选地是变种Brigitta、Golda、Gold Merchant、HeIIe、JuNeI、Olpina、Livia、Marlin、Maedgold、Sporpion、Serenade、Linus、Taunus、Lifax或Liviola的未转化细胞，向日葵属(Heliantus)植物的未转化细胞，优选地是向日葵(Heliantus annus)、更优选地是变种Aurasol、Capella、Flavia、Flores、Jazzy、PaIuIo、Pegasol、PIR64A54、Rigasol、Sariuca、Sideral、Sunny、Alenka、Candisol或Floyd的未转化细胞，或者芸苔属(Brassica)植物的未转化细胞，优选地是欧洲油菜(Brassica napus)、更优选地是变种Dorothy、Evita、Heros、Hyola、Kimbar、Lambada、Licolly、Liconira、Licosmos、Lisonne、Mistral、Passat、Serator、Siapula、Sponsor、Star、Caviar、Hybridol、Baical、Olga、Lara、Doublol、Karola、Falcon、Spirit、Olymp、Zeus、Libero、Kyola、Licord、Lion、Lirajet、Lisbeth、Magnum、Maja、Mendel、Mica、Mohican、Olpop、Ontarion、Panthar、Prinoe、Pronio、Susanna、Talani、Titan、Transfer、Wiking、Woltan、Zeniah、Artus、Contact或Smart的未转化细胞。
基因的失活或下调是有利的，因为不必导入新基因以实现引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的改变的代谢活性。仅内源基因在其表达上受到阻遏。
失活或下调的基因直接或间接地影响植物的胁迫抗性，优选地影响转化的植物细胞的代谢活性。
胁迫耐性可以由一个或多个失活或下调的基因赋予，所述基因由选自如下的一个或多个核酸序列编码 a)核酸分子，其编码SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868中所示的多肽； b)核酸分子，其包含因遗传密码简并性可以从SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868中所述多肽序列衍生的核酸序列； c)编码多肽的核酸分子，其中该多肽具有与核酸分子(a)至(c)所编码的氨基酸序列至少50％同一性并具有由根据SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868的蛋白质所代表的生物学活性； d)编码多肽的核酸分子，其中该多肽是用针对由核酸分子(a)至(d)所编码的多肽的单克隆抗体分离的并具有根据SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82的蛋白质所代表的生物学活性； e)核酸分子，其用包含核酸分子(a)或(b)的序列之一的探针或用该探针的具有(a)至(c)中所表征核酸分子至少15nt、优选地20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的片段在严格杂交条件下筛选合适核酸文库能够得到并且编码由这样的蛋白质所代表的生物学活性的多肽，所述蛋白质的减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。
或者其包含与之互补的序列。
本发明使得可能在靶植物、尤其作物植物中鉴定由选自根据SEQ IDNO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867的序列和/或其同系物的核酸序列所编码的基因，并且随后使相应基因失活或下调以实现对环境胁迫增加的耐性和/或抗性(优选地通过改变的代谢活性)。因此本发明不限于特定的植物。
为了本发明的目的，将SEQ ID No和表述SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81；和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867概括并称作“SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433”。
这意指，在本说明书通篇范围内，术语“SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81；和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867”与术语“SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433”是相同的并且在本上下文中可以互换。
为了本发明的目的，将SEQ ID NO和表述SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82，和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868概括并称作“SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433”。
这意指，在本说明书通篇范围内，术语“SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82；和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868”与术语“SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433”相同的并且在本上下文中可以互换。
还可能通过筛选植物细胞与非胁迫条件相比改变的代谢活性而检测植物细胞或植物中的环境胁迫。这允许监测植物中的胁迫水平，甚至在症状不可见时也是如此。因此可以更早地采取对抗措施并且例如可以通过及时浇水使作物损失最小化。
通过筛选与非胁迫条件相比在胁迫条件下的植物细胞对环境胁迫增加的耐性和/或抗性而筛选植物细胞或植物对环境胁迫增加的耐性和/或抗性也处于本发明范围内。这允许在不鉴定基因或无视观症状时选择具有对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的植物。
借助本发明，通过筛选与非胁迫条件相比在胁迫条件下的植物细胞对环境胁迫增加的耐性和/或抗性并选择具有对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的那些植物细胞，还可能将植物细胞或植物向对环境胁迫增加的耐性和/或抗性方向育种。筛选对环境胁迫增加的耐性和/或抗性与例如筛选基因相比更快且更容易。
筛选对本领域技术人员而言众所周知并且通常指的是搜索特定的特点或性状。在本发明中，植物或植物细胞中的性状是一般外观、健康度、损伤的视观症状如萎蔫和叶子发黄，或代谢物的浓度。用于筛选的方法和设备是本领域技术人员熟知的并且包括GC(气相色谱)、LC(液相色谱)、HPLC(高效(高压)液相色谱)、MS(质谱)、NMR(核磁共振)波谱学、IR(红外)光谱学、光量法等及这些方法的组合。
育种对于本领域技术人员也是常规知识。其应当理解为将特定属性或性状定向并且稳定地引入植物或植物细胞。
多种育种步骤由充分定义的人类干预加以表征，如选择待进行杂交的的品系，亲代品系的定向授粉或选择适宜的子代植物。可以采用不同的育种方法，这取决于所需要的特性。所有技术均为本领域技术人员充分知晓并包括但不限于例如杂交、近交、回交育种、多系育种、变种融合、种间杂交、非整倍体技术等。杂交技术还可以包括植物不育化以通过机械的、化学的或生物化学方法产生雄性不育植物或雌性不育植物。雄性不育植物与不同品系的花粉交叉授粉确保雄性不育植物而不是雌性不育植物的基因组均一地得到两个亲代品系的特性。本发明转基因的种子和植物因此可以用于改良植物品系的育种，其可以提高常规方法如除草剂或杀虫剂处理法的效率，或其因本发明转基因的种子和植物已修饰的遗传特性允许人们省去所述方法。或者，可以得到具有改善的胁迫耐性、优选地是干旱胁迫耐性和温度胁迫耐性的新作物，其因它们优化的“设施”产生质量比不能耐受相当的不利发育条件的产物更好的收获产物。
本发明提供环境胁迫可以是盐度、干旱、温度、金属、化学性、病原性和氧化胁迫或其组合，优选地是干旱和/或温度。
如本文中所用，术语“环境胁迫”指任何次优生长条件并且包括但不限于与盐度、干旱、温度、金属、化学性、病原性和氧化胁迫或其组合相关的次优条件。在在优选的实施方案中，环境胁迫可以是盐度、干旱、热和低温，或其组合，并且特别可以是低水含量和低温。其中干旱胁迫意指引起植物中水缺乏和供给植物的水减少的环境胁迫，其中低温胁迫意指低于+4℃的植物冷冻以及低于15℃的植物冷藏并且其中高温胁迫意指例如高于35℃的温度。胁迫和胁迫反应的类型取决于本发明所用的不同植物，即它在例如一种植物如小麦和另一种植物如拟南芥菜属之间不同。植物对环境胁迫的常见反应是产量损失和品质损失。还应当理解如本说明书和权利要求书中所用，“一个”可以意指一个或多个，这取决于它所用于的上下文。因此涉及“一个细胞”可以意指可以使用至少一种细胞。
本发明还提供转化的植物细胞，其具有与一个或多个SEQ IDNO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列同源的一个或多个核酸序列，其中植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、卡诺拉油菜、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、胡麻、报春花、油菜籽、甘蓝型油菜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈、椰子、多年生草本、饲料作物和拟南芥菜(Arabidopsisthaliana)、优选地是欧洲油菜(Brassica napus)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)或稻(Oryza sativa)。
本发明还提供转基因的植物细胞，其具有选自包含SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列和/或其同系物的失活或下调的基因，该基因优选来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻。
还可能在靶植物、尤其作物植物中鉴定由选自SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列和/或其同系物的核酸序列编码的基因，并且随后使相应基因失活或下调以实现对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。因此本发明不限于特定的植物。
本发明还提供转化的植物细胞，其具有与SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列之一同源的核酸序列，其中植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、卡诺拉油菜、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、胡麻、报春花、油菜籽、甘蓝型油菜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈、椰子、多年生草本、饲料作物和拟南芥菜、优选地欧洲油菜、大豆、玉米或稻。
本发明还提供转化的植物细胞，其中核酸与SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列至少约30％、尤其至少约50％同源。
根据本发明，转化的植物细胞可以源自单子叶植物或双子叶植物。单子叶植物或双子叶植物可以选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、卡诺拉油菜、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、胡麻、报春花、油菜籽、甘蓝型油菜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈、椰子、多年生草本、饲料作物和拟南芥菜、优选地欧洲油菜、大豆、玉米或稻。
转化的植物细胞可以源自裸子植物并且可以优选地选自云杉(spruce)、松(pine)和冷杉(fir)。
本发明还提供从所述的植物细胞产生并且是单子叶植物或双子叶植物的已转化植物。
转化的植物可以选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、卡诺拉油菜、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、胡麻、报春花、油菜籽、甘蓝型油菜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈、椰子、多年生草本、饲料作物和拟南芥菜、优选地欧洲油菜、大豆、玉米或稻。
从所述的植物细胞产生的转化植物优选地是裸子植物、更优选地是选自云杉、松和冷杉的植物。
本发明不仅涉及植物，还涉及由所述的任意转基因植物产生的农产品、植物部分如叶、花瓣、花药、根、块茎、茎、芽、花或尤其由所述的已转化植物产生的种子，该植物对这样的基因或其同系物在遗传上至少杂合，优选地纯合，此基因在失活或下调时引起与野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。
前述序列的同系物可以有利地分离自酵母、真菌、病毒、藻类、细菌，如醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)(醋杆菌亚属(subgen.Acetobacter))；嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)；不动杆菌(Acinetobacter sp.)；放线杆菌(Actinobacillus sp)；杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；气生超嗜热菌(Aquifex aeolicus)；化脓隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogene)；翠菊黄化植原体(Aster yellows phytoplasma)；芽孢杆菌(Bacillus sp.)；双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)；布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)；扩展短杆菌(Brevibacterium linens)；马耳他布氏菌(Brucella melitensis)；巴克纳氏菌(Buchnera sp.)；溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；衣原体(Chlamydia sp.)；嗜性衣原体(Chlamydophila sp.)；泥生绿菌(Chlorobium limicola)；腐蚀柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)；梭菌(Clostridium sp.)；睾丸酮丛生单胞菌(Comamonas testosteroni)；棒状菌(Corynebacterium sp.)；伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)；耐放射异常球菌(Deinococcusradiodurans)；节瘤腐蹄杆菌(Dichelobacter nodosus)；鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)；肠杆菌(Enterobacter sp.)；猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；黄杆菌(Flavobacterium sp.)；土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)；弗兰克氏菌(Frankia sp.CpH)；具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)；嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)；氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)；嗜血菌(Haemophilus sp.)；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)；乳杆菌(Lactobacillus sp.)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；李斯特氏菌(Listeria sp.)；溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)；百脉根中间根瘤菌(Mesorhizobium loti)；深海噬甲基菌(Methylophagathalassica)；铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)；微颤菌PRE1(Microscilla sp.PRE1)；莫拉氏菌TA144(Moraxella sp.TA144)；分枝杆菌(Mycobacterium sp.)；支原体(Mycoplasma sp.)；奈瑟氏球菌(Neisseria sp.)；亚硝化单胞菌(Nitrosomonas sp.)；念珠藻PCC 7120(Nostoc sp.PCC 7120)；Novosphingobium aromaticivorans；酒酒球菌(Oenococcus oeni)；柠檬泛菌(Pantoea citrea)；多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；戊糖片球菌((Pediococcus pentosaceus)；坑形席藻(Phormidium foveolarum)；植原体(Phytoplasma sp.)；鲍氏织线藻(Plectonema boryanum)；栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)；丙酸杆菌(Propionibacterium sp.)；普通变形菌(Proteusvulgaris)；假单胞菌(Pseudomonas sp.)；罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)；根瘤菌(Rhizobium sp.)；马红球菌(Rhodococcus equi)；海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)；立克次氏体(Rickettsia sp.)；鸭瘟立默氏菌(Riemerella anatipestifer)；黄化瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)；沙门氏菌(Salmonella sp.)；反刍月形单胞菌(Selenomonasruminantium)；嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)；志贺氏菌(Shigellasp.)；苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)；葡萄球菌(Staphylococcussp.)；链球菌(Streptococcus sp.)；链霉菌(Streptomyces sp.)；聚球藻(Synechococcus sp.)；集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp.PCC 6803)；热海栖热袍菌(Thermotoga maritima)；密螺旋体(Treponema sp.)；解脲脲支原体(Ureaplasma urealyticum)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)；苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；耶尔森氏菌(Yersinia sp.)；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，优选地是沙门氏菌或大肠埃希氏菌或植物，优选地分离自酵母，如来自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，或甚至更优选地来自植物，如拟南芥菜、玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、琉璃苣、红花、胡麻、报春花属、欧洲油菜、卡诺拉油菜和甘蓝型油菜、木薯属、胡椒属、向日葵属、万寿菊、茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、小灌木植物如咖啡、可可、茶、柳属物种、树如油棕榈、椰子、多年生草本如黑麦草和羊茅和饲料作物，如苜蓿和三叶草，以及来自云杉、松或冷杉，例如更优选地来自酿酒酵母或植物，优选是欧洲油菜、大豆、玉米或稻。
“同系物”在本文中定义为分别具有相似、或“同源”核苷酸序列或氨基酸序列的两种核酸或蛋白质。同系物包括如下文所定义的SRP的等位变体、直向同系物、旁向同系物、激动剂和拮抗剂。术语“同系物”还包含这样的核酸分子，其因密码子简并性与SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列中所示的核苷酸序列之一不同并且因而编码如与SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列中所示氨基酸序列所编码SRP相同的SRP。如本文中所用“天然存在的”SRP指在自然界存在的SRP氨基酸序列。
术语“同源性”意指各核酸分子或其所编码的蛋白质在功能和/或结构上等效。与以上所述的核酸分子同源并且是该核酸分子的衍生物的核酸分子是例如所述核酸分子的变异，其代表具有相同生物学功能的修饰，尤其代表对编码具有相同或基本相同生物学功能的蛋白质的修饰。它们可以是天然存在的变异，例如来自其它植物变种或物种的序列，或是突变。这些突变可以天然存在或可以通过诱变技术得到。等位变异可以是天然存在的等位变体和以合成方式产生的变体或基因工程变体。结构等效物可以例如通过测试所述多肽对抗体的结合或基于计算机预测加以确定。结构等效物具有相似的免疫学特征，例如包含相似的表位。
根据本发明从如SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40并且n＝47至433中所示的多肽之一中通过替换、插入或缺失而衍生的功能等同物具有与本发明如SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40并且n＝47至433中所示的多肽之一至少30％、35％、40％、45％或50％，优选地至少55％、60％、65％或70％，更优选至少80％，特别优选地至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，极特别优选地至少95％、97％、98％或99％的同源性，并且通过如与SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40并且n＝47至433中所示多肽的基本相同的特性加以区分。
根据本发明从根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40并且n＝47至433的核酸序列通过替换、插入或缺失而衍生的功能等同物具有与本发明如SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40并且n＝47至433中所示的多肽之一至少30％、35％、40％、45％或50％，优选地至少55％、60％、65％或70％，更优选至少80％，特别优选地至少85％或90％、91％、92％、93％或94％，极特别优选地至少95％、97％、98％或99％的同源性，并且编码具有如与SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40并且n＝47至433中所示的多肽基本相同特性的多肽。
无论如何将功能等同物的“基本相同特性”理解为意指该功能等同物具有如上提及的活性，例如在生物例如微生物、植物或者植物组织或动物组织、植物细胞或动物细胞或者其部分中引起精细化学品量的增加，同时增加所述功能等同物的蛋白质的量、活性或功能。
“杂交”意指此类核酸分子在常规杂交条件，优选地在例如Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))或在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.中所述的严格条件下杂交。
根据本发明，本发明核酸的DNA以及RNA分子可以用作探针。此外，作为用于鉴定功能同系物的模板，可以开展RNA印迹分析以及DNA印迹分析。RNA印迹分析有利地提供关于已表达的基因产物的其它信息例如表达模式、加工步骤如剪接和加帽等的发生。DNA印迹分析提供关于编码本发明核酸分子的基因的染色体定位和组织方式的额外信息。
严格杂交条件的非限制性优选实例是在6×氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中在大约45℃的杂交，随后在50至65℃例如在50℃、55℃或60℃上在0.2×SSC、0.1％SDS中进行一个或多个洗涤步骤。技术人员知道随核酸类型的不同以及例如当存在有机溶剂时，涉及温度和缓冲液浓度的这些杂交条件发生改变。在“标准杂交条件”下温度例如作为核酸类型的函数在42℃和58℃间、优选地在45℃和50℃间在浓度为0.1×、0.5×、1×、2×、3×、4×或5×SSC(pH7.2)的含水缓冲液中不同。当以上提及的缓冲液中存在有机溶剂时，例如50％甲酰胺，“标准杂交条件”下的温度大约是40℃、42℃或45℃。用于DNA:DNA杂交体的杂交条件优选地例如是0.1×SSC和20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，优选地在30℃和45℃间。用于DNA:RNA杂交体的杂交条件优选地是0.1×SSC和30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃，优选地在45℃和55℃之间。以上提及的杂交温度测定用于例如不存在甲酰胺时对长度大约100bp(＝碱基对)并且具有50％G+C含量的核酸。技术人员借助教材，例如以上所提及的教材，或来自如下教材Sambrook，“Molecular Cloning”，Cold Spring HarborLaboratory，1989；Hames和Higgins(编辑)1985，“Nucleic Acids杂交ationA Practical Approach”，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(编辑)1991，“Essential Molecular BiologyA Practical Approach”，IRL Press at Oxford University Press，Oxford或“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)知道确定所需要的杂交条件。
如此的又一个严格杂交条件的实例是在65℃4×SSC杂交，随后在65℃在0.1×SSC中洗涤1小时。备选地，示例的严格杂交条件是42℃在50％甲酰胺、4×SSC中。此外，洗涤步骤期间的条件可以选自通过低严格条件(大约2×SSC在50℃)和高严格条件(大约0.2×SSC在50℃、优选地在65℃)所界定的条件范围(20×SSC0.3M柠檬酸钠，3M NaCl，pH7.0)。此外，洗涤步骤期间的温度可以从在室温，大约22℃的低严格条件提高至在大约65℃的较高严格条件。两个参数-盐浓度和温度可以同时变化，或两个参数之一保持恒定而另一参数变化。在杂交期间也可以应用变性剂例如甲酰胺或SDS。在50％甲酰胺存在下，杂交优选地在42℃实施。相关因素i)处理时间的长度、ii)盐条件、iii)去污剂条件、iv)竞争性DNA、v)温度和vi)探针的选择可以逐个进行组合，因此在本文中没有提及所有的可能性。
因此在优选的实施方案中，将RNA印迹条与Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth，Karlsruhe)在68℃预杂交2小时。杂交以放射性标记探针在68℃过夜实施。随后的洗涤步骤在68℃以1×SSC开展。
对于DNA印迹分析，膜与Rothi-Hybri-Quick缓冲液(Roth，Karlsruhe)在68℃预杂交2小时。杂交以放射性标记探针在68℃过夜实施。随后丢弃杂交缓冲液并且将滤膜用2×SSC、0.1％SDS短暂洗涤。在丢弃洗涤缓冲液后，添加新鲜2×SSC、0.1％SDS缓冲液并且在68℃温育15分钟。开展该洗涤步骤两次，随后使用1×SSC、0.1％SDS在68℃开展额外的洗涤步骤10分钟。
用于DNA杂交(DNA印迹分析法)条件和洗涤步骤的某些实例显示如下 (1)可例如从如下条件中选择杂交条件 a)在65℃4×SSC， b)在45℃6×SSC， c)在68℃6×SSC、100mg/ml变性的片段化鱼精DNA， d)在68℃6×SSC、0.5％SDS、100mg/ml变性的鲑鱼精DNA， e)在42℃6×SSC、0.5％SDS、100mg/ml变性的片段化鲑鱼精DNA、50％甲酰胺， f)在42℃50％甲酰胺、4×SSC， g)在42℃50％(体积/体积)甲酰胺、0.1％牛血清白蛋白、0.1％菲可、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、50mM磷酸钠缓冲液pH6.5、750mM NaCl、75mM柠檬酸钠， h)在50℃2×或4×SSC(低严格条件)，或 i)在42℃30至40％甲酰胺、2×或4×SS℃(低严格条件)。
(2)可例如从如下条件中选择洗涤步骤 a)在50℃0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS。
b)在65℃0.1×SSC。
c)在68℃0.1×SSC、0.5％SDS。
d)在42℃0.1×SSC、0.5％SDS、50％甲酰胺。
e)在42℃0.2×SSC、0.1％SDS。
f)在65℃2×SSC(低严格条件)。
就本发明此处所述而言，“经转化的”意指所有这样的植物或其部分，其已经通过操作方法已产生和/或受到修饰并且在其中 a)一个或多个基因，其优选地通过如SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433中所示序列或其同系物的一个或多个核酸序列编码，或 b)遗传调节元件，例如启动子，其功能性地连接至例如SEQ IDNO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列或其同系物的核酸序列，或 c)(a)和(b) 不在它/它们的天然遗传环境中存在或已经通过操作方法被修饰。
对于修饰而言有可能例如是一个或多个核苷酸残基的替换、添加、缺失、倒位或插入。操作在本发明中还意图包括在植物细胞中的所有改变，包括诱导或非诱导(天然)的诱变、通过常规育种或通过现代遗传操作方法的定向性或非定向性遗传操作，现代遗传操作方法例如是通过双链RNA干扰(dsRNAi)、导入反义核酸、核酶、与核酶组合的反义核酸、编码共抑制物的核酸、编码负显性蛋白质、靶向所述基因或RNA或蛋白质的DNA结合因子或RNA结合因子或蛋白质结合因子、诱导RNA降解的病毒核酸和病毒表达系统、用于诱导所述基因同源重组的系统、在所述基因内的突变或上述的组合减少基因表达。其他修饰和操作方法将从进一步的描述中显而易见。
“天然遗传环境”意指在起源生物中的天然染色体位点或存在于基因组文库内。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地仍然至少部分得以保留。此环境分布在该核酸序列的至少一侧并具有至少50bp、优选地至少500bp、特别优选地至少1000bp、极特别优选地至少5000bp的序列长度。
将植物或植物细胞视为对特定性状为“纯育的”，当它对此性状基因纯合至如此程度，以至当这种纯种植物自我授粉时，没有在子代中观察到该性状显著量地自由分离。
还如本文中所用，术语“核酸”和“核酸分子”意指包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA的类似物。该术语还包括位于基因编码区3′和5′末端的非翻译序列距离基因的编码区5′末端上游至少约1000个核苷酸的序列和距离基因的编码区3′末端下游至少约200个核苷酸的序列。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选地是双链DNA。
“分离的”核酸分子是与在该核酸的天然来源中存在的其它核酸分子基本分开的一种核酸分子。这意指基于目的核酸的重量，其它核酸分子以低于5％重量、优选地低于2％重量、更优选地低于1％重量、最优选地低于0.5％重量的量存在。优选地，“分离的”核酸不含在衍生该核酸的生物的基因组DNA中天然分布于该核酸两侧的某些序列(即位于该核酸5′和3′末端的序列)。例如，在多种实施方案，分离的编码基因的核酸分子可以含有少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb在衍生该核酸的生物的基因组DNA中天然分布在该核酸两侧的核苷酸序列。此外，“分离的”核酸分子，如cDNA分子可以不含与该核酸分子天然结合在一起的某些其它细胞材料，或当核酸分子通过重组技术产生时不含培养基，或当核酸分子化学性合成时不含其它化学品。
本发明的核酸分子，例如编码在失活或下调时在植物中赋予对环境胁迫的耐性和/或抗性的基因或其部分或其同系物的核酸分子，可以使用标准分子生物学技术和本文中所提供的序列信息加以分离。例如，编码拟南芥菜基因的cDNA可以使用根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的核酸序列之一的全部或部分从拟南芥菜文库中分离。此外，包含根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列之一的全部或部分的核酸分子可以使用基于该序列所设计的寡核苷酸引物通过聚合酶链反应分离。例如，mRNA可以自植物细胞(例如通过Chirgwin等，1979Biochemistry 185294-5299的异硫氰酸胍提取法)分离并且cDNA可以使用逆转录酶(例如自Gibco/BRL，Bethesda，MD可得到的Moloney MLV逆转录酶；或自Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL可得到的AMV逆转录酶)制备。用于聚合酶链反应扩增的合成性寡核苷酸引物可以基于根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的核苷酸序列之一进行设计。本发明的核酸分子可以使用cDNA或者备选地基因组DNA作为模板以及适宜的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术扩增。如此扩增的核酸分子可以克隆至适宜的载体并通过DNA序列分析表征。此外，与编码基因的核苷酸序列对应的寡核苷酸可以通过标准合成技术制备，例如使用自动化DNA合成仪。
在优选的实施方案中，本发明分离的核酸分子包含在序列SEQ IDNO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433序列中所示的核苷酸序列之一或其同系物，其编码基因(即“编码区”)，以及5′非翻译序列和3′非翻译序列。
此外，本发明核酸分子可以仅包含SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列或其同系物之一的编码区的部分，例如，可用作探针或引物的片段或编码基因的生物活性部分的片段。由本发明所述编码基因的核苷酸所编码的基因或蛋白质的部分优选地是本文中所述的基因或蛋白质的生物活性部分。如本文中所用，术语所述基因编码的基因或蛋白质的“生物活性部分”意在包括在植物中参与胁迫耐性和/或抗性反应的基因或蛋白质的部分，例如结构域/基序，其中所述胁迫耐性和/或抗性反应优选地通过改变代谢活性实现并最终引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。为确定由所述基因编码的基因或蛋白质或其生物活性部分的失活或下调是否在植物中引起增加的胁迫抗性，其优选地通过改变代谢活性实现，对包含该蛋白质的植物的胁迫分析可以例如通过上述筛选方法或通过评估整体外观和健康开展。更具体地，编码由所述基因编码的基因或蛋白质中生物活性部分的核酸片段可以通过分离SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433或其同系物的核酸序列之一的部分、(例如通过体外重组表达)表达基因、蛋白质或肽的编码部分并评估基因、蛋白质或肽的编码部分的活性加以制备。
此外，有可能以本发明方法中所用多肽，特别用从中可以衍生保守区域并且随即衍生简并引物的本发明多肽序列通过开展蛋白质序列比对而鉴定来自多种生物的保守区域。对本发明多肽保守的区域在图中所示的比对中显示。保守区域是在来自数个不同起源的同系物中一个特定位置内的氨基酸显示极少变化的那些区域。
本发明所包含的蛋白质的部分一般包括这样的肽，其包含自SEQ IDNO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列之一所编码的蛋白质肽或从与该蛋白质同源的蛋白质的氨基酸序列衍生的氨基酸序列，所述肽包含比该全长蛋白质较少的氨基酸或包含与该蛋白质同源并表现至少该蛋白质某些活性的全长蛋白质。通常，生物活性部分(例如长度例如为5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多个氨基酸的肽或蛋白质)包含具有该蛋白质至少某些活性的结构域或基序。此外，在其中蛋白质的其它区域已缺失的其它生物活性部分可以通过重组技术制备并评估本文中所述的一种或多种活性。优选地，该蛋白质的生物活性部分包括所选择的一个或多个结构域/基序或者其具有生物学活性的部分。
除了本文中所述的蛋白质的片段之外，本发明尤其包括植物中天然存在的蛋白质和编码蛋白质的核酸的同系物和类似物。
“同系物”在本文中定义为分别具有相似、或“同源”核苷酸序列或氨基酸序列的两种核酸或蛋白质。同系物包括如下文所定义的蛋白质的等位变体、直向同系物、旁向同系物、激动剂和拮抗剂。术语“同系物”还包含这样的核酸分子，其因密码子简并性与SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列(和其部分)中所示的核苷酸序列之一不同并且因而编码了与氨基酸序列所编码的蛋白质相同的蛋白质。如本文中所用“天然存在的”蛋白质指在自然界存在的氨基酸序列。
除了本文中所述的本发明片段和融合多肽之外，本发明包括在植物中天然存在的蛋白质的同系物和类似物和编码蛋白质的核酸的同系物和类似物。“同系物”在本文中定义为分别具有相似、或“同源”核苷酸序列或氨基酸序列的两种核酸或蛋白质。同系物包括如下文所定义的SRP的等位变体、直向同系物、旁向同系物、激动剂和拮抗剂。术语“同系物”还包含这样的核酸分子，其因密码子简并性与SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433序列(和其部分)中所示的核苷酸序列之一不同并且因而编码与SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433中所示的核苷酸序列编码的SRP相同的SRP。如本文中所用“天然存在的”蛋白质指在自然界存在的氨基酸序列。优选地，它的减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的天然存在的蛋白质包含选自SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433中所示氨基酸序列之一的氨基酸序列。
蛋白质减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的蛋白质的激动剂可以保留所述蛋白质的基本相同或亚组的生物学活性。蛋白质减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的蛋白质的拮抗剂可以抑制该蛋白质天然存在形式的一种或多种活性。例如拮抗剂可以竞争性结合至细胞膜成分代谢级联的包括所述蛋白质在内的下游成分或上游成分，或结合至介导化合物转运穿过此类膜的本发明蛋白质，因而阻止转位发生。
与本发明cDNA的蛋白质的天然等位变体和类似物、直向同系物和旁向同系物对应的核酸分子可以基于它们如本文中所述与拟南芥菜、酿酒酵母、大肠杆菌，尤其与欧洲油菜、大豆、玉米或稻的蛋白质的核酸的同一性，使用所述蛋白质的cDNA或其部分作为探针，根据标准杂交技术在严格杂交条件加以分离。在备选的实施方案中，蛋白质减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的蛋白质的同系物可以通过对所述蛋白质的突变体如截短突变体的组合物文库筛选它们的激动剂活性或拮抗剂活性进行鉴定。在一个实施方案中，蛋白质减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的蛋白质的混杂文库通过在核酸水平上的组合诱变生成并由混杂的基因文库编码。SRP变体的混杂文库可以如此产生，例如通过将合成性寡核苷酸混合物用酶连接为基因序列以至一套简并性的有效SRP序列可表达为单个的多肽或备选地是一套更大的融合多肽(例如对噬菌体展示而言)，其含有蛋白质减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的成套蛋白。存在可用于自简并性寡核苷酸序列中产生有效的蛋白质同系物的文库的多种方法。简并性基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪上开展，并且随后将合成性基因连接至合适表达载体。使用成套简并性基因允许在一种混合物内提供编码所需要的本发明成套有效的蛋白质的全部序列。用于合成简并性寡核苷酸的方法在本领域已知。参见例如，Narang，S.A.，1983，Tetrahedron 393；ltakura等，1984，Annu.Rev.Biochem.53323；ltakura等，1984，Science 1981056；Ike等，1983，Nucleic acid Res.11477。
此外，本发明蛋白质的编码区的片段文库可以用于生成蛋白质片段的混杂群体以筛选并随后选择所述蛋白质的同系物。在一个实施方案中，编码序列的片段文库可以如此生成，即用核酸酶于仅在每分子上切割大约一次的条件下处理编码本发明蛋白质的序列的PCR双链片段，使双链DNA变性，使DNA复性以形成双链DNA，其可能包含来自不同切口产物的有义/反义配对，通过S1核酸酶处理从再次形成的双链体中除去单链部分，并且将得到的片段文库连接至表达载体。通过此方法，可以衍生编码蛋白质的多种大小的氨基端、羧基末端和中段片段的表达文库，其中所述蛋白质的减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。
在本领域已知数种技术用于筛选由点突变或截短所产生的组合文库中的基因产物，并且用于筛选cDNA文库中具有所选择特性的基因产物。此类技术适应于快速筛选由SRP同系物的组合诱变所生成的基因文库。对于高通量分析可操作的最广泛用于筛选庞大基因文库的技术通常包括将基因文库克隆至可复制的表达载体、用得到的载体文库转化适宜细胞并在如此条件下表达组合性基因，在该条件下检测所需要的活性有利于分离编码其产物受到检测的基因的载体。一种提高文库中功能性突变体出现频率的新技术Recursive ensemble诱变(REM)可以与筛选分析法组合使用以鉴定SRP同系物(Arkin和Yourvan，1992，PNAS 897811-7815；Delgrave等，1993，Polypeptide Engineering 6(3)327-331).在另一个实施方案中，使用本领域众所周知的方法，基于细胞的分析法可以用于分析(本发明)混杂的蛋白质文库。本发明还提供鉴定蛋白质减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的新蛋白质的方法，包括(a)产生与如本文中所述的蛋白质或其片段起反应的特异性抗体；(b)用这种抗体筛选推测的SRP材料，其中抗体对材料的特异性结合表示存在潜在的新蛋白质，它的减少或缺失将引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性；和(c)与已知的蛋白质比较，分析已结合的材料以确定它的新颖性。
如上所述，本发明包括它的减少或缺失将引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的蛋白质及其同系物。为测定两种氨基酸序列的序列同一性百分数(例如SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列之一及其突变形式)，将序列为最佳比较目的进行比对(例如可以将缺口导入一种多肽的序列用于与另一种多肽或核酸最佳比对)。比较在相应氨基酸位置上的相应氨基酸残基。当一种序列(例如SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列之一)的一个位置由另一序列(例如选自SEQ IDNO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433的多肽的序列的突变形式)中相应位置上的相同氨基酸残基占据时，则两种分子在此位置上相同。相同类型的比较可以在两种核酸序列间开展。
两种序列间的序列同一性百分数是由两种序列间共有的相同位置数的函数(即同一性百分数＝相同位置数/总位置数×100)。优选地，本发明中所包含的分离的氨基酸同系物与SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433中所示的完整氨基酸序列至少约50-60％、优选地至少约60-70％、并且更优选地至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，并且最优选地至少约96％、97％、98％、99％或更高地相同。在又一个实施方案中，本发明中所包含的分离的氨基酸同系物与根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的核酸序列所编码的多肽的完整氨基酸序列至少约50-60％、优选地至少约60-70％、并且更优选地至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，并且最优选地至少约96％、97％、98％、99％或更高相同。在其它实施方案中，本发明蛋白质的氨基酸同系物具有与SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433的多肽在至少15个连续氨基酸残基、更优选地至少25个连续氨基酸残基并且最优选地至少35个连续氨基酸残基上的序列同一性。
在另一个优选的实施方案中，本发明分离的核酸同系物包含这样的核苷酸序列，其与根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的核苷酸序列或与其包含至少20、30、40、50、60个连续核苷酸的部分至少约50-60％、优选地至少约60-70％、更优选地至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，并且甚至更优选地至少约95％、96％、97％、98％、99％或更高地同一。优选用于核酸的序列比较的长度是编码区的至少75个核苷酸、更优选地至少100个核苷酸并且最优选地是编码区的完整长度。
还优选本发明分离的核酸同系物编码SRP或其部分，其与根据SEQID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433的氨基酸序列至少85％同一并且在植物中发挥环境胁迫反应的调节剂功能。在更优选的实施方案中，核酸同系物在植物中的过量表达提高植物对环境胁迫的耐性。
为了本发明目的，两种核酸序列或两种多肽序列间的序列同一性百分数使用Vectro NTI 6.0(PC)软件包(InforMax，7600 Wisconsin Ave.，Bethesda，MD 20814)测定。将缺口开口罚值15和缺口延伸罚值6.66用于测定两种核酸的同一性百分数。将缺口开口罚值10和缺口延伸罚值0.1用于测定两种多肽的同一性百分数。将所有其它参数设置为默认环境。为了多重对比(Clustal W算法)目的，使用blosum62矩阵，缺口开口罚值为10并且缺口延伸罚值是0.05。应当理解为了测定序列同一性，在DNA序列与RNA序列比较时，胸苷核苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了包含与SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的分离的核酸。更特别地，本发明分离的核酸分子长至少15个核苷酸并且在严格条件下与包含SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的核苷酸序列的核酸分子杂交。在其它实施方案中，核酸长度是至少30、50、100、250或更多个核苷酸。优选地，本发明分离的核酸同系物包含在高度严格条件下与SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433中所示的核苷酸序列杂交并且在植物中发挥胁迫抗性调节物功能的核苷酸序列。在又一个优选的实施方案中，分离的核酸同系物在植物中的过量表达提高植物对环境胁迫的耐性。
如本文中所用，对DNA印迹与DNA印迹的杂交而言，术语“严格条件”在一个实施方案中指在10×Denharts溶液、6×SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中在60℃杂交过夜。将印迹膜在62℃依次在3×SSC/0.1％SDS、随后在1×SSC/0.1％SDS并且最后在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤，每次30分钟。还如本文中所用，“高度严格条件”指在10×Denharts溶液、6×SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中在65℃杂交过夜。将印迹膜在65℃依次在3×SSC/0.1％SDS、随后在1×SSC/0.1％SDS并且最后在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤，每次30分钟。用于核酸杂交方法在Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138267-284；编者Ausubel等，1995，Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Greene Publishing和Wiley-lnterscience，New York；以及Tijssen，1993，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization withNucleic Acids，第一部分，第2章，Elsevier，New York中描述。优选地，在严格条件或高度严格条件下与SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列杂交的本发明分离的核酸分子对应于天然存在的核酸分子。如本文中所用“天然存在的”核酸分子指具有在自然界存在的核苷酸序列(例如编码天然多肽)的RNA或DNA分子。在一个实施方案中，核酸编码天然存在的拟南芥菜、欧洲油菜、大豆、玉米或稻的蛋白质，所述蛋白质的减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。
使用以上所述的方法以及本领域技术人员所知的其它方法，本领域技术人员可以分离蛋白质的同系物，其包含在SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433中所示的氨基酸序列，其中所述蛋白质的减少或缺失将引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。这些同系物的一个亚类是等位变体。如本文中所用，术语“等位变体”指含有在所述蛋白质的氨基酸序列中引起改变并在天然群体(例如植物物种或变种)内存在的多态性的核苷酸序列。此类天然等位变异通常可以在本发明的核酸中引起1-5％的变异。等位变体可以通过对大量不同植物中的目的核酸序列测序加以鉴定，这可以通过使用旨在鉴定这些植物中相同的SRP遗传位点的杂交探针轻易地实施。在如此蛋白质中作为天然等位变异的结果并且不改变所述蛋白质功能性活性的任何和所有此类核酸变异以及得到的氨基酸多态性或变异均将处于本发明的范围内，其中蛋白质的减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。
可以如此产生编码与根据SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433的多肽序列具有序列同一性的蛋白质的分离核酸分子，其中所述蛋白质的减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性，即通过将一个或多个核苷酸替换、添加或缺失分别导入SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的核苷酸序列以至将一个或多个氨基酸的替换、添加或缺失导入所编码的多肽。突变可以通过标准技术如位点定向诱变和PCR介导的诱变导入SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列之一。优选地，在一个或多个预测为非关键氨基酸残基上开展保守性氨基酸替换。“保守性氨基酸替换”是其中将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的氨基酸替换。
为了敲除，突变优选地在关键位置上开展。
具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、带非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此将SRP中预测的非关键氨基酸基优选地替换为来自相同侧链家族的另一种基酸残基。备选地，在另一个实施方案中，突变备选地可以沿编码本发明蛋白质的序列的全部或其部分随机地导入，例如通过饱和诱变，并且得到的突变体可以筛选本文中所述SRP活性以鉴定保留蛋白质活性的突变体。在对SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列之一诱变后，可以重组地表达所编码的多肽并且该多肽的活性可以通过如本文中所述测定表达该多肽的植物的胁迫抗性加以测定。
除了编码蛋白质减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的蛋白质的核酸分子之外，本发明另一方面涉及对该核酸分子为反义的分离的核酸分子。据认为反义多核苷酸通过特异性结合靶多核苷酸并干扰靶多核苷酸的转录、剪接、转运、翻译和/或稳定性而抑制该靶多核苷酸的基因表达。本领域中已描述用于将反义多核苷酸靶向至染色体DNA、至初级RNA转录物或至已加工的mRNA的方法。优选地，靶区域包括剪接位点、翻译起始起始密码子、翻译终止密码子以及可读框内的其它序列。
术语“反义”，为了本发明目的，指这样的核酸，其包含与基因、初级转录物或已加工的mRNA的全部或部分足够互补以致干扰内源基因表达的多核苷酸。“互补性”多核苷酸是能够根据Watson-Crick互补原则进行碱基配对的那些多核苷酸，具体地，嘌呤与嘧啶碱基配对以形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)的组合并且在DNA例子中腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)或在RNA中腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。应当理解两种多核苷酸可以相互杂交，即便它们没有彼此完全互补，只要每一多核苷酸具有具有与另一种多核苷酸基本互补的至少一个区域即可。术语“反义核酸”包括可以转录以产生反义RNA的单链RNA表达盒和双链DNA表达盒。“活性”反义核酸是能够与编码多肽的初级转录物或mRNA选择性杂交的反义RNA分子，其中所述多肽具有与SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433的多肽至少80％序列同一性。
反义核酸可以与完整的SRP编码链互补或仅与其部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子对编码SRP的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。术语“编码区”指核苷酸序列中包含可翻译为氨基酸残基的密码子的区域。在另一个实施方案中，反义核酸分子对编码SRP的核苷酸序列的编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”指分布在编码区两侧的不翻译为氨基酸的5′和3′序列(即也称作为5′和3′非翻译区)。反义核酸分子可以与SRP mRNA的整个编码区互补，但是更优选仅对SRP mRNA的编码区或非编码区反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以与PKSRP mRNA的翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸可以例如长约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。一般地，本发明反义分子包含这样的RNA，其具有分别与SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的至少14个连续核苷酸的60-100％序列同一性。优选地，此序列同一性是至少70％、更优选地是至少75％、80％、85％、90％、95％、98％并且最优选地是99％。
本发明的反义核酸可以利用化学合成和酶连接反应，使用本领域已知的方法构建。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中设计修饰的核苷酸旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸和有义核酸间所形成的双链体物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰的核苷酸实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、次黄苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲基酯、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。备选地，反义核酸可以使用其中核酸已经在反义方向上亚克隆的表达载体以生物方式产生(即从已插入的核酸转录出的RNA将对靶目的核酸呈反义方向，这在如下部分进一步描述)。
在又一个实施方案。本发明的反义核酸分子是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补性RNA形成特异的双链杂交体，在此双链体中与常见的β单元相反，链彼此相互平行分布(Gaultier等，1987，Neuleic Acids.Res.156625-6641)。反义核酸分子还包含2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucleic acids Res.156131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS Lett.215327-330)。
通常将本发明的反义核酸分子施用至细胞或在原位(in situ)生成以至它们与编码SRP的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交，因而例如通过抑制转录和/或翻译而抑制多肽表达。杂交可以是通过常规的核苷酸互补性以形成稳定的双链体，或例如在结合至DNA双链体的反义核酸分子的情形，通过在双螺旋的大沟内的特异性相互作用而实现。可以如此修饰反义分子以至它特异性结合至选择的细胞表面的受体或抗原，例如通过将反义核酸分子连接至结合细胞表面的受体或抗原的肽或抗体。反义核酸分子还可以使用本文中所述的载体送递至细胞。为实现反义分子在细胞内足够的浓度，优选其中使反义核酸分子置于强的原核启动子、病毒启动子或真核(包括植物)启动子控制下的载体。
作为对反义多核苷酸的备选，核酶、有义多核苷酸或双链RNA(dsRNA)可以用于减少SRP多肽表达。通过“核酶”意指具有核糖核酸酶活性的基于催化性RNA的酶，其能够切割与之具有互补区域的单链核酸如mRNA。核酶(例如在Haselhoff和Gerlach，1988，Nature 334585-591中所述的锤头核酶)可以用于催化性切割本发明蛋白质的mRNA转录物以便因此抑制SRP mRNA的翻译。对本发明的核酸具有特异性的核酶可以基于如本文中所公开的cDNA的核苷酸序列(即SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433)或基于根据本发明中所教授的方法而分离的异源序列设计。例如，可以构建四膜虫(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与在编码SRP的mRNA中待受到切割的核苷酸序列互补。参见例如Cech等的美国专利号4,987,071和5,116,742。备选地，SRPmRNA可以用于从RNA分子库内选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。参见例如Bartel，D.和Szostak，J.W.，1993，Science2611411-1418。在优选的实施方案中，核酶将含有具备至少7、8、9、10、12、14、16、18或20个核苷酸并且更优选地7或8个核苷酸的与靶RNA的部分具有100％互补性的部分。用于产生核酶的方法对本领域技术人员已知。例如参见美国专利号6,025,167；5,773,260和5,496,698。
术语“dsRNA”如本文中所用指包含两条RNA链的RNA杂交体。dsRNA可以在结构上是线性或环状。在优选的实施方案中，dsRNA对这样的多核苷酸为特异性，其编码SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433的多肽或具有与SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40以及n＝47至433的多肽至少70％序列同一性的多肽。杂交的RNA可以基本互补或完全互补。“基本互补”意指当使用如上所述的BLAST程序对两种杂交的RNA进行最佳比对时，杂交的部分至少95％互补。优选地，dsRNA的长度是至少100个碱基对。一般地，杂交的RNA长度相同，没有突出的5′或3′端并且没有缺口。然而，达到100个核苷酸的具有5′或3′突出端的dsRNA可以用于本发明的方法中。
dsRNA可以包含核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物如2′-O-甲基核糖基或其组合。例如参见美国专利号4,130,641和4,024,222。dsRNA聚核糖次黄苷酸聚核糖胞苷酸在美国专利4,283,393中描述。用于产生和使用dsRNA的方法在本领域已知。一个方法包括在体内或在体外单个反应混合物内同时转录两条互补的DNA链。例如参见美国专利号5,795,715。在一个实施方案中，dsRNA可以通过标准转化方法直接导入植物或植物细胞。或者，dsRNA可以通过在植物细胞中转录两种互补的RNA得以表达。用于抑制内源基因表达的其它方法，如三股螺旋的形成(Moser等，1987，Science 238645-650和Cooney等，1988，Science 241456-459)和共抑制(Napoli等，1990，The Plant Cell 2279-289)在本领域已知。部分长度和全长的cDNA已用于共抑制内源性植物基因。例如，参见美国专利号4,801,340、5,034,323、5,231,020和5,283,184；Van der Kroll等，1990，The Plant Cell2291-299；Smith等，1990，Mol.Gen.Genetics 224477-481和Napoli等，1990，The Plant Cell 2279-289。
对于有义抑制，认为导入有义多核苷酸封闭了相应靶基因的转录。有义多核苷酸具有与靶植物基因或RNA至少65％的序列同一性。优选地，同一性百分数是至少80％、90％、95％或更高。导入的有义多核苷酸不必与靶基因或转录物在全长上相关。优选地，有义多核苷酸具有与SEQ IDNO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的至少100个连续核苷酸至少65％的序列同一性。同一性的区域可以包含内含子和/或外显子以及非翻译区域。导入的有义多核苷酸可以短暂存在于植物细胞中，或可以稳定整合至植物染色体或染色体外复制子。
此外，编码来自相同或其它物种的蛋白质，如蛋白质类似物、直向同系物和旁向同系物的核酸分子将处于本发明的范围内。如本文中所用，术语“类似物”指具有相同或相似功能，但在不相关的生物中独立演化的两种核酸。如本文中所用，术语“直向同系物”指通过物种形成从共同先祖基因演化的来自不同物种的两种核酸。通常，直向同系物编码具有相同或相似功能的蛋白质。还如本文中所用，术语“旁向同系物”指因在基因组中重复作用而相关的两种核酸。旁向同系物通常具有不同功能，不过这些功能可以是相关的(Tatusov，R.L.等1997Science 278(5338)631-637)。天然存在的胁迫相关蛋白的类似物、直向同系物和旁向同系物可以因翻译后修饰、因氨基酸序列差异或因这两种原因而与天然存在的胁迫相关蛋白不同。翻译后修饰包括多肽在体内和体外的化学衍生作用，如乙酰化作用、羧化作用、磷酸化作用和糖基化作用。并且此类修饰可以在多肽合成和加工期间发生或随后已分离的修饰酶处理。特别地，本发明的直向同系物通常显示与天然存在蛋白质的氨基酸序列的全部或部分至少30％、更优选地50％、并且最优选地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％的同一性或同源性并且显示类似于蛋白织的功能。
此类同系物、类似物、直向同系物和旁向同系物在本申请通篇范围内一般地称作同系物或是同源的。在SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40并且n＝47至433内所给出序列的同系物还理解为意指例如具有在衍生的氨基酸水平上至少30％同源性(＝同一性)、优选地至少50％、60％、70％或80％同源性、特别优选地至少85％同源性、极特别优选地90％、91％、92％、93％、94％同源性、最优选地95％、96％、97％、98％或99％同源性的同系物、类似物、直向同系物和旁向同系物。同源性(＝同一性)在整个氨基酸范围进行计算。所用程序分别是PileUp(J.Mol.Evolution.，25(1987)，351-360，Higgens等，CABIOS，51989151-153)或程序Gap和BestFit[Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48；443-453(1970)以及Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2；482-489(1981))，其是GCG软件包[Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711(1991)]的部分。以上提及的序列同源性百分数以程序BestFit或Gap，优选地以Gap对整个序列长度进行计算，所用参数如下缺口权重8，长度权重2。
本发明提供还提供产生转化的植物的方法，其中转化的植物中基因的失活或下调引起与相应的未转化野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性，该方法包括 (a)通过一个或多个基因的失活或下调转化植物细胞，所述基因优选地由选自根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40并且n＝47至433的核酸的一个或多个核酸和/或其同系物编码并且 (b)从该植物细胞产生具有与相应野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的转化的植物。
本发明还包括在所述植物细胞或所述植物中通过失活或下调由选自根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40并且n＝47至433的核酸中的一个或多个核酸和/或其同系物所编码的一个或多个基因，诱导与相应的未转化野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的方法。
核酸优选地与所述序列(见以上)至少约30％、特别地至少50％同源。同源序列还有可能来源于选自如下的植物玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦，稻，大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、卡诺拉油菜、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、胡麻、报春花属、欧洲油菜、甘蓝型油菜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈、椰子、多年生草本、饲料作物和拟南芥菜、优选地是欧洲油菜、大豆、玉米或稻。
所述基因的失活或下调可以通过本领域技术人员所知的所有方法实现，优选地通过双链RNA干扰(dsRNAi)、导入反义核酸、核酶、与核酶组合的反义核酸、编码共抑制物的核酸、编码负显性蛋白质的核酸、靶向所述基因或RNA或蛋白质的DNA结合因子或RNA结合因子或蛋白质结合因子、诱导RNA降解的病毒核酸和病毒表达系统、用于诱导所述基因同源重组的系统、所述基因内的突变或以上组合。
本发明的核酸序列或其同系物是编码多肽的分离的核酸序列。这些核酸或由它们所编码的多肽以及其生物学活性和酶活性在本发明的方法中得以失活或下调，引起对环境胁迫增加的抗性和/或耐性。
在本上下文中，失活意指所编码的多肽的酶活性或生物学活性在生物或在细胞例如在植物或植物细胞中不再可以检测到。为了本发明目的，下调(＝减少)意指所编码的多肽的酶活性或生物学活性与未处理的生物活性相比部分或基本完全地减少。这可以通过不同地细胞生物学机制实现。在本上下文中，活性可以在完整的生物，或在多细胞生物情况下在生物的独立部分内，例如在植物中在组织如种子、叶、根或其他部分内下调。在本上下文中，酶活性或生物学活性与未处理的生物相比减少至少10％、有利地至少20％、优选地至少30％、特别优选地至少40％、50％或60％、极特别优选地至少70％、80％、90％或95％、99％或甚至100％。特别有利的实施方案是核酸的失活或由其编码的多肽的失活。
本发明包括用于减少由本发明核酸所编码的蛋白质的量(表达)、活性或功能的多种策略。技术人员将识别一些不同方法可获得用于以所需的方式影响蛋白质的量、活性或功能。
活性或功能上的减少优选地通过减少编码内源蛋白质的基因的表达实现。
蛋白质的量、活性或功能上的减少可以使用如下方法实现 a)导入双链RNA核酸序列(dsRNA)或者导入确保后者表达的一个表达盒或多于一个的表达盒； b)导入反义核酸序列或导入确保后者表达的表达盒。还包括其中使反义核酸序列导向针对基因(即基因组DNA序列)或基因转录物(即RNA序列)的那些方法。还包括α-异头核酸序列。
c)导入与核酸组合的反义核酸序列或导入确保前者表达的表达盒； d)导入用于诱导共抑制的有义核酸序列或导入确保前者表达的表达盒； e)导入编码显性失活的蛋白质的核酸序列或导入确保后者表达的表达盒； f)导入针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子或导入确保后者表达的表达盒； g)导入引起RNA降解的病毒核酸序列和表达构建体或导入确保前者表达的表达盒； h)导入用于在内源基因上诱导同源重组的构建体，例如用于产生敲除突变体。
i)将突变导入内源基因以产生功能的丧失(例如产生终止密码子、移码等)。
这些方法中的每一种均可以引起表达、活性或功能的减少用于本发明目的。组合利用也可行。其他方法为技术人员所知并且可以包含阻碍或阻止蛋白质的加工、蛋白质或其mRNA的转运、抑制核糖体附着、抑制RNA剪接、诱导降解RNA的酶和/或抑制翻译性延伸或终止。
术语“蛋白质的量”指多肽在生物、组织、细胞或细胞区室内的量。术语蛋白质的量“减少”指例如通过本文如下所述的方法在除非另外说明否则相同的条件下(例如培养条件、植物年龄以及等等)蛋白质在生物、组织、细胞或细胞区室内的量与对其未施用该方法的相同属和种的野生型相比定量地减少。在本上下文中，与未处理的生物相比，至少10％、有利地至少20％、优选地至少30％、特别优选地至少40％、50％或60％、极特别优选地至少70％、80％，或90％、95％、99％或甚至100％的减少是有利的。特别有利的实施方案是使核酸失活或使由核酸编码的多肽失活。
术语“活性”优选地指多肽在生物、组织、细胞或细胞区室内的活性。术语在活性上的“减少”指例如通过本文如下所述的方法在除非另外说明否则相同的条件下(例如培养条件、植物年龄以及等等)蛋白质在生物、组织、细胞或细胞区室内的整体活性与对其未施用该方法的相同属和种的野生型相比减少。在本上下文中，与未处理的生物相比，减少至少10％、有利地至少20％、优选地至少30％、特别优选地至少40％、50％或60％、极特别优选地至少70％、80％，或90％、95％、99％或甚至100％的减少是有利的。特别有利的实施方案是使核酸失活或使由核酸编码的多肽失活。
术语“功能”优选地指多肽在生物、组织、细胞或细胞区室内的酶功能和调节功能。合适的底物是低分子量化合物并且还是某蛋白质的蛋白质相互作用伴侣。术语在功能上的“减少”例如指在除非另外说明否则相同的条件下(例如培养条件、植物年龄以及等等)，例如通过本文如下所述的方法，蛋白质在生物、组织、细胞或细胞区室内对至少一种底物的结合能力或结合强度与对其未施用该方法的相同属和种的野生型相比定量地减少。将减少还理解为意指底物专一性的修饰，如其可以表达为值kcat/Km。在本上下文中，与未处理的生物相比，功能至少10％、有利地至少20％、优选地至少30％、特别优选地至少40％、50％或60％、极特别优选地至少70％、80％、90％或95％、99％或甚至100％的减少有利。特别有利的实施方案是使功能失活。蛋白质的结合伴侣可以以技术人员熟悉的方式加以鉴定，例如通过酵母双杂交系统。
如下简要描述各个优选的方法 A)导入双链RNA核酸序列(dsRNA) 通过双链RNA(“双链RNA干扰”；dsRNAi)调节基因的方法已经广泛描述用于动物和植物生物(例如Matzke MA等(2000)Plant Mol.Biol.43401-415；Fire A.等(1998)Nature 391806-811；WO 99/32619；WO99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364)。明确地参考以上参考文献中所述的技术和方法。高效的基因抑制还可以在例如瞬时表达或在瞬时转化后观察到，例如作为生物射弹转化结果(Schweizer P等(2000)Plant J 200024895-903)。dsRNAi方法基于这样的现象，即基因转录物的互补链和反向链的同时导入引起所讨论基因表达的高效抑制。产生的表型与类似敲除突变体(Waterhouse PM等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513959-64)的表型极为相似。
Tuschl等[Gens Dev.，1999，13(24)3191-3197]能够证实RNAi方法的效率是双链体长度、3′-突出末端的长度以及在这些突出端中序列的函数。基于Tuschl等的工作并假定如下原则在不同物种间保守，可以给予技术人员如下指导原则 ·为获得良好结果，通常应当避开所用的核酸序列的5′和3′非翻译区域以及靠近起始密码子的区域，因为这些区域富含调节蛋白结合位点并且RNAi序列和此类调节蛋白之间的相互作用可能导致不想要的相互作用； ·在植物中，所用核酸序列的5′和3′非翻译区域以及靠近起始密码子，优选地在起始密码子上游50至100nt的区域产生良好结果并且不应当避开； ·优选地选择所用的mRNA中AUG起始密码子下游50至100nt(＝核苷酸或碱基)的区域； ·仅来自外显子的dsRNA(＝双链RNA)序列可用于本方法，因为来自内含子的序列无效； ·该区域内的G/C含量应当大于30％并小于70％，理想地是在50％左右； ·靶mRNA的可能二级结构对RNAi方法的实现而言较不重要。
dsRNAi方法已经证实对减少根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列的核酸和/或其同系物序列的表达特别有效和有利。尤其如在WO 99/32619中所述，dsRNAi方法明显优于常规的反义方法。
本发明因此还涉及当导入生物有利地是植物(或细胞、组织、器官或衍生自其中的种子)时，引起SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的核酸和/或其同系物序列表达减少的双链RNA分子(dsRNA分子)。在用于减少由SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列之一的核酸和/或其同系物序列所编码的蛋白质表达的双链RNA分子中， i)两条RNA链中的一条链与至少部分的核酸序列基本相同，并且 ii)对应的另一条RNA链与至少部分的该核酸序列的互补链基本相同。
术语“基本相同”指这样的事实，即与靶序列相比，dsRNA序列还可以包含插入、缺失和独立的点突变而仍引起表达的有效减少。优选地，在抑制性dsRNA的“有义链”和本发明核酸序列的部分节段间(或各自在“反义”链和核酸序列的互补链之间)如上所定义的同源性达到至少75％、优选地至少80％、极特别优选地至少90％、最优选地100％。部分节段达到至少10个碱基、优选地至少25个碱基、特别优选地至少50个碱基、极特别优选地至少100个碱基、最优选地至少200个碱基或至少300个碱基的长度。作为备选，“基本相同的”dsRNA还可以定义为能够与基因转录物的部分发生杂交的核酸序列(例如在400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mMEDTA在50℃或70℃持续12至16小时)。
dsRNA可以由一条或多条聚合的核糖核苷酸链组成。对糖-磷酸盐主链和核苷的修饰也可以存在。例如天然RNA的磷酸二酯键可以以如此方式修饰以至它们包含至少一个氮或硫杂原子。碱基可以以如此方式修饰以至例如腺苷脱氨酶的活性受到限制。这些修饰和其他修饰在下文用于稳定反义RNA的方法中描述。dsRNA可以以酶方式制备；它还可以完全或部分地通过化学方式合成。
有效介导RNA干扰的短至30bp的dsRNA可以例如使用大肠杆菌核糖核酸酶III(RNase III)通过对长dsRNA模板部分消化有效地产生(Yang，D.，等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，9942.)。
双链结构可以从一条自我互补的单链开始或从两条互补双链开始形成。在自我互补的单链中，“有义”序列和“反义”序列可以通过接头序列(“接头”)连接并形成例如发夹结构。优选地，接头序列可以采用内含子的形式，其在dsRNA合成后被剪切。编码dsRNA的核酸序列可以含有其它元件，例如转录终止信号或聚腺苷酸化信号。如果dsRNA的两条链在细胞或生物有利地在植物中进行组合试，这可以通过多种方式发生 a)以包含两个表达盒的载体转化细胞或生物，有利地是植物， b)以两个载体共转化细胞或生物，有利地是植物，其中一个载体包含具有“有义”链的表达盒而另一个载体包含具有“反义”链的表达盒。
c)使两种生物杂交，有利地使植物杂交，每种生物已用一种载体转化，其中一个载体包含具有“有义”链的表达盒而另一个载体包含具有“反义”链的表达盒。
d)在细胞或生物已经用包含具有“反义”链的表达盒的载体加以转化后，以包含具有“有义”链的表达盒的载体超转化细胞或超转化生物，有利地是植物； e)导入包含引起目的序列从两个方向上转录的两个启动子的构建体；和/或 f)以能够产生目的dsRNA分子的经设计的病毒感染细胞或感染生物，有利地是植物。
RNA双链体的形成可以在细胞外或在细胞内发动。
如果dsRNAi在靶细胞或生物之外合成，可以将它通过注射、微注射、电穿孔、高速粒子、通过激光束导入或通过化学化合物(DEAE葡聚糖、磷酸钙、脂质体)介导至生物或此生物的细胞内，或在为动物的情况下，还可能用细菌如设计表达双链RNAi的大肠杆菌菌株饲喂动物。
如WO 99/53050中所述，dsRNA还可以通过“接头”(例如内含子)连接“有义”链和“反义”链而包含发夹结构。优选自我互补的dsRNA结构，因为它们仅需要构建体的表达并且总是以等摩尔比率包含互补链。
如WO 99/53050中所述，dsRNA还可以通过“接头”(例如内含子)连接“有义”链和“反义”链而包含发夹结构。优选自我互补的dsRNA结构，因为它们仅需要构建体的表达并且总是以等摩尔比率包含互补链。
编码dsRNA“反义”链或“有义”链或dsRNA的自我互补链的表达盒优选地插入载体并使用本文如下所述的方法(使用选择标志)稳定地插入植物基因组以确保dsRNA的永久表达。
dsRNA可以利用使每细胞含有至少一个拷贝的量加以导入。更大的量(例如每个细胞至少5、10、100、500或1,000个拷贝)可以引起更高的效率下降。
如已所述，实际上并不需要dsRNA与根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的核酸序列或其同系物的基因转录物之间100％序列同一性以引起表达的有效减少。因此，有利之处是本方法对序列偏差的耐受，因为序列偏差可以作为遗传性突变、多态性或进化趋异性的结果存在。因此，例如始于一种生物中根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的核酸或其同系物的序列之一所产生的dsRNA可以用于抑制另一种生物中相应的表达。
由于来自多种生物(例如植物)的根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列间的高度序列同源性，即蛋白质在例如其他植物中可能高度保守，因此dsRNA的表达任选地还有可能在其他植物物种中产生有利的效果，其中该dsRNA衍生自所公开的根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列之一或其同系物。
dsRNA可以在体内或在体外合成。为此目的，可以将编码dsRNA的DNA序列导入表达盒内处于至少一种遗传控制元件(例如启动子、增强子、沉默子、剪接供体或剪接受体或聚腺苷酸化信号)控制下。合适的有利构建体在本文如下所述。聚腺苷酸化不是必需的，用于启动翻译的元件也不必存在。dsRNA可以以化学方式或以酶方式合成。为此目的可以使用细胞的RNA聚合酶或细菌噬菌体的RNA聚合酶(例如T3、T7或SP6RNA聚合酶)。描述了用于体外表达RNA的合适方法(WO 97/32016；US 5,593,874；US 5,698,425、US 5,712,135、US 5,789,214、US 5,804,693)。在导入细胞、组织或生物前，在体外以化学方式或以酶方式已合成的dsRNA可以例如通过提取、沉淀、电泳、层析或这些方法的组合从反应混合物中较高或较低程度地得以分离。可以将dsRNA直接导入细胞或在细胞外使用(例如至胞间隙)。
然而，优选以引起dsRNA表达的表达构建体稳定地转化植物。合适的方法如下文中所述。
B)导入反义核酸序列 用于通过“反义”技术阻止特异蛋白质的mRNA累积而抑制该蛋白质的方法可以广泛得到使用并且已经广泛描述，包括用于植物的方法(Sheehy等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858805-8809；US 4,801,100；MoI JN等(1990)FEBS Lett 268(2)427-430)。反义核酸分子与编码待抑制的靶蛋白的细胞mRNA和/或基因组杂交或结合。该过程抑制靶蛋白的转录和/或翻译。杂交可以以常规方式通过形成稳定的双链体，或在基因组DNA情况下，通过反义核酸分子在DNA螺旋的大沟内的特异性相互作用结合基因组DNA双链体而发生。
适用于减少蛋白质活性的反义核酸序列可以使用编码该蛋白质的核酸序列例如在EQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433(或其同系物、类似物、旁向同系物、直向同系物)中所示核酸序列，通过使用Watson和Crick碱基配对原则加以推导。反义核酸序列可以与蛋白质的已转录mRNA的全部互补；它可以限于编码区或它仅由与此mRNA编码序列或非编码序列的部分互补的一种寡核苷酸组成。因此例如，该寡核苷酸可以与包含用于蛋白质翻译启动的核酸区域互补。反义核酸序列可以具有有利的长度，例如5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸，但是它们还可以更长并且包含至少100、200、500、1000、2000或5000个核苷酸。优选15-35个核苷酸长度，更优选15，20，25，30或35个核苷酸长度。反义核酸序列可以使用技术人员已知的方法以重组或化学方式或以酶方式表达。在化学合成时，修饰的核苷酸可以引起由反义核酸序列和有义靶序列形成的双链体增加的物理稳定性。例如可使用材料的实例是硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸，如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、次黄苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲基酯、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。
在又一个优选的实施方案方案中，由SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40并且n＝47至433的序列之一或其同系物、类似物、旁向同系物、直向同系物所编码的蛋白质的表达可以通过与基因的调节区域(例如启动子和/或增强子)互补并在该区域中与DNA双螺旋形成三体结构以致减少基因转录的核苷酸序列得到抑制。已经描述了此类方法(HeleneC(1991)Anticancer Drug Res.6(6)569-84；Helene C等(1992)Ann.NYAcad.Sci.66027-36；Maher LJ(1992)Bioassays 14(12)807-815)。
在又一个实施方案中，反义核酸分子可以是α-异头核酸分子。此类α-异头核酸分子与互补性RNA形成特异的双链杂交体，在此双链体中与常见的β核酸相反，两条链彼此相互呈平行分布(Gaultier等，1987，NeuleicAcids.Res.156625-6641)。此外，该反义核酸分子还包含2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS Lett.215327-330)。
本发明的反义核酸分子通常施用至细胞或在原位生成以至它们与编码具有本发明蛋白质生物学活性的多肽的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或与之结合，并因而抑制该多肽的表达，例如通过抑制转录和/或翻译并且引起前述化合物增加的活性。本发明的反义分子还包含核酸分子，其包含与编码本发明天然存在多肽的核苷酸序列中的调节区域互补的核苷酸序列，例如它的启动子和/或增强子已形成阻止基因在靶细胞内转录的三股螺旋结构，其中天然多肽例如是在序列表中所示的或根据本文中所述的方法进行鉴定的多肽序列。常参见Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)569-84；Helene，C.等(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)807-15。
C)与核酶组合的反义核酸序列的导入 将以上所述的反义策略与核酶方法加以组合是有利的。催化性RNA分子或核酶可以适应于任何靶RNA并且在特定位置上切割磷酸二酯主链，因而功能性地失活靶RNA(Tanner NK(1999)FEMS Microbiol.Rev.23(3)257-275)。核酶本身不受到修饰，但是能够以类似的方式切割其它的靶RNA分子，因此获得了酶的特性。“反义”RNA中核酶序列的引入将这种酶样的RNA切割特性精确赋予这些“反义”RNA并且因此在失活靶RNA时提高“反义”RNA的效率。合适的核酶“反义”RNA分子的制备和用途例如由Haseloff等(1988)Nature 310585-591描述。
以这种方式，核酶[例如“锤头”核酶；Haselhoff和Gerlach(1988)Nature310585-591]可用于催化性地切割待抑制和待阻止翻译的酶的mRNA。核酶技术可以增加反义策略的效率。用于表达核酶以减少特定蛋白质的方法在(EP 0 291 533、EP 0 321 201、EP 0 360 257)中描述。核酶表达还已经描述用于植物细胞(Steinecke P等(1992)EMBO J 11(4)1525-1530；de FeyterR等(1996)Mol.Gen.Genet.250(3)329-338)。合适的靶序列和核酶可以如Steinecke P，Ribozymes，Methods in Cell Biology 50，编者lbraith等，Academic Press，Inc.(1995)，第449-460页所述，通过计算核酶RNA和靶RNA的二级结构以及通过它们的相互作用[Bayley CC等(1992)Plant Mol.Biol.18(2)353-361；Lloyd AM和Davis RW等(1994)Mol.Gen.Genet.242(6)653-657]加以鉴定。例如，可以构建具有与待抑制蛋白质的mRNA互补的区域的四膜虫(Tetrahymena)L-19IVS RNA衍生物(还参见US4,987,071和US 5,116,742)。备选地，此类核酶还可以从多种核酶的文库内通过选择进行鉴定(Bartel，D.和Szostak，J.W.，1993，Science2611411-1418)。
D)导入用于诱导共抑制的(有义)核酸序列 表达处于有义方向的核酸序列可以引起共抑制相应的同源内源性基因。表达与内源性基因具有同源性的有义RNA可以以类似对如下反义方法所述的方式减少或完全消除内源性基因的表达Jorgensen等[(1996)Plant Mol.Biol.31(5)957-973]、Goring等[(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881770-1774]、Smith等[(1990)Mol.Gen.Genet.224447-481]、Napoli等[(1990)Plant Cell 2279-289]或Van der Krol等[(1990)Plant Cell2291-99]。在本上下文中，所导入的构建体可以代表完整或仅部分的待减少的同源基因。本技术对植物的应用已经由例如Napoli等[(1990)The PlantCell 2279-289并且在US5,010,323中描述。
E)导入编码显性失活蛋白的核酸序列 蛋白质的功能或活性还可以通过表达该蛋白质的显性失活变体有效地得以减少。技术人员熟悉用于通过共表达蛋白质的显性失活形式减少该蛋白质的功能或活性的方法[Lagna G和Hemmati-Brivanlou A(1998)CurrentTopics in Developmental Biology 3675-98；Perlmutter RM和Alberola-llaJ(1996)Current Opinion in Immunology 8(2)285-90；SheppardD(1994)American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology 11(1)1-6；Herskowitz I(1987)Nature 329(6136)219-22]。显性失活变体可以通过改变由SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40并且n＝47至433序列之一或其同系物所编码蛋白质的氨基酸得以实现。这种改变可以例如通过计算机辅助的比较(“比对”)加以确定。用于实现显性失活变体的这些改变优选地在核酸序列水平上实施。相应的突变可以例如使用导入所需突变的合适寡核苷酸引物通过PCR介导的体外诱变开展。为此目的，使用技术人员熟悉的方法。例如为此目的可以使用“LA PCR体外诱变试剂盒”(TakaraShuzo，Kyoto)。有可能并且对本领域技术人员而言已知的是缺失或改变功能域，例如可以结合但不活化的TF或其它信号成分。
F)导入针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子或蛋白质结合因子 减少由本发明的SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40并且n＝47至433序列之一或其同系物所编码的蛋白质的表达还可以用特异性DNA结合因子例如锌指转录因子型因子加以实现。这些因子结合至内源性靶因的基因组序列，优选在调节区域内，并引起内源基因的抑制。使用此方法使减少内源性基因表达而无需重组性操作内源性基因的序列成为可能。用于制备相关因子的此类方法在Dreier B等[(2001)J.Biol.Chem.276(31)29466-78和(2000)J.Mol.Biol.303(4)489-502]、Beerli RR等[(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(25)14628-14633；(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(4)1495-1500和(2000)J.Biol.Chem.275(42)32617-32627)]、Segal DJ和Barbas CF[3rd(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4(1)10-39]、Kang JS和KimJS[(2000)J.Biol.Chem.275(12)8742-8748]、Kim JS等[(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(8)3616-3620]、Klug A[(1999)J.Mol.Biol.293(2)215-218]，Tsai SY等[(1998)Adv.Drug Deliv.Rev.30(1-3)23-31]、MappAK等[(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(8)3930-3935]，Sharrocks AD等[(1997)Int.J.Biochem.Cell Biol.29(12)1371-1387]和Zhang L等[(2000)J.Biol.Chem.275(43)33850-33860]中描述。用于在植物中实施此技术的实例已经在WO 01/52620、Ordiz Ml等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第99卷，第20期，13290-13295，2002)或Guan等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第99卷，第20期，13296-13301，2002)中描述。
可以使用基因的任何部分选择这些因子。该节段优选地位于启动子区域内。然而为基因抑制的目的，它还可以位于内含子或编码性外显子区内。技术人员可以从Genbank中通过数据库搜索或从其基因不在Genbank内存在的cDNA开始通过对基因组文库筛选相应的基因组克隆而得到相关节段。
还有可能首先在靶作物中鉴定由SEQ ID NO(2n+2)其中n＝0至40并且n＝47至433的序列之一或其同系物所编码的序列，随后通过使用如上提及的因子找到启动子并减少表达。
技术人员熟悉为如此操作所需要的方法。
此外，导入细胞的因子还可以是本身抑制靶蛋白的那些因子。蛋白质结合性因子例如可以是适配子[Famulok M和Mayer G(1999)Curr.TopMicrobiol.Immunol.243123-36]或者抗体或抗体片段或单链抗体。这些因子的获得已经得到描述并且为技术人员所熟悉。例如，一种胞浆scFv抗体已经用于在遗传修饰的烟草植物中调节植物光敏素A蛋白的活性[Owen M等(1992)Biotechnology(NY)10(7)790-794；Franken E等(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8(4)411-416；Whitelam(1996)Trend Plant Sci.1286-272]。
基因表达还可以通过例如聚酰胺型的特制的低分子量合成性化合物加以抑制[Dervan PB和

RW(1999)Current Opinion in ChemicalBiology 3688-693；Gottesfeld JM等(2000)Gene Expr.9(1-2)77-91]。这些寡聚物由3-(二甲氨基)丙胺、N-甲基-3-羟基吡咯、N-甲基咪唑和N-甲基吡咯单元组成；它们可以以如此方式适配至双链DNA的每一个部分以至它们以序列特异性方式结合至大沟并封闭位于此位置的基因序列的表达。合适的方法已经在Bremer RE等[(2001)Bioorg.Med.Chem.9(8)2093-103]、Ansari AZ等[(2001)Chem.Biol.8(6)583-92]、Gottesfeld JM等[(2001)J.Mol.Biol.309(3)615-29]、Wurtz NR等[(2001)Org.Lett 3(8)1201-3]、Wang CC等[(2001)Bioorg.Med.Chem.9(3)653-7]、Urbach AR和Dervan PB[(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(8)4103-8]以及ChiangSY等[(2000)J.Biol.Chem.275(32)24246-54]中描述。
G)引起RNA降解的病毒核酸序列和病毒表达构建体的导入 失活或下调还可以借助病毒表达系统(Amplikon)[Angell，SM等(1999)Plant J.20(3)357-362]通过在生物有利地在植物中诱导特异性RNA降解而有效地引起。与待抑制的转录物具有同源性的核酸序列借助病毒载体通过这些系统导入植物，这些系统又称做“VIGS”(病毒诱导的基因沉默)。随后，转录可能通过植物的抗病毒防御机制被关闭。合适的技术和方法在Ratcliff F等[(2001)Plant J.25(2)237-45]、Fagard M和VaucheretH[(2000)Plant Mol.Biol.43(2-3)285-93]、Anandalakshmi R等[(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(22)13079-84]和Ruiz MT[(1998)Plant Cell 10(6)937-46]中描述。
H)用于在内源基因上诱导同源重组例如用于产生敲除突变体的构建体的导入。
为产生具有减少的活性的同源重组生物，使用了这样的核酸构建体，其例如包含通过至少一个核苷酸的缺失、添加或替换以这种方式受到修饰以至减少或完全消除功能的内源性基因的至少部分。修饰作用还可以影响基因的调节元件(例如启动子)以至编码序列仍就未受修饰，但是表达(转录和/或翻译)不发生并且得以减少。
在常规同源重组的情形时，修饰的区域在其5′和3′端侧翼分布着长度必须足以允许重组的其它核酸序列。这些核酸序列的长度通常在一百个碱基直至数千个碱基范围内[Thomas KR和Capecchi MR(1987)Cell 51503；Strepp等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(8)4368-4373]。在同源重组情况下，使用本文如下所述的方法将宿主生物例如植物以重组构建体转化，并且使用例如抗生素抗性或杀虫剂抗性选择已成功发生重组的克隆。使用共转化技术，随后抗生素抗性或杀虫剂抗性可以通过开展杂交有利地再次消除。用于在植物中有效的同源重组系统的实例已经在Nat.Biotechnol.2002 Oct；20(10)1030-4、Terada R等Efficient gene targeting byhomologous recombination in rice中公开。
同源重组在高等真核生物尤其在植物中是相当稀有的事件。随机整合至宿主基因组内占优势。一种除去随机整合的序列并因此增加具有正确同源重组的细胞克隆数量的可能手段是使用如US 6,110,736中所述的序列特异性重组系统，通过该系统可以再次缺失非特异性整合的序列，这简化了对通过同源重组已成功整合的事件的选择。多个序列特异性的重组系统可以使用，可以提到的实例是细菌噬菌体P1的Cre/lox系统、来自酵母的FLP/FRT系统、噬菌体Mu的Gin重组酶、来自大肠杆菌的Pin重组酶以及pSR1质粒的R/RS系统。优选细菌噬菌体P1Cre/lox系统和酵母FLP/FRT系统。FLP/FRT和Cre/lox重组酶系统已经应用于植物系统[Odell等(1990)Mol.Gen.Gen et.223369-378]。
I)将突变导入内源基因用于引起功能丧失(例如生成终止子、移码等) 用于减少活性的其它合适方法是将无义突变导入内源基因，例如通过将RNA/DNA寡核苷酸导入植物[Zhu等(2000)Nat.Biotechnol.18(5)555-558]，以及借助例如T-DNA诱变[Koncz等(1992)Plant Mol.Biol.20(5)963-976]、ENU-(N-乙基-N-亚硝基脲)诱变或同源重组[ENU-(N-乙基-N-亚硝基脲)诱变或同源重组[Hohn B和Puchta(1999)H.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 968321-8323]产生敲除突变体。点突变还可以通过又称作“嵌合修复”的DNA-RNA杂交体[Cole-Strauss等(1999)Nucl.Acids Res.27(5)1323-1330；Kmiec(1999)Gene therapy American Scientist 87(3)240-247]产生。突变位点可以是特异靶向性或随机选择的。
如B)至I)项中所述的核酸序列通过细胞或生物的转化/转染在细胞或生物中表达或者通过已知方法，例如A)项中所公开的方法导入细胞或生物。
用于减少活性的其它合适方法是将这样的核酸导入植物细胞，该核酸与选自SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433和/或其同系物的序列的一个或多个核酸序列所编码的基因相互作用。可以自我活化的导入的核酸与所述基因的相互作用通过缺失、倒位或插入即通过使所述基因移码或破坏最终导致失活。
特别地，本发明提供用编码基因的核酸产生转化的植物的方法，其中所述基因的失活或下调在植物中引起与野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性，该方法包括通过突变SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433或其同系物的核酸序列而引起失活或下调。
对于植物转化，可以使用双元载体如pBinAR(Hófgen和Willmitzer，1990 Plant Science 66221-230)。此外，合适的双元载体是例如pBIN19、pBI101、pGPTV或pPZP(Hajukiewicz，P.等，1994，Plant Mol.Biol.，25989-994)。双元载体及它们具体特征的综述在Hellens等，2000，Trends inPlant Science，5446-451中给出。
双元载体的构建可以通过将cDNA以有义方向或反义方向连接至T-DNA开展。位于该cDNA 5′端的植物启动子激活cDNA的转录。聚腺苷酸化序列位于cDNA的3′端。组织特异性表达可以通过使用如上所列的组织特异性启动子实现。此外，可以使用任何其它启动子元件。对于在完整植物中的组成型表达，可以使用CaMV 35S启动子。可以使用信号肽将表达的蛋白质靶向至细胞区室例如质体、线粒体或内质网(Kermode，1996Crit.Rev.Plant Sci.4(15)285-423)。将信号肽以符合cDNA读框方式克隆至5’端以实现融和蛋白的亚细胞定位。此外，应答非生物性胁迫的启动子可以与例如拟南芥菜启动子RD29A一起使用。本领域技术人员认识到所用的启动子应当有效地连接至核酸以至该启动子引起了导致编码多肽的mRNA合成的核酸转录。或者，RNA可以是用于影响相同基因或另一基因的随后表达的反义RNA。
另一种转染方法包括通过电穿孔或农杆菌介导的基因转移将DNA直接转移至发育的花中。农杆菌介导的植物转化可以使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986 Mol.Gen.Genet.204383-396)或LBA4404(Ooms等，Plasmid，1982，715-29；Hoekema等，Nature，1983，303179-180)根瘤农杆菌菌株开展。转化可以通过标准转化和再生技术(Deblaere等，1994 Nucl.Acids.Res.134777-4788；Gelvin和Schilperoort，Plant Molecular Biology Manual，第二版.-DordrechtKluwer AcademicPubl.，1995.-in Sect，Ringbuc Zentrale SignaturBT11-P ISBN0-7923-2731-4；Glick，B R和Thompson，J E，Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology，Boca RatonCRC Press，1993.-360S.，ISBN0-8493-5164-2)开展。例如，油菜可以通过子叶或下胚轴转化作用加以转化(Moloney等，1989 Plant Cell Reports 8238-242；De Block等，1989 PlantPhysiol.91694-701)。用于农杆菌的抗生素以及植物的选择取决于转化所用的双元载体和农杆菌菌株。油菜的选择通常使用作为可选择植物标记的卡那霉素开展。农杆菌介导基因转移至亚麻属植物可以使用例如由Mlynarova等，1994Plant Cell Report 13282-285描述的技术开展。此外，大豆的转化可以使用例如由欧洲专利号0424 047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397 687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770描述的技术开展。玉米的转化可以通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或碳化硅纤维技术(见例如Freeling和Walbot“The maize handbook”Springer VerlagNew York(1993)ISBN 3-540-97826-7)实现。转化玉米的具体实例在美国专利号5,990,387中找到并且转化小麦的具体实例在PCT申请号WO 93/07256中找到。
特别地，确定基因转录水平或活性水平(可得到用于翻译为基因产物的mRNA量的指标)的有用方法是开展RNA印迹(参考文献见例如，Ausubel等，1988 Current Protocols in Molecular Biology，WileyNew York)。此信息至少部分地说明基因的转录程度。细胞总RNA可以从细胞、组织或器官中通过数种方法制备，所述方法在本领域均众所周知，如那些在Bormann，E.R.等，1992 Mol.Microbiol.6317-326中描述的方法。为评估从mRNA中转录的蛋白质的存在或相对量，可以采用标准技术如蛋白质印迹。这些技术对本领域技术人员为众所周知(例如，参见Ausubel等，1988Current Protocols in Molecular Biology，WileyNew York)。也可能使用实时PCR。
本发明还可以与包含编码胁迫相关蛋白的核酸的分离的重组表达载体组合，其中该载体或编码胁迫相关蛋白的核酸分别在宿主细胞内的表达引起与相应的未转化野生型宿主细胞相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。如本文中所用，术语“载体”指能够转运与之连接的另一种核酸分子的核酸分子。一个类型的载体实例是“质粒”，其指可以在其中连接额外的DNA节段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中额外DNA节段可以连接至病毒基因组内。某些载体能够在导入这些载体的宿主细胞内自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合至宿主细胞基因组，并且因此随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。通常，用于DNA重组技术的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明意图包含表达载体的其它形式，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其发挥等效功能。
本发明还包括了包含核酸构建体的植物表达盒，当此植物表达盒表达时，允许通过以上提及的引起增加的胁迫耐性和/或抗性的方法使选自根据SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列的核酸和/或其同系物所编码的基因和/或其部分失活或下调。
植物表达盒优选地包含调节序列，此类调节序列能够在植物细胞中驱动基因表达并且得以有效地连接以至每一序列可以充分实现它的功能，如通过聚腺苷酸化信号终止转录。优选的聚腺苷酸化信号是源自根瘤农杆菌t-DNA如Ti质粒pTiACH5(Gielen等，1984，EMBO J.3835)中称作章鱼碱合酶的基因3或其功能等同物的那些聚腺苷酸化信号，而且在植物中呈功能活性的所有其它终止子也适合。
植物基因表达盒必须有效地接至以时间特异性方式、细胞特异性方式或组织特异性方式赋予基因表达的适宜启动子。优选的启动子是驱动组成型表达的启动子(Benfey等，1989 EMBO J.82195-2202)，如那些衍生自植物病毒如35S CaMV(Franck等，1980 Cell 21285-294)、19S CaMV(还参见美国专利号5352605和PCT专利申请号8402913)的启动子，或植物启动子，如那些在美国专利号4,962,028中所述来自Rubisco小亚基的启动子。
额外有利的调节序列例如在植物启动子如CaMV/35S[Franck等，Cell21(1980)285-294]，PRP1[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、LEB4、nos或在遍在蛋白、油菜籽蛋白或菜豆蛋白启动子内包含。额外有用的植物启动子是马铃薯的胞浆FBP酶启动子或ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)2445-245)、大豆的磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶启动子(还参见Genebank登录号U87999)或如EP-A-O 249 676中所述节特异性启动子。额外特别有利的启动子是种子特异性表达，其可以用于单子叶植物或双子叶植物。在US 5,608,152(来自欧洲油菜的油菜籽蛋白启动子)、WO 98/45461(来自拟南芥菜属的油质蛋白启动子)、US 5,504,200(来自菜豆的菜豆蛋白启动子)，WO 91/13980(来自芥属的Bce4启动子)和Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992233-239(来自豆科植物的LEB4启动子)中描述的启动子在双子叶植物中有用。如下启动子例如在单子叶植物中有用，如来自大麦的Ipt2或Ipt1启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或来自大麦的大麦醇溶蛋白启动子。其它有用启动子在WO99/16890中描述。
原则上，可以失活或下调所有具有它们的调节序列的天然启动子，如以上提及那些天然启动子以便减少靶向的蛋白质的产生水平。
构建体还可以包含待插入至生物并例如参与胁迫抗性的其它基因，即在失活某些基因或将失活的基因引入它们的位置后，有可能导入与产生积极地增加胁迫抗性或抗性的蛋白质有关的受欢迎基因。因此在宿主生物中插入并表达调节性基因如诱导剂基因、阻遏物基因或通过其酶活性干预生物合成途径中-个或多个或全部基因的调节的酶基因是可行并且有利的。这些基因可以在来源上是异源的或同源的。插入的基因可以具有它们自己的启动子或处在与序列SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及其中n＝47至433或其同系物相同的启动子的控制下。
此外，为了表达存在的其它基因，基因构建体有利地包含根据已选择的宿主生物和基因加以选择的用于最佳表达的3′和/或5′末端调节序列以增强表达。
这些调节序列用于实现如上所述的基因特异性表达和蛋白质表达。根据宿主生物，这可以意指例如基因仅在诱导后表达或过量表达或者基因立即表达和/或过量表达。
调节序列或因子还可以优选有益地影响导入的基因的表达并且因此提高表达。有可能以这种方式通过使用强的转录信号如启动子和/或增强子有利地在转录水平增强调节元件。然而，除此此外，还有可能通过例如改善mRNA的稳定性而增强翻译。
用于植物基因表达盒中的其它优选序列是指导基因产物进入适宜细胞区室如液泡、细胞核、所有类型的质粒如淀粉体、叶绿体、细胞外空间、线粒体、色质体、内质网、油体、过氧化物酶体和植物细胞其它区室所必需的靶向序列(综述参见Kermode，1996 Crit.Rev.Plant Sci.15(4)285-423及其中引用的参考文献)。
表1植物中组织特异性启动子和胁迫诱导型启动子的实例 选择标志系统，如AHAS标志或其它启动子例如超级启动子(Ni等，Plant Journal 7，1995661-676)、遍在蛋白启动子(CaIMs等，J.Biol.Chem.，1990，26512486-12493；US 5,510,474；US 6,020,190；Kawalleck等，Plant.Molecular Biology，1993，21673-684)或10S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)类似地对于与本发明的组合有用并且对本领域技术人员为已知。
特别地，本发明描述了比较特定特性或性状、评估整体外观或比较由于失活或下调基因而改变的代谢活性以设计胁迫耐性和/或抗性即干旱、盐和/或寒冷耐性和/或抗性的植物的用途。该策略已经在本文中演示用于拟南芥菜，但其应用不限于这些植物。因此，本发明提供转化的植物，其含有一个或多个已失活或下调的选自SEQ ID NO(2n+1)其中n＝0至40以及n＝47至433的序列或其同系物的(胁迫相关蛋白编码)基因并且具有胁迫耐性和/或抗性，其中(环境性)胁迫是干旱、增加的盐或者降低或升高的温度，但是本申请不限于这些不利的环境。例如可以包括对其它不利条件如热、空气污染、重金属盒化学毒物的保护。在特别优选的实施方案中，环境胁迫是干旱。
在胁迫条件下生长修饰的植物并且随后筛选和分析生长特征和/或代谢活性可评估植物中遗传性修饰对胁迫耐性和/或抗性的影响。此类分析技术对于本领域技术人员众所周知。它们包括分析筛选后(Rómpp LexikonBiotechnologie，Stuttgart/New YorkGeorg Thieme Verlag 1992，“Screening”第701页)干重、湿重、蛋白质合成、糖合成、脂类合成、蒸发蒸腾速率、植物和/或作物整体产量、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸速率、光合作用速率等(Applications of HPLC in Biochemistry inLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第17卷；Rehm等，1993 Biotechnology，第3卷，第三章Product recovery andpurification，第469-714页，VCHWeinheim；Belter，P.A.等，1988Bioseparationsdownstream processing for biotechnology，John Wiley andSons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.，1992 Recovery processes forbiological materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.，1988 Biochemical separations，inUlmann′s Encyclopedia of IndustrialChemistry，第B3卷，第11章，第1-27页，VCHWeinheim；和Dechow，FJ.(1989)Separation and purification Techniques in biotechnology，NoyesPublications)。
本发明的方法可以通过筛选植物细胞的特定特性或性状、评估整体外观、分析生长特性或筛选与非胁迫条件相比允许改变的代谢活性，用于在植物细胞或植物中探测环境性胁迫，这允许选择具有抗性或耐性的植物或植物细胞并且还在可见到症状前和损害严重前提供对植物或植物细胞中应激的检测。
通过筛选与非胁迫条件相比在胁迫条件下的植物细胞的特定特性或性状、评估整体外观、分析生长特性或筛选对环境胁迫增加的耐性和/或抗性并且选择具有对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的那些植物细胞用于进一步繁殖，本发明的方法还允许将植物细胞或植物向对环境胁迫增加的耐性和/或抗性方向育种。设计本发明一个或多个胁迫相关基因还可以产生具有改变活性的间接影响植物胁迫反应和/或胁迫抗性的胁迫相关性蛋白。例如，代谢的正常生物化学过程导致可以活跃干扰这些相同代谢过程的多种产物(例如过氧化氢和其它活性氧类)产生(例如已知过氧亚硝酸盐使酪氨酸侧链硝化，因此使某些在活性位点内具有酪氨酸的酶失活(Groves，J.T.，1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3(2)226-235)。通过优化本发明的一个或多个胁迫相关基因的失活或下调，有可能改良引起细胞更高胁迫耐性和/或抗性的代谢活性。
此外，可以以本文中所公开的序列或其片段为靶标旨在多种其它植物细胞的基因组内产生敲除突变体(Girke，T.，1998 The Plant Journal1539-48)。得到的敲除细胞随后可以就它们耐受多种胁迫条件的能力或潜能、它们对胁迫条件的反应以及突变对表型和/或基因型的影响进行评估。对于基因失活的其它方法，参见美国专利号6004804“Non-ChimericMutational Vectors”以及Puttaraju等，1999，Spliceosome-mediated RNAtrans-splicing as a tool for gene therapy，Nature Biotechnology 17246-252。本申请通篇范围内，参考多种公开出版物。所有这些公开出版物和在这些公开出版物中引用的全部参考文献的内容在本文中作为参考完整引入本申请以更充分地描述本发明所属的技术领域的状态。
本发明不限定于特定的核酸、特定的多肽、特定的细胞类型、特定的宿主细胞、特定的条件或特定的方法等，因为如此的方式当然可以改变，并且众多的调整和因其而产生的变化对于本领域技术人员显而易见。还应当理解本文中所用术语的目的仅在于描述特定实施方案并且不是限制性的。
还应当理解如前所述涉及本发明优选的实施方案并且众多改变可以在其中产生而不脱离本发明的范围。本发明通过如下实施例进一步说明，这些实施例无论如何不应当解释为对本发明的范围施加限制。相反，应当清楚地理解可以求助于多种其它实施方案、改进及其等效物，在阅读本文的描述后，对本领域技术人员而言，它们可以不言自明而不脱离本发明的精神本发明和/或所附带权利要求书的范围。
实施例 通过失活或下调胁迫相关基因设计胁迫耐受性拟南芥菜属植物 拟南芥菜的转化 载体制备 双元载体基于修饰的pPZP双元载体主链(包含用于细菌选择的卡那霉素基因；Hajukiewicz，P.等，1994，Plant Mol.Biol.，25989-994)以及受mas2′1′和mas271f启动子(Velten等，1984，EMBO J.3，2723-2730；Mengiste，Amedeo和Paszkowski，1997，Plant J.，12，945-948)驱动的选择标志bar基因(De Block等，1987，EMBO J.6，2513-2518)构建。完整载体(图2)和质粒在附件中显示。
此外，对于插入性诱变可用的其它双元载体实例是pBIN19、pBI101、pBinAR或pGPTV。双元载体及它们具体特征的综述在Hellens等，2000，Trends in Plant Science，5446-451和在Guerineau F.，Mullineau×P.，1993，Plant transformation and expression vectors in plant molecular biology，LABFAX Series，(Croy R.R.D编辑)，第121-127页Bios ScientificPublishers，Oxford中给出。
农杆菌的转化 使用热休克方案或电穿孔方案将质粒转化至根瘤农杆菌(GV3101pMP90；Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204383-396)。转化的集落在28℃在YEB培养基上生长并通过相应抗生素(Rif/Gent/Km)选择2日。将这些农杆菌培养物用于植物转化。
将拟南芥菜生态型C24根据标准条件((Bechtold，N.，Ellis，J.，Pelletier，G.1993.In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration ofArabidopsis thaliana plants，C.R.Acad.Sci.Paris 3161194-1199；Bent，A.F.，Clough，J.C，1998；Floral dipa simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana，Plant J.16735-743)生长并转化。
转化植物(F1)使用它们各自的抗性标志加以选择。在

-抗性情况下，对小植物以2至3日的间隔用0.02％

喷雾并且允许转化的植物结籽。50-100株幼苗(F2)再次接受标志选择，在

-抗性情况下，对小植物连续4日以0.1％

喷雾。选择对单一抗性基因座分离的植物(抗性幼苗对敏感幼苗是大约3∶1)用于进一步分析。从这些株系中，再次允许抗性幼苗(F2)中的三株幼苗结籽并通过将它们的种子(F3)在含有选择剂(

15mg/L草铵膦，Pestanal，Riedel de Haen，Seelze，德国)的琼脂培养基上体外萌发测试纯合性。将产生几乎100％抗性后代(F3)的那些F2株系视为纯合体并且用于功能型分析。
胁迫抗性的测量 将转基因的拟南芥菜植物在生长室(York Industriekalte GmbH，Mannheim，德国)内在含有4∶1(v/v)土壤和石英砂混合物的花盆内单独生长。为了诱导萌发，将播下的种子在4℃在黑暗中培养3日。标准生长条件是16小时光照和8小时黑暗的光周期、20℃、60％相对湿度以及光流密度150μE。植物每日浇水直至它们大约3周龄为止，此时干旱通过停止浇水产生。与此同时，将相对湿度以每隔一天10％递减量降至20％。在停止浇水大约12日后，大多数植物显示损伤的视观症状，如萎蔫和叶变黄，因而将耐受或抗性植物鉴定为视观饱满并呈现健康的绿颜色。将植物与野生型植物和临近的植物相比连续3-5日，就干旱损伤症状进行评分。
在一个实验(表2)中，将已证实耐受的每一株系，即在前述实验中评估为耐受或抗性的那些株系的至少4株但通常20-25株复制体生长并如前进行处理。在该实验中，测定野生型对照在视观上已经死亡后干旱幸存的平均天数和最大天数。此外，使用Mini-PAM(Heinz Walz GmbH，Effeltrich，德国)在受胁迫植物和未受胁迫植物中开展叶绿素荧光的测量(表3)。
在干旱耐性实验(表2)中，试验中的对照(未转化的拟南芥菜)和大多数的已转化株系显示极端的胁迫视观症状，包括坏死和细胞死亡。数株已转化的植物如它们的饱满外观和维持绿色所示仍有活性。
(在非黑暗适应的植物中)光合产量的叶绿素荧光量值证实14日的干旱胁迫完全抑制对照植物中的光合作用。在大多数情况下，转化的株系维持更长时间的光合功能(表3)。
对已选择的胁迫抗性株系的分析 由于将株系对单一插入位点和抗性标志的纯合状态加以预先选择，预期通过T-DNA的整合破坏(或突变)单个基因将引起胁迫-抗性表型。选择显示一致表型的株系用于分子分析。
基因组DNA从来自这些株系的大约100mg叶组织中使用标准方法(来自Qiagen，Hilden，Germany的离心柱或来自Amersham Biosciences，Freiburg，Germany的Nucleon Phytopure试剂盒)纯化。T-DNA中插入侧翼的扩增使用两种不同方法完成。或者使用T-DNA特异性引物LB1(5′-TGA CGC CAT TTC GCC TTT TCA-3′；SEQ ID NO83)用于第一轮PCR以及LB2引物(5′-CAG AAA TGG ATA AAT AGC CTT GCT TCC-3′；SEQ ID NO84)或RB4-2因为(5′-AGC TGG CGT AAT AGC GAAGAG-3′；SEQ ID NO85)用于第二轮PCR，根据Spertini D，Beliveau C.和Bellemare G.，1999，Biotechniques，27，308-314的衔接头PCR方法得以实施。备选地，实施TAIL-PCR(Liu Y-G，Mitsukawa N，Oosumi T和Whittier RF，1995，Plant J.8，457-463)。在此例中，在第一轮PCR中将LB1(5′-TGA CGC CAT TTC GCC TTT TCA-3′SEQ ID NO83)或RB1-2(5′-CAA CTT AAT CGC CTT GCA GCA CA-3′；SEQ ID NO86)，在第二轮PCR中将LB2(5′-CAG AAA TGG ATA AAT AGC CTT GCTTCC-3′SEQ ID NO84)或RB4-2(5′-AGC TGG CGT AAT AGC GAAGAG-3′SEQ ID NO87)并且在最后一轮PCR中将LB3(5′-CCA ATACAT TAC ACT AGC ATC TG-3′；SEQ ID NO88)或RB5(5′-AAT GCTAGA GCA GCT TGA-3′；SEQ ID NO89)分别用作针对T-DNA左边界或右边界的T-DNA特异性引物。
适宜的PCR产物在琼脂糖凝胶上鉴定并且使用柱和标准方法(Qiagen，Hilden，德国)纯化。PCR产物以位于朝向扩增所用引物的边界的额外T-DNA-特异性引物测序。对于含有左边界序列的PCR产物，将引物LBseq(5′-CAA TAC ATT ACA CTA GCA TCT G-3′；SEQ ID NO90)用于测序反应，并且对于含有右边界序列的PCR产物，将引物RBseq(5′-AGA GGC CCG CAC CGA TCG-3′；SEQ ID NO91)用于测序反应。使用blast算法(Altschul等，1990.J MoI Biol，215403-410)，将得到的序列与从Genbank中可得到的拟南芥菜属基因组序列比较。
用于鉴定基因组位点的PCR产物的详细内容在表4中给出。得到显示的是拟南芥菜属基因组中已鉴定的已注释可读框、所得到PCR产物的估计大小(碱基对)、用于实现扩增的T-DNA边界(LB左边界、RB右边界)、产生所示PCR产物的方法(解释见上文)、衔接头PCR情况时的相应限制性酶以及TAIL PCR情况时的简并引物。通常，简并引物ADP3(5′-WGTGNAGWANCANAGA-3′；SEQ ID NO92)，ADP6(5’-AGWGNAGWANCANAGA-3′；SEQ ID NO93)和ADP8(5’-NTGCGASWGANWAGAA-3’；SEQ ID NO94)与表4中给出的另一个已知引物一起使用。
每一情况下，插入位点的鉴定使用T-DNA特异性引物和从接近插入侧的已鉴定的基因组位点中推导出的引物通过对照PCR证实。使用这些引物对从插入株系中扩增出预期大小的PCR产物证实已鉴定的基因座通过T-DNA整合受到破坏。
表2-5 表2在干旱胁迫施加至3周龄的植物后已转化的拟南芥菜的存活持续时间。干旱耐性以天为间隔目视测量。存活持续时间是比野生型对照存活更久的全部植物的平均数。最大持续时间是比野生型对照存活更久的任何单个的转化植物的最长时间。
表3在干旱胁迫施加至3周龄的植物后通过叶绿素荧光测量的已转化拟南芥菜的光合产量。测量在停止浇水后定期开展并且显示为光合产量(Y)。值是5个随机选择的植物的平均值。将这些值与作为参照使用的MC24株比较。
表4用于鉴定下调的基因组基因座的PCR产物的详细内容。
用于抑制本发明基因的反义构建体的构建 使用基因特异性引物对通过PCR扩增SEQ ID NO95的片段或本发明的其它核酸。为了能够克隆PCR产物，可将限制性位点加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至引物以能够进行重组反应。将PCR片段克隆或重组至双元载体，优选地以如此方式处于强的组成型启动子、组织特异性启动子或发育特异性启动子的控制下，以至启动子的方向与具有其原始基因组位置的基因的方向相反。
SEQ ID NO95的片段的扩增使用已经从基因序列中推导的寡核苷酸实施 Seq1antifw5′-atagaattcatgcttcgactgatcgacga-3′(SEQ ID NO869) Seq1antirev5′-atagtcgaccaccgggcacattgagcaat-3′(SEQ ID NO870) 寡核苷酸已经在水中溶解以产生20μM的浓度。将RNA提取(Qiagen)和cDNA产生(Invitrogen)的标准方案用于从来自欧洲油菜、大豆、玉米或稻的不同组织中分离RNA的方法和它们各自的cDNA合成。PCR反应含有5μl Thermal Ace缓冲液(Invitrogen)、0.4μl dNTPs(每种25mM)(Invitrogen)、0.5μl引物Seq1antifw、0.5μl引物Seq1antirev、0.5μlThermalAce(Invitrogen)、0.5μl cDNA和42.6μl水。PCR在MJ-CyclerTetrad(BioZym)上以如下程序开展 4分钟94℃，随后1分钟94℃、1分钟57℃、1分钟72℃共30循环，随后10分钟72℃以及冷却至25℃。
PCR产物使用来自Qiagen的试剂盒纯化。随后将此DNA以EcoRI/SalI(NEB)在37℃消化过夜。随后将此片段克隆至已经用EcoRI/SalI消化的载体BaseVectorCorn(见


图1)。将得到的构建体称作BaseVectorCorn_antiSeq1。从该载体中，将包含ScBV启动子、Seq1的反义片段和NOS终止子的盒使用限制性酶AscI/PacI切下并且连接至载体TrafoVectorCorn(见图2)，产生载体TrafoVectorCorn_antiSeq1(图3)。
用于抑制本发明基因的RNAi构建体的构建 SEQ ID NO95的两个片段通过PCR扩增。为了能够克隆PCR产物，可将限制性位点添加加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至引物以能够进行重组反应。将PCR片段克隆或重组至双元载体，优选地以如此方式处于强的组成型启动子、组织特异性启动子或发育特异性启动子的控制下，以至片段在载体中以反向重复导入两次，重复序列之间通过DNA间隔序列分开。
扩增SEQ ID NO95的片段使用已经从基因序列中推导出的寡核苷酸实施 Seq1rifw15′-atagtcgacatgcttcgactgatcgacga-3′(SEQ ID NO871) Seq1rirev15′-atagaattccaccgggcacattgagcaat-3′(SEQ ID NO872) Seq1rifw25′-atacccgggatgcttcgactgatcgacga-3′(SEQ ID NO873) Seq1rirev25′-atatctagacaccgggcacattgagcaat-3′(SEQ ID NO874) 寡核苷酸已经溶解于水中以产生20μM的浓度。PCR反应含有5μlThermalAce缓冲液(Invitrogen)、0.4μldNTP(每种各25mM)(Invitrogen)、0.5μl引物Seq1rifw1、0.5μl引物Seq1rirev1、0.5μlThermalAce(Invitrogen)、0.5μlcDNA和42.6μl水以及5μlThermalAce缓冲液(Invitrogen)、0.4μldNTP(每种各25mM)(Invitrogen)、0.5μl引物Seq1rifw2、0.5μl引物Seq1rirev2、0.5μlThermalAce(Invitrogen)、0.5μlcDNA和42.6μl水。PCR在MJ-Cycler Tetrad(BioZym)上以如下程序开展 4分钟94℃，随后1分钟94℃、1分钟57℃、1分钟72℃共30循环，随后10分钟72℃以及冷却至25℃。
PCR产物使用来自Qiagen的试剂盒纯化。随后将DNA以SalI/EcoRI在37℃消化过夜并且以SmaI在28℃消化6小时，随后以XbaI在37℃消化过夜。随后将SmaI/XbaI消化的片段克隆至已经用SmaI/XbaI消化的载体BaseVectorCorn_Spacer(见图4)。将得到的构建体以EcoRI/SalI消化并且将此EcoRI/SalI片段连接至该载体。随后将包含ScBV启动子、由间隔序列分隔的Seq1的反向重复序列和NOS终止子的表达盒使用限制性酶AscI/PacI切下并且连接至载体TrafoVectorCorn(见图2)，产生此载体。
用于抑制本发明基因的共抑制构建体的构建 SEQ ID NO95的片段通过PCR扩增。为了能够克隆PCR产物，可将限制性位点加至用于扩增的引物上。备选地，可以将重组位点添加至引物以使重组反应发生。将PCR片段克隆或重组至双元载体，优选地以如此方式处于强的组成型启动子、组织特异性启动子或发育特异性启动子的控制下，以至启动子的方向与具有其原始基因组位置的基因的方向相同。
SEQ ID NO95的片段的扩增使用已从基因序列中推导的寡核苷酸实施 Seq1cofw5′-atagtcgacatgcttcgactgatcgacga-3′(SEQ ID NO875) Seq1corev5′-atagaattcccaccgggcacattgagcaat-3′(SEQ ID NO876) 寡核苷酸已经溶解于水中以产生20μM的浓度。PCR反应含有5μlThermal Ace缓冲液(Invitrogen)、0.4μl dNTP(每种25mM)(Invitrogen)、0.5μl引物Seq1cofw、0.5μl引物Seq1corev、0.5μl ThermalAce(Invitrogen)、0.5μl cDNA和42.6μl水。PCR在MJ-Cycler Tetrad(BioZym)上以如下程序开展 4分钟94℃，随后1分钟94℃、1分钟57℃、1分钟72℃共30循环，随后10分钟72℃以及冷却至25℃。
PCR产物使用来自Qiagen的试剂盒纯化。随后将DNA以EcoRI/SalI(NEB)在37℃消化过夜。随后将片段克隆至已经用EcoRI/SalI消化的载体BaseVectorCorn(见
图1)。将得到的构建体称作BaseVectorCorn_coSeq1。从该载体中，将包含ScBV启动子、Seq1的共抑制片段和NOS终止子的盒使用限制性酶AscI/PacI切下并且连接至载体TrafoVectorCorn(见图2)，产生载体TrafoVectorCorn_coSeq1(图5)。
通过在玉米中减少来自玉米的胁迫相关基因的表达设计胁迫耐受性玉米植物 玉米(Zea mays L.)的转化根据改良的Ishida等(1996.Nature Biotech14745-50)所述方法开展。转化在玉米中呈基因型依赖并且仅特定基因型可操作用于转化和再生。杂交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材料的良好来源(Fromm等1990Biotech8833-839)，但是也可以成功使用其它基因型。谷穗在授粉后大约11天(DAP)自玉米植物收获，此时未成熟的胚长度是大约1至1.2mm。将未成熟的胚与携带“超级二元”载体的根瘤农杆菌共培养并且转基因植物通过器官发生作用得以恢复。日本烟草(Japan Tobacco)的超级双元载体系统在WO专利WO94/00977和WO95/06722中描述。载体可如所述进行构建。可以使用多种选择标志基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(美国专利6025541)。类似地，多种启动子可以用于提供如对基因抑制构建体例如共抑制构建体或反义构建体或RNAi构建体的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供共抑制构建体或反义构建体或RNAi构建体的组成型表达。
将切断的胚在愈伤组织诱导培养基，随后玉米再生培养基上生长，所述培养基含有咪唑啉酮作为选择剂。将培养平板在光照下25℃培养2-3周，或培养至幼枝发育。将来自每一胚的绿色幼枝转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周直至根发育。将生根的幼枝移植至温室中的土壤内。T1种子从表现耐受咪唑啉酮除草剂并对转基因呈PCR阳性的植物中产生。
随后根据标准方法如停止浇水方法，与野生型植物或模拟转染植物相比评估T1转基因植物的改善的胁迫抗性以及该植物的性能。停止给幼苗浇水直至3周时间，此时植物和土壤脱水。在停止浇水后的不同时间上，恢复正常的浇水计划。在恢复浇水后一周，测量叶身的长度和幼苗的鲜重和干重。在同等程度的干旱胁迫下，耐受植物能够恢复正常生长而易感植物已经死亡或遭受明显损害，产生较短的叶和更少的干物质。具有T-DNA单个位点插入的T1代可以对转基因以1∶2∶1比率分离。那些含有一个或两个拷贝转基因的子代(3/4的子代)耐受咪唑啉酮除草剂，并比缺乏转基因的那些子代表现更强的干旱胁迫耐性。耐受植物具有更高的种子产量，维持其气孔器并在渗透势和脯氨酸水平上显示仅轻微改变，而易感的非转基因对照植物关闭其气孔并表现出增加的渗透势和脯氨酸水平。纯合T2植物表现相似的表型。纯合的转基因植物和非转基因植物的杂交植物(F1子代)也表现出提高的环境胁迫耐性。
通过在大豆中减少来自大豆的胁迫相关基因的表达设计胁迫耐受性大豆植物 为了减少胁迫相关性大豆基因在大豆中的表达，以类似于前述实施例中所述的方式构建反义构建体、共抑制构建体或RNAi构建体。大豆可根据如下对Texas A&M专利US 5,164,310中所述方法的修改进行转化。数个商业大豆变种可通过此方法用于转化。通常使用栽培品种Jack(可从Illinois种子基金获得)用于转化。种子通过浸泡在70％(v/v)乙醇中6分钟并且在补加0.1％(v/v)Tween的25％商业漂白剂(NaOCl)中20分钟，随后用无菌的双重蒸馏水淋洗4次灭菌。7日龄的幼苗通过从每株幼苗除去胚根、下胚轴和一片子叶繁殖。随后，将带一片子叶的上胚轴转移至培养皿内新鲜的发芽培养基上并在25℃16小时光照期(大约100μE-m-2s-1)培育3周。叶节(大约4mm长)自3-4周龄的植物中切下。将叶节切断并在农杆菌LBA4404培养物中温育。
已经描述了用于植物转化的众多不同双元载体系统(例如An，G.inAgrobacterium Protocols.Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA和MR Davey编辑.Humana Press，Totowa，NewJersey)并且可以用于携带反义构建体、共抑制构建体或RNAi构建体。许多系统基于Bevan描述的载体pBIN19(Nucleic Acid Research.1984.128711-8721)，该载体包含在两侧分布有来自根瘤农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两种基因组成-具有合适启动子的选择标志基因和调节cDNA或反义片段或RNAi构建体的转录的植物启动子。如上所述，可以使用多种选择标志基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥菜基因(美国专利5767366和6225105)。类似地，多种启动子调节性状基因还可以用于调节共抑制构建体、RNAi构建体或反义构建体以提供组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供基因抑制构建体的组成型表达。
在共培养处理后，将外植体洗涤并转移至补加500mg/L特美汀的选择培养基。将幼枝切断并置于幼枝延伸培养基内。在移植至土壤前，将长超过1cm的幼枝置于生根培养基持续两周至四周。
原代转基因植物(To)的样本通过PCR分析以证实T-DNA的存在。这些结果通过DNA印迹杂交证实，其中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移到具有正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR制备洋地黄毒苷标记探针并根据制造商建议使用。
随后根据标准方法或如下所述评估转基因植物的改善的胁迫抗性。停止给幼苗浇水直至3周时间，此时植物和土壤脱水。在停止浇水后的不同时间上，恢复正常的浇水计划。在恢复浇水后一周，测量叶身的长度和幼苗的鲜重和干重。在同等程度的干旱胁迫下，耐受植物能够恢复正常生长而易感植物已经死亡或遭受明显损害，产生较短的叶和更少的干物质。
来自大豆的胁迫相关基因的表达减少的胁迫耐受性大豆植物具有更高的种子产量，维持其气孔器并在渗透势和脯氨酸水平上显示仅轻微改变，而易感的非转基因对照植物关闭其气孔并表现出增加的渗透势和脯氨酸水平。
表现盐度耐性或寒冷耐性的转基因植物比易感植物具有更高的种子产量、光合作用和干物质产量。
通过在欧洲油菜中减少来自欧洲油菜的胁迫相关基因的表达设计胁迫耐受性油菜籽/卡诺拉油菜植物 将5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17183-188)转化。用于转化的标准品种是商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)，但是还可以使用其它品种。将携带含有如以上实施例中所述的反义构建体、共抑制构建体或RNAi构建体的双元载体的根瘤农杆菌LBA4404用于卡诺拉油菜转化。已经描述用于植物转化的众多不同双元载体系统(例如An，G.in AgrobacteriumProtocols.Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，GartlandKMA和MR Davey编辑.Humana Press，Totowa，New Jersey)。许多系统基于Bevan描述的载体pBIN19(Nucleic Acid Research.1984.128711-8721)，该载体包含在两侧分布有来自根瘤农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒包含至少两种基因-具有合适启动子的选择标志基因和调节用于cDNA或其片段或反义片段或RNAi构建体的共抑制的植物启动子。可以使用多种选择标志基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥菜基因(美国专利5,767,366和US 6,225,105)。类似地，多种启动子还可以用于调节旨在减少基因表达的构建体以提供对转录的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)提供基因抑制构建体的组成型表达。
将卡诺拉油菜种子在70％乙醇浸泡2分钟并且在含一滴Tween-20的30％Clorox浸泡10分钟，随后用无菌蒸馏水淋洗三次灭菌。将种子在无激素的含有1％蔗糖、0.7％植物琼脂的半浓缩MS培养基上光照16小时在23℃体外发芽5天。将附着子叶的子叶柄外植体自体外的幼苗中切下，并通过将子叶柄外植体切口端浸入细菌混悬液用农杆菌接种。随后将此外植体在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上光照16小时在23℃培养2天。与农杆菌共培养两天后，将子叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7天并随后转移至含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上直至幼枝再生。当幼枝长度是5-10mm时，将它们切下并转移至幼枝延伸培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度是大约2cm的幼枝转移至生根培养基(MS0)以诱导根。
原代转基因植物(T0)的样本通过PCR分析以证实T-DNA的存在。这些结果通过DNA印迹杂交证实，其中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移至具有正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR制备洋地黄毒苷标记探针并根据制造商建议使用。
随后根据标准方法或如下所述评估转基因植物的改善的胁迫抗性。停止给幼苗浇水直至3周时间，此时植物和土壤脱水。在停止浇水后的不同时间上，恢复正常的浇水计划。在恢复浇水后一周，测量叶身的长度和幼苗的鲜重和干重。在同等程度的干旱胁迫下，耐受植物能够恢复正常生长而易感植物已经死亡或遭受明显损害，产生较短的叶和更少的干物质。发现来自欧洲油菜的胁迫相关基因的表达减少的转基因油菜籽/卡诺拉油菜与非转基因的对照植物相比较对环境胁迫更耐受。耐受植物具有更高的种子产量，维持其气孔器并在渗透势和脯氨酸水平上显示仅轻微改变，而易感的非转基因对照植物关闭其气孔并表现出增加的渗透势和脯氨酸水平。具有盐度耐性或寒冷耐性的植物与易感植物相比具有更高的种子产量、光合作用和干物质产量。
相同基因和异源基因的鉴定 基因序列可用于鉴定来自cDNA文库或基因组文库的相同基因或异源基因。相同基因(例如全长cDNA克隆)可以使用例如cDNA文库通过核酸杂交加以分离。根据目的基因的丰度，将100,000至1,000,000个重组细菌噬菌体涂布并转移至尼龙膜。在用碱变性后，将DNA例如通过UV交联连接作用固定在膜上。杂交在高严格条件下实施。在含水溶液中，将杂交和洗涤在1M NaCl的离子强度并在68℃温度上开展。杂交探针通过例如放射性(32P)切口转录标记(High Prime，Roche，Mannheim，德国)产生。信号通过放射自显影法检测。相关但不完全相同的部分相同基因或部分异源基因可以用类似于如上所述方法的方式使用低严格的杂交条件和洗涤条件鉴定。对于在含水环境中的杂交，离子强度通常保持在1M NaCl而温度逐步从68℃降低至42℃。
仅在明显的结构域(例如10-20个氨基酸)内具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列的分离可以通过使用合成的放射标记寡核苷酸探针实施。放射标记的寡核苷酸通过用T4多核苷酸激酶磷酸化两个互补寡核苷酸的5’引发末端加以制备。双链多联体随后通过例如切口转录进行放射标记。杂交通常使用高浓度寡核苷酸在低严格条件下开展。
寡核苷酸杂交溶液 6×SSC 0.01M磷酸钠 1mM EDTA(pH8) 0.5％SDS 100μg/ml变性鲑精DNA 0.1％干脱脂乳。
在杂交期间，将温度逐步降低至低于预计的寡核苷酸Tm 5-10℃或降低至室温，随后是洗涤步骤和放射自显影。洗涤使用4×SSC以如3洗涤步骤的低严格性开展。其它细节由Sambrook，J.等，1989，“Molecular CloningA Laboratory Manual，”Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel，F.M.等，1994，“Current Protocols in Molecular Biology，”John Wiley &Sons描述。
用抗体通过筛选表达文库鉴定相同基因或同源基因 cDNA克隆可以用于例如在细菌(例如Qiagen QIAexpress pQE系统)中产生重组多肽。重组多肽随后通常通过Ni-NTA亲和层析(Qiagen)得到亲和纯化。随后，重组多肽例如通过使用对兔免疫的标准技术产生特异性抗体。抗体如Gu等，1994，Biotechniques 17257-262所述使用经重组抗原饱和的Ni-NTA柱加以亲和纯化。抗体随后可以用于通过免疫学筛选法筛选表达cDNA文库以鉴定相同基因或异源基因(Sambrook，J.等，1989，“Molecular CloningA Laboratory Manual，”Cold Spring HarborLaboratory Press or Ausubel，F.M.等，1994，“Current Protocols inMolecular Biology，”John Wiley & Sons)。
通过人工转录因子减少本发明基因的表达 本发明基因及其在其它物种中的同源ORF还可以通过导入合成的特异性阻遏物受到下调。为此目的，构建了编码嵌合锌指蛋白的基因，该嵌合锌指蛋白结合至目的基因或其在其它生物中的同系物的调节区域或编码区内的特定区域。人工锌指蛋白包含如由锌指和任选的EAR样抑制结构域组成的特异性DNA结合结构域(Hiratsu等，2003.Plant J.34(5)，733-739Dominant repression of target genes by chimeric repressors that includethe EAR motif，a repression domain，in Arabidopsis.) 此嵌合阻遏物例如在植物中的表达随后引起靶基因的特异性抑制或者该靶基因的同系物在其它植物物种内的特异性抑制，导致增加的代谢物生产。关于设计和构建特异性锌指结构域的实验细节可以如所述开展，或如WO 01/52620或Ordiz MI(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，第99卷，第20期，13290)或Guan(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，第99卷，第20期，13296)所述开展。
通过同源重组敲除本发明的基因 在随机诱变群体中鉴定本发明基因中的突变 a)在化学性或放射作用突变的群体内 产生化学性或放射作用突变的群体是常用技术并且技术人员已知。方法由Koorneef等1982及其中引文并且由Lightner和Caspar在“Methodsin Molecular Biology”第82卷内描述。这些技术通常诱导可以使用方法如TILLIN法G(Colbert等2001)在任何已知基因内鉴定的点突变。
b)通过反向遗传学在T-DNA或转座子突变的群体内 鉴定目的基因中插入突变体的反向遗传策略已经描述用于多种情况，尤其用于拟南芥菜属，例如Krysan等，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)；Sessions等，2002(Plant Cell 2002，14，2985-2994)；Young等，2001，(Plant Physiol.2001，125，513-518)；Koprek等，2000(Plant J.2000，24，253-263)；Jeon等，2000(Plant J.2000，22，561-570)；Tissier等，1999(PlantCell 1999，11，1841-1852)；Speulmann等，1999(Plant Cell 1999，11，1853-1866)。此策略还用于作物的插入性突变体。简而言之，收获来自经T-DNA或转座子诱变的植物大群体中所有植物的材料并制备基因组DNA。基因组DNA按照如Krysan等，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)中所述的特定结构汇集。基因组DNA库随后通过检测插入性突变致变物(例如T-DNA或转座子)和目的基因的组合的特异性多重PCR反应进行筛选。此后，PCR反应以T-DNA或转座子边界引物以及基因特异性引物的特定组合在DNA库上开展。用于引物设计的常用规则可以再次取自Krysan等，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)。低水平的DNA库的再筛选导致鉴定其中目的基因受插入性致变物破坏的单个植物。这些方法还可以应用于以插入性诱变加以突变的作物群体如玉米(Fernandes J，Dong Q，Schneider B，Morrow DJ，Nan GL，Brendel V，Walbot V.Genome Biol.2004；5(10)R82.Epub 2004 Sep 23 Genome-wide mutagenesis of Zea mays L.usingRescueMu transposons)或者稻(Sallaud C，Gay C，Larmande P，Bes M，Piffanelli P，Piegu B，Droc G，Regad F，Bourgeois E，Meynard D，Perin C，SabauX，Ghesquiere A，Glaszmann JC，Delseny M，Guiderdoni E.Plant J.2004 Aug；39(3)450-64.High throughput T-DNA insertion mutagenesis inricea first step towards in silico reverse genetics)。
进一步系统测序经T-DNA或转座子诱变的群体的插入侧翼也在作物中正在实施，这允许以硅片上(in silico)简单搜索具有本发明突变的基因的作物品系(Sallaud C，Gay C，Larmande P，Bes M，Piffanelli P，Piegu B，Droc G，Regad F，Bourgeois E，Meynard D，Perin C，SabauX，GhesquiereA，Glaszmann JC，Delseny M，Guiderdoni E.Plant J.2004Aug；39(3)450-64.High throughput T-DNA insertion mutagenesis in ricea first step towards in silico reverse genetics；Ryu CH，You JH，Kang HG，Hur J，Kim YH，Han MJ，An K，Chung BC，Lee CH，An G.，Plant Mol Biol.2004 Mar；54(4)489-502.，Generation of T-DNA tagging lines with abidirectional gene trap vector and the establishment of an insertion-sitedatabase)。
权利要求
1.与相应的未转化野生型植物细胞相比具有对环境胁迫的耐性和/或抗性的经转化的植物细胞，其中对环境胁迫的耐性和/或抗性因失活或下调的基因得以增加。
2.权利要求1所述的经转化的植物细胞，其中对环境胁迫的耐性和/或抗性通过失活或下调一个或多个基因得以增加，其中所述基因由选自如下的一个或多个核酸序列编码
a)核酸分子，其编码根据SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868的多肽；
b)核酸分子，其包含根据SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867的核酸分子；
c)核酸分子，其包含因遗传密码简并性能够衍生自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868中所述多肽序列的核酸序列；
d)编码多肽的核酸分子，其中所述多肽具有与核酸分子(a)至(c)所编码的多肽的氨基酸序列至少50％同一性并具有由SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868的蛋白质所代表的生物学活性；
e)编码多肽的核酸分子，其中所述多肽通过针对由(a)至(d)的核酸分子之一所编码的多肽的单克隆抗体加以分离并具有由SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868的蛋白质所代表的生物学活性；
f)核酸分子，其用包含核酸分子(a)或(b)的序列之一的探针或用该探针的具有在(a)至(c)中所表征的核酸分子至少15nt、优选地20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的片段在严格杂交条件下筛选合适核酸文库能够得到并且编码多肽，其中所述多肽具有由蛋白质减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的蛋白质所代表的生物学活性，
或者其包含与上述核酸序列互补的序列。
3.权利要求1或2所述的经转化的植物细胞，其以SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867的序列之一的一个或多个核酸序列同系物转化，其中植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、卡诺拉油菜、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、胡麻、报春花、油菜籽、甘蓝型油菜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈、椰子、多年生草本、饲料作物和拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)。
4.权利要求3所述的经转化的植物细胞，其中核酸与SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867的所述序列至少约50％同源。
5.权利要求1-4任一项中所述的经转化的植物细胞，其源自单子叶植物。
6.权利要求1-4任一项中所述的经转化的植物细胞，其源自双子叶植物。
7.权利要求1-6任一项中所述的经转化的植物细胞，其中植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、卡诺拉油菜、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、胡麻、报春花、油菜籽、甘蓝型油菜、万寿菊属、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈、椰子、多年生草本、饲料作物和拟南芥菜，优选地是欧洲油菜、大豆、玉米或稻。
8.权利要求1-4任一项中所述的经转化的植物细胞，其源自裸子植物。
9.经转化的植物，其自根据权利要求1-7任一项中所述的植物细胞产生并且其是单子叶植物或双子叶植物。
10.权利要求12所述的经转化的植物，其选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、油菜籽、卡诺拉油菜、木薯、胡椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、胡麻、报春花、油菜籽、甘蓝型油菜、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属物种、油棕榈、椰子、多年生草本、饲料作物和拟南芥菜，优选地是欧洲油菜、大豆、玉米或稻。
11.经转化的植物，其从根据权利要求1-4或8任一项中所述的植物细胞产生并且其是裸子植物。
12.由权利要求9至11任一项中所述的经转化的植物产生的种子，其中所述种子对于在失活或下调时引起与野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性的基因至少是基因杂合的。
13.产生经转化的植物的方法，所述经转化的植物通过使在经转化的植物中引起与相应的未转化野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的基因失活或下调而具有与相应的未转化野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性，所述方法包括
(a)通过失活或下调一个或多个基因而转化植物细胞，所述基因优选地由选自SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867的序列和/或其同系物中的一个或多个核酸编码以及
(b)自植物细胞产生具有与相应的野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的经转化的植物。
14.在权利要求1-8任一项中所述植物细胞或权利要求9-12任一项中所述植物中诱导与相应的未转化野生型植物相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的方法，所述方法为通过失活或下调由选自SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867的序列和/或其同系物的一个或多个核酸所编码的一个或多个基因。
15.权利要求14所述的方法，其中编码基因的核酸与SEQ ID NO1，3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867的序列至少约50％同源。
16.包含核酸构建体的植物表达盒，当其表达时允许通过权利要求13-15任一项中所述的方法失活或下调由选自SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81；和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867的序列和/或其同系物和/或其部分的一个或多个核酸所编码的一个或多个基因。
17.在植物细胞或植物中检测环境胁迫的方法，其包括筛选植物细胞与非胁迫条件相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。
18.筛选植物细胞或植物对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的方法，其包括筛选与非胁迫条件相比较在胁迫条件下的植物细胞对环境胁迫增加的耐性和/或抗性。
19.将植物细胞或植物朝对环境胁迫增加的耐性和/或抗性方向培育的方法，其包括筛选与非胁迫条件相比较在胁迫条件下的植物细胞对环境胁迫增加的耐性和/或抗性并选择对环境胁迫具有增加的耐性和/或抗性的那些植物细胞。
20.权利要求24或25的方法，其中对环境胁迫增加的耐性和/或抗性是因为一个或多个失活或下调的基因。
21.权利要求18或19的方法，其中对环境胁迫的耐性和/或抗性通过失活或下调由选自SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867中所示核酸序列和/或其同系物的一个或多个核酸序列编码的一个或多个基因而增加。
22.具有失活或下调的基因的经转化的植物细胞，其中所述基因由选自SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867的序列和/或其同系物的核酸序列编码。
23.分离的核酸分子，其包含选自如下的核酸分子
a)核酸分子，其编码的多肽包含根据SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868的多肽；
b)核酸分子，其包含在SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663.665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867中所示的多核苷酸；
c)包含核酸序列的核酸分子，其中所述核酸序列因遗传密码简并性能够衍生自(b)中所述的多肽序列并且具有由根据SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664.666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868的蛋白质所代表的生物学活性；
d)编码多肽的核酸分子，其中所述多肽与由核酸分子(a)或(c)编码的多肽的氨基酸序列具有至少50％的同一性并具有由根据SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868的蛋白质所代表的生物学活性；
e)编码多肽的核酸分子，其中所述多肽通过针对由(a)至(c)的核酸分子之一所编码的多肽的单克隆抗体加以分离并具有由蛋白质X所代表的生物学活性；
f)核酸分子，其用包含核酸分子(a)至(c)的序列之一的探针或以(a)至(i)中所表征核酸分子的至少15nt、优选地20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的片段在严格杂交条件下筛选合适核酸文库能够得到并且编码具有由蛋白质X所代表的生物学活性的多肽；
g)核酸分子，其与选自SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867中所示多核苷酸的多核苷酸具有至少70％的序列同一性；
或其包含与上述核酸分子互补的序列；其中根据(a)至(g)的核酸分子至少在一个或多个核苷酸上与SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867中所述的序列不同并且编码在至少一个或多个氨基酸上与SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868中所述的蛋白质序列不同的蛋白质。
24.分离的多肽，其由如权利要求23所述的核酸分子编码。
25.抗体，其特异性地结合至如权利要求24中所述的多肽。
26.经转化的植物细胞，其中对环境胁迫增加的耐性和/或抗性由失活或下调的一个或多个基因所赋予，其中所述基因由选自如下的一个或多个核酸序列所编码
a)核酸分子，其编码SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868中所示的多肽；
b)核酸分子，其包含SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867中所示的核酸分子；
c)核酸分子，其包含因遗传密码简并性能够衍生自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82中所述的多肽序列的核酸序列；
d)编码多肽的核酸分子，所述多肽具有与核酸分子(a)至(c)所编码的多肽的氨基酸序列至少50％同一性并且具有由SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868的蛋白质所代表的生物学活性；
e)编码多肽的核酸分子，所述多肽通过针对由(a)至(d)的核酸分子之一所编码的多肽的单克隆抗体加以分离并具有由SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和/或82和/或96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866和/或868的蛋白质所代表的生物学活性；
f)核酸分子，其用包含核酸分子(a)或(b)的序列之一的探针或以该探针的具有在(a)至(c)中所表征的核酸分子至少15nt、优选地20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的片段在严格杂交条件下筛选合适核酸文库能够得到并且编码多肽，所述多肽具有由蛋白质减少或缺失引起对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的蛋白质所代表的生物学活性；和
g)核酸分子，其与选自SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和/或81和/或95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、531、533、535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573、575、577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、827、829、831、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865和/或867中所示多核苷酸的多核苷酸具有至少70％的序列同一性；
或其包含与上述核酸序列互补的序列。
27.植物，其包含权利要求26所述的细胞。
全文摘要
本发明总体上涉及经转化的植物细胞和植物，其包含导致与未转化的野生型细胞相比较对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的失活或下调的基因，以及产生此类植物细胞或植物的方法。本发明还总体上涉及与相应的未转化野生型植物细胞相比较具有对环境胁迫增加的耐性和/或抗性的经转化的植物细胞，产生、筛选和繁殖此类植物细胞或植物的方法以及检测植物细胞或植物中胁迫的方法。
文档编号A01H5/00GK101558158SQ200580040076
公开日2009年10月14日 申请日期2005年9月23日 优先权日2004年9月24日
发明者B·麦克尔西, G·普勒舍, P·普齐奥, H·维尔德, A·沙尔多南 申请人:巴斯福植物科学有限公司