专利名称：黄姜水解废液制备苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法
技术领域：
本发明涉及黄姜水解废液的资源化利用，具体来说，是利用黄姜加工提取皂素过程中的水解废液制备苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称苏云金杆菌或Bt)微生物杀虫剂的方法，属于环境工程技术领域。
背景技术：
黄姜(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)，又名盾叶薯蓣、火头根，是薯蓣科多年生缠绕草本植物，是我国特有的药源植物。黄姜也是我国薯蓣皂素含量最高的植物，有“药用黄金”之美誉，其根状茎含1.1-16.15％的薯蓣皂素，是合成甾体激素类药物的主要原料。
黄姜加工提取皂素的生产工艺主要有(1)预发酵-酸水解法，工艺流程为黄姜→粉碎→预发酵→硫酸水解→水解渣提取皂素，水解废液(即黄姜经酸水解处理后，水解物再经固液分离所得的液体部分，与水解渣相对应)排放；(2)酶水解-酸水解法，工艺流程为黄姜→湿磨→淀粉酶液化、糖化酶糖化→过滤物酸水解→水解渣提取皂素，水解废液排放。除皂素外，黄姜还含有40-50％的淀粉、45-50％的纤维素、5％的蛋白质以及其它矿质元素。现行生产工艺只对其中约2％的皂素进行了提取，而剩余98％的淀粉、纤维素等有益成分以水解废液与废渣的形式流失，不仅污染环境，也浪费资源。例如典型黄姜水解废液的含糖量为2-6％、SO42-约为2-4％、酸度大(pH＜0)，另外还含有少量的N、P与微量元素。
专利CN1124776A公开了一种从黄姜或穿地龙生产皂素的废液中提取酒精的方法，该方法将黄姜或穿地龙水解后的废液加入碱性物质中和，加入氮源与磷源进行酒精发酵，然后蒸馏提取酒精。专利ZL00131274.X公开了一种黄姜水解废液中提取与精制葡萄糖的工艺，该工艺在不影响皂素提取的前提下，将黄姜水解废液经酸水解、中和、脱盐、脱色等工艺步骤提取与精制葡萄糖。上述两专利对黄姜水解废液中的糖(淀粉水解产物)进行了资源化利用，前者着重于葡萄糖转化生产酒精，后者为直接提取与精制葡萄糖，两者均是黄姜产业链的有益延伸。然而上述两方法却缺乏工程应用实例，主要原因是经济可行性不强，两方法都需要较为昂贵的提取与精制过程，而得到的酒精或葡萄糖的价格较为便宜。
苏云金芽孢杆菌是一类能在代谢过程中产生伴孢晶体(即杀虫晶体蛋白)的革兰氏阳性细菌，是目前世界上产量最大的微生物杀虫剂(占微生物杀虫剂总量的90％以上)，广泛应用于防治农、林和果树害虫、贮藏害虫以及卫生害虫。与化学杀虫剂相比，Bt杀虫剂具有选择性强，对人畜无害，环境友好等优点。目前Bt杀虫剂主流生产工艺是液体深层发酵，主要以各种工农业产品或农副产品，如葡萄糖、蛋白胨、黄豆粉、玉米淀粉、麦麸等为原料，原料价格过高(约占总生产成本的20-35％)是Bt杀虫剂难于普及的主要限制因素。因此，如何采用低成本、当地可得的工农业废弃物为原料，降低发酵生产成本，对于Bt杀虫剂这一生态无害型生物农药的推广应用有重要意义。
经国内外文献与专利检索，迄今尚未见利用黄姜水解废液为原料发酵制备苏云金杆菌微生物杀虫剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足之处，而提供一种黄姜水解废液制备苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法。在保留原有皂素提取工艺与不影响皂素提取效率的基础上，通过发酵技术将黄姜水解废液制备成附加值较高的微生物杀虫剂，既可解决黄姜水解废液的环境污染问题，又实现了其资源化利用与最终处置，变废为宝。
本发明的另一个目的在于提供上述方法制得的产品。产品可有效杀灭鳞翅目农作物害虫，对环境安全无害，产品质量符合《苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂》国家标准(GB/T 19567.3-2004)。
本发明目的是可以通过如下方式来实现提供的黄姜水解废液制备微生物杀虫剂的方法，该方法按如下顺序的步骤进行废液的预处理、菌种驯化、培养基成分补充、种子罐发酵、发酵罐发酵与发酵液后处理，具体方法如下其中L代表1升黄姜水解废液；％代表质量百分数，即每100份质量的培养基中接种种子的份数；1)废液的预处理向黄姜水解废液(含固率2-5％)中投加10-80g/L的含钙碱性物质，用于中和废液pH，并使废液中的SO42-与Ca2+反应生成CaSO4沉淀。利用重力沉降分离或离心分离法将CaSO4沉淀物去除。反应后废液pH提高至7.0-8.5，游离SO42-含量降低至5000mg/L以下。所用的含钙碱性物质指的是Ca(OH)2、CaCO3、CaO，其中最好是Ca(OH)2，Ca(OH)2的最佳用量是60g/L。
2)菌种驯化采取在牛肉膏蛋白胨培养基中逐步提高黄姜水解废液浓度的方法驯化苏云金杆菌发酵菌种。在培养基中逐步加入原浓度1/8倍的水解废液，在添加不同浓度黄姜水解废液的固体斜面或平板中接种Bt菌株，在30℃下好氧培养72小时，然后取正常菌落接种于含有1/4浓度水解废液的培养基中，在同样条件培养72小时，然后按上述方法将黄姜水解废液的浓度提高至1/2与原浓度，进行继代培养。上述过程可反复进行数十次，直至所得的Bt驯化菌株的杀虫效价接近或达到出发菌株在常规培养基的杀虫效价时停止。所用的Bt出发菌株是指Bt杀虫剂厂家现行使用的主要生产菌株，如Bt HD-1、7216等，可在国内微生物保藏机构通过直接购得。所用的牛肉膏蛋白胨培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15g/L；pH 7.2-7.5，自来水1000mL，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。培养基的形式为固体斜面或平板，斜面培养基同时也作为驯化菌种的保藏培养基。
3)培养基成分补充向经预处理的黄姜水解废液加入10-30g/L的氮源、0.2-1.5g/L的矿质盐、1-5g/L的消泡剂，搅拌均匀后在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌30-60分钟，冷却至30-35℃备用。所用的氮源是指大豆粕、花生粕、菜籽粕、鱼粉、玉米浆、酵母粉与蛋白胨等，最好是大豆粕，最佳用量是20g/L；所述矿质盐是由磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰三种物质组成的混合物，混合物中三种物质的质量比为20-100∶10-30∶1-5。所用的消泡剂是指泡敌、聚丙二醇、豆油、花生油等，其中最好是泡敌，泡敌的最佳用量为1.5g/L。
4)种子罐发酵向培养基接种Bt驯化菌株的摇瓶菌液，进行发酵培养。发酵条件为接种量1-3％，罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速度220-260转/分、发酵时间8-12小时。
5)发酵罐发酵按8-15％的接种量将种子液移种到发酵罐。培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶1.0-1.5(V/V/分)、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时。放罐标准伴孢晶体脱落20％、发酵液pH为8.5-9.0。
6)发酵液后处理发酵液加入20-50g/L的分散剂与1-4g/L乳化剂，搅拌均匀，送入喷雾干燥塔干燥，进风温度150-220℃，出口温度60-70℃，至含水率低于4％，分装。所述的分散剂是指高岭土、硅藻土、膨润土或轻质碳酸钙，其中最好是高岭土，最佳用量为40g/L。所述的乳化剂是指木素磺酸钠、Tween-80或TX-10，其中最好是木素磺酸钠，木素磺酸钠的最佳用量为2g/L。
本发明的技术原理是以黄姜水解废液所含的糖分与少量的蛋白质、磷以及微量元素为主要营养物质，同时补充部分氮源与矿质元素，在维持适宜pH、温度与通气量的条件下，苏云金杆菌得以生长与增殖，形成芽孢与杀虫晶体蛋白等杀虫活性物质，发酵液经浓缩干燥制成微生物杀虫剂产品。
本发明相比现有技术具有以下优点与积极效果(1)解决了高浓度黄姜水解废液的处置出路问题，既防止了有用物质的流失与对环境的污染，又实现了资源化综合利用，起到变废为宝的功效。
(2)现有苏云金杆菌微生物杀虫剂主要以葡萄糖、蛋白胨、黄豆粉、玉米淀粉、麦麸等工农业产品或农副产品为发酵原料，原料价格过高是其难于普及的主要限制因素。本发明中苏云金杆菌主要依靠黄姜水解废液中自身的可利用成分(糖分、蛋白质与矿质盐等)生长与增殖，添加的成分较少，并且可大大减少降低了微生物杀虫剂的生产成本，可促进苏云金杆菌这一生态无害的生物农药的推广应用。
(3)与现有技术——黄姜水解废液提取葡萄糖或发酵制酒精相比，本发明不需要昂贵复杂的提取精制工序，并且所得产品的附加值比葡萄糖与酒精要高，因此具有较好的经济可行性。
(4)本发明不改变现有的黄姜薯蓣皂素提取工艺，也不影响提取效率。
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施例方式
下面结合附图，列举6个实施例，对本发明加以进一步说明，但本发明不只限于这些实施例。
实施例1(1)黄姜水解废液取湖北省十堰市某黄姜加工厂的水解废液，该厂采用预发酵-酸水解法提取皂素，工艺流程为黄姜→粉碎→预发酵→硫酸水解→水解渣提取皂素，水解废液排放。经分析废液中还原糖含量为20.1g/L、粗蛋白含量为2.2g/L、硫酸根含量38.9g/L，pH＜0。
(2)黄姜水解废液预处理向黄姜水解废液中投加54.0g/L的Ca(OH)2粉末，充分搅拌，测废液pH为7.50，游离SO42-浓度为3200mg/L。重力沉降3小时，将CaSO4沉淀物去除。
(3)Bt菌种驯化采用微生物杀虫剂厂常用生产菌株的BtHD-1为出发菌株。牛肉膏蛋白胨固体培养基的成分为牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15g/L；自来水1000mL，pH7.2-7.5，15磅压力与121℃下灭菌30分钟。取稀释8倍黄姜水解废液1000mL，代替培养基的自来水，其它成分不变，制成含1/8倍原浓度水解废液的固体平板，接种Bt HD-1出发菌株，在30℃下培养72小时至出现菌落。用晶体芽孢区别染色法显微观察菌株形态，取正常菌落接种于含有1/4浓度水解废液的固体平板中，在同样条件下培养72小时，然后按上述方法将固体平板中废液的浓度提高至1/2与原浓度，进行继代培养。上述过程可反复进行12-15次，结果所得的Bt驯化菌株的杀虫效价与出发菌株在常规培养基的基本相同，所得菌株为驯化菌种。用斜面培养基保藏备用。
(4)培养基成分补充向经Ca(OH)2粉末预处理的黄姜水解废液中加入15g/L的大豆粕、0.5g/L的磷酸氢二钾、0.2g/L的硫酸镁、0.02g/L的硫酸锰和2g/L的泡敌。分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至30℃备用。
其它消泡剂是聚丙二醇、豆油、花生油，分别代替泡敌，效果相同。
(5)种子罐发酵接种1％的上述Bt驯化菌株的摇瓶菌液发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度240转/分、发酵时间12小时。
(6)发酵罐发酵接种10％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.03MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度180转/分、发酵时间32小时。
(7)发酵液后处理发酵液加入40g/L的分散剂高岭土与2g/L的乳化剂木素磺酸钠，搅拌均匀，送入喷雾干燥塔干燥，进风温度150℃，出口温度60℃，至含水率低于4％，分装。
其它分散剂是硅藻土、膨润土或轻质碳酸钙，效果相同。
其它乳化剂是Tween-80或TX-10，代替木素磺酸钠，效果相同。
实施例2(1)黄姜水解废液同实施例1。
(2)黄姜水解废液预处理同实施例1。
(3)Bt菌种驯化同实施例1。
(4)培养基成分补充向已预处理的黄姜水解废液中加入20g/L的花生粕、0.75g/L的磷酸氢二钾、0.3g/L的硫酸镁、0.03g/L的硫酸锰和2.5g/L的泡敌。分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用。
(5)种子罐发酵接种1.5％的上述Bt驯化菌株的摇瓶菌液发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.02MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度250转/分、发酵时间10小时。
(6)发酵罐发酵接种8％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.02MPa、通气量1∶1.1(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间36小时。
(7)发酵液后处理发酵液加入30g/L的硅藻土与1.5g/L Tween-80，搅拌均匀，送入喷雾干燥塔干燥，进风温度220℃，出口温度70℃，至含水率低于4％，分装。
实施例3(1)黄姜水解废液同实施例1。
(2)黄姜水解废液预处理向黄姜水解废液中缓慢投加41.0g/L的CaO粉末，充分搅拌，测废液pH为7.55，游离SO42-浓度为2600mg/L。重力沉降3小时，将CaSO4沉淀物去除。
(3)Bt菌种驯化同实施例1。
(4)培养基成分补充向经预处理的黄姜水解废液中加入15g/L的鱼粉和5.0g/L的豆油。不加矿质盐，分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用。
(5)种子罐发酵接种1.5％的上述Bt驯化菌株的摇瓶菌液发酵培养。培养条件为罐温32℃、罐压0.02MPa、通气量1∶1.5(V/V/分)、搅拌速度260转/分、发酵时间8小时。
(6)发酵罐发酵接种10％的种子液到发酵罐。培养条件为罐温32℃、罐压0.02MPa、通气量1∶1.5(V/V/分)、搅拌速度220转/分、发酵时间32小时。
(7)发酵液后处理发酵液加入30g/L的膨润土与2.5g/L TX-10，搅拌均匀，送入喷雾干燥塔干燥，进风温度200℃，出口温度70℃，至含水率低于4％，分装。
实施例4(1)黄姜水解废液取湖北省勋西县某黄姜加工厂的水解废液，该厂采用酶水解-酸水解法，工艺流程为黄姜→湿磨→淀粉酶液化、糖化酶糖化→过滤物酸水解→水解渣提取皂素，水解废液排放。经分析废液中还原糖含量为32.5g/L、粗蛋白含量为3.1g/L、硫酸根含量29.3g/L，pH＜0。
(2)黄姜水解废液预处理向黄姜水解废液中投加40.0g/L的Ca(OH)2粉末，充分搅拌，测废液pH为7.42，游离SO42-浓度为4600mg/L。用常规离心分离法将CaSO4沉淀物去除。
(3)Bt菌种驯化采用常用生产菌株Bt 7216为出发菌株。驯化方法同实施例1。
(4)培养基成分补充向已预处理的黄姜水解废液中加入15g/L的大豆粕、0.8g/L的磷酸氢二钾、0.3g/L的硫酸镁、0.04g/L的硫酸锰和2g/L的泡敌。分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至30℃备用。
(5)种子罐发酵接种1％的上述Bt驯化菌株的摇瓶菌液发酵培养。培养条件为罐温28℃、罐压0.02MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度220转/分、发酵时间12小时。
(6)发酵罐发酵以8％的接种量将种子液移入发酵罐。培养条件为罐温28℃、罐压0.02MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间42小时。
(7)发酵液后处理发酵液加入50g/L的高岭土与2.0g/L的Tween-80，搅拌均匀，送入喷雾干燥塔干燥，进风温度160℃，出口温度65℃，至含水率低于4％，分装。
实施例5(1)黄姜水解废液同实施例4。
(2)黄姜水解废液预处理向黄姜水解废液中缓慢投加30g/L的CaO粉末，充分搅拌，测废液pH为7.35，游离SO42-浓度为4800mg/L。重力沉降3小时，将CaSO4沉淀物去除。
(3)Bt菌种驯化同实施例4。
(4)培养基成分补充向经过预处理的黄姜水解废液中加入30g/L的玉米浆、0.25g/L的磷酸氢二钾、0.1g/L的硫酸镁、0.01g/L的硫酸锰和5g/L的花生油。分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至32℃备用。
(5)种子罐发酵接种2％的上述Bt驯化菌株的摇瓶菌液发酵培养。培养条件为罐温30℃、罐压0.02MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度240转/分、发酵时间10小时。
(6)发酵罐发酵以10％的接种量将种子液移入发酵罐。培养条件为罐温30℃、罐压0.02MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间38小时。
(7)发酵液后处理发酵液加入25g/L的硅藻土与1.0g/L的木素磺酸钠，搅拌均匀，送入喷雾干燥塔干燥，进风温度180℃，出口温度65℃，至含水率低于4％，分装。
实施例6(1)黄姜水解废液同实施例4。
(2)黄姜水解废液预处理同实施例4。
(3)Bt菌种驯化同实施例4。
(4)培养基成分补充向经过预处理的黄姜水解废液中加入20g/L的酵母粉、0.5g/L的磷酸氢二钾、0.2g/L的硫酸镁、0.02g/L的硫酸锰和1g/L的泡敌。分别在种子罐与发酵罐中经15磅压力与121℃温度灭菌60分钟，冷却至35℃备用。
(5)种子罐发酵接种3％的上述Bt驯化菌株的摇瓶菌液发酵培养。培养条件为罐温32℃、罐压0.02MPa、通气量1∶1.5(V/V/分)、搅拌速度250转/分、发酵时间8小时。
(6)发酵罐发酵以12％的接种量将种子液移入发酵罐。培养条件为罐温32℃、罐压0.02MPa、通气量1∶1.5(V/V/分)、搅拌速度210转/分、发酵时间32小时。
(7)酵液后处理发酵液加入50g/L的轻质碳酸钙和2.0g/L的木素磺酸钠，搅拌均匀，送入喷雾干燥塔干燥，进风温度220℃，出口温度70℃，至含水率低于4％，分装。
权利要求
1.黄姜水解废液制备苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法，其特性在于该方法按如下顺序的步骤进行废液的预处理、菌种驯化、培养基成分补充、种子罐发酵、发酵罐发酵与发酵液后处理，具体方法如下其中L代表1升黄姜水解废液；％代表质量百分数，即每100份质量的培养基中接种种子的份数；1)废液的预处理向含固率为2-5％的黄姜水解废液中投加10-80g/L的含钙碱性物质，充分搅拌反应，去除CaSO4沉淀物；反应后废液pH为7.0-8.5，游离SO42-含量降至500-5000mg/L；2)菌种驯化采取在牛肉膏蛋白胨固体培养基中逐步提高黄姜水解废液浓度的方法驯化Bt发酵菌种，在添加不同浓度黄姜水解废液的固体斜面或平板中接种Bt菌株，30℃下培养72小时，依次反复进行；3)培养基成分补充向经预处理的黄姜水解废液加入10-30g/L的氮源、0.2-1.5g/L的矿质盐、1-5g/L的消泡剂；搅拌均匀后在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121温度灭菌30-60分钟，冷却至30-35℃备用；4)种子罐发酵向培养基接种Bt驯化菌株的摇瓶菌液，进行发酵培养；发酵条件为接种量1-3％，罐温28-32℃，罐压0.02-0.06MPa，通气量1∶10-1.5V/V/分，搅拌速度220-260转/分，发酵时间8-12小时；5)发酵罐发酵按8-15％的接种量将种子液移种到发酵罐，发酵条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶10-1.5V/V/分、搅拌速度180-220转/分、发酵时间30-42小时；6)发酵液后处理发酵液加入20-50g/L的分散剂与1-4g/L的乳化剂，搅拌均匀，送入喷雾干燥塔干燥，进风温度150-220℃，出口温度60-70℃，分装。
2.根据权利要求1所述利用黄姜水解废液制备苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法，其特征在于1)中所用的含钙碱性物质是Ca(OH)2、CaCO3或CaO，其中，最好是Ca(OH)2，Ca(OH)2的最佳用量是60g/L。
3.根据权利要求1所述利用黄姜水解废液制备苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法，其特征在于1)中所用的CaSO4沉淀物去除方法是利用重力沉降分离或离心分离法。
4.根据权利要求1所述利用黄姜水解废液制备苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法，其特征在于3)中所用的氮源是大豆粕、花生粕、菜籽粕、鱼粉、玉米浆、酵母粉或蛋白胨，其中，最好是大豆粕，最佳用量是20g/L。
5.根据权利要求1所述利用黄姜水解废液制备苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法，其特征在于3)中所用的矿质盐是由磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰三种物质组成的混合物，混合物中三者的质量比为20-100∶10-30∶1-5。
6.根据权利要求1所述利用黄姜水解废液制备苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法，其特征在于3)中所用的消泡剂是泡敌、聚丙二醇、豆油或花生油，其中最好是泡敌，泡敌的最佳用量为1.5g/L。
7.根据权利要求1所述利用黄姜水解废液制备苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法，其特征在于6)中所用的所述的分散剂是高岭土、硅藻土、膨润土或轻质碳酸钙，其中，最好是高岭土，高岭土最佳用量为40g/L。
8.根据权利要求1所述利用黄姜水解废液制备苏云金杆菌微生物杀虫剂的方法，其特征在于6)中所述的乳化剂是木素磺酸钠、Tween-80或TX-10，其中，最好是木素磺酸钠，木素磺酸钠的最佳用量为2g/L。
全文摘要
本发明涉及黄姜水解废液制备苏云金芽孢杆菌微生物杀虫剂的方法。该方法按如下顺序的步骤进行废液的预处理、菌种驯化、培养基成分补充、种子罐发酵、发酵罐发酵与发酵液后处理，具体方法详见说明书。本发明优点是不影响原有的黄姜皂素提取工艺与提取效率，可获得杀虫效果良好并对环境安全无害的微生物杀虫剂，既实现了黄姜水解废液的资源化处置，又降低了微生物杀虫剂的生产成本。
文档编号A01P7/04GK1799362SQ200610000898
公开日2006年7月12日 申请日期2006年1月17日 优先权日2006年1月17日
发明者周顺桂, 常明, 卢娜, 倪晋仁 申请人:北京大学