参与硝酸盐吸收和代谢的植物基因的制作方法

专利名称：参与硝酸盐吸收和代谢的植物基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及参与硝酸盐吸收和代谢的植物基因。
背景技术：
氮在植物的包括代谢、资源分配、生长和发育在内的各 种功能中发挥着重要作用[Crawford, N.M., "Nitrate: Nutrient and Signal for Plant Growth (氮:植物生长的养分和信号)"CW/ 7: 859-868 (1995); Marschner, M.， Af/werar/ 7Vw^/".o" ///g/2er2<i W.(高等植物的矿物质营养，第二版)，Academic Press Ltd.: London (1995);和Stiit等，"The Molecular Physiological Basis for the Interaction Between Elevated Carbon Dioxide and Nutrients(升高的二氧 化碳和养分间相互作用的分子生理基础),"户/awf CW/ ￡>m'ra". 22:583-622 (1999)]。此外，氮是蛋白质和核酸的重要组分，也是植物中发现 的各种次级^i射物的重要纟且分[Marschner, M., Af/"era/ iVwW"o" o/ H^/zw P/a"&, ^/ (高等植物的矿物质营养，第二版)，Academic Press Ltd.: London (1995)]。因此，氮是植物最重要的无机营养物质之 一。无机氮以氮肥形式被添加到许多作物中[参见Frink等，"Nitrogen Fertilizer: Retrospect and Prospect (氮月巴回屈页与展望)"iVaf/. 爿cad 5W. 96: 1175-1180 (1999)]。被添加到土壤中的氮主要是氨 (NH4+)和硝酸盐(N(V)的形式。然而，对氮吸收效率的评估已表明， 所施用氮的百分之五十至百分之七十从植物-土壤系统中丢失[Peoples 等，"Minimizing Gaseous Losses of Nitrogen (4吏氮的气态才员失最小4匕)"，载于簾rage" 决e五謂Vo,ew/1, Bacon， P.E.编辑,Marcel
Dekker, pp. 565-606 (1995)]。无机养分肥料的应用是高产作物生产者的主要开支之一 [参见Good等，"Can Less Yield More Is Reducing Nutrient Input Into the Environment Compatible with Maintaining Crop Production (可以才更 入更少产量更多吗？减少向环境中的养分投入并兼顾维持作物生 产？ )，， 7Ve"cfe 尸/a"""'面e 9(12): 597-605 (2004)]。进一步，有报 告表明，以氮为基础的肥料可能与环境破坏相关[参见Vitousek等， "Human Alternation of the Global Nitrogen Cycle: Causes and Consequences,(与人类有关的全球氮循环交替原因和后果)"五co/.
7:737-750 (1997)]。因此，减少施用于作物的无机氮量的一个重 要途径是开发改善植物硝酸盐利用效率("NUE")的方法。传统的植物育种和标记辅助选择是业已研究用于开发和 鉴别NUE提高的植物的技术[参见Good等，"Can Less Yield More Is Reducing Nutrient Input Into the Environment Compatible with Maintaining Crop Production (可以投入更少产量更多吗？减少向环境 中的养分投入并兼顾维持作物生产？ )" 7>e"A & &/e"ce 9(12):
597-605 (2004)]。然而，这些方法往往是费时和劳动力密集的。另一 种做法是使用基因工程技术，开发已提高NUE的转基因作物。这种 方法要求鉴别提高NUE的基因。已有关于在拟南芥(」ra6^ 戸/力中 鉴别受氮水平调节基因的报道[Scheible等，"Genome-Wide Reprogramming of Primary and Secondary Metabolism, Protein Synthesis, Cellular Growth Processes, and the Regulatory Infrastructure of ^ra6Wopw's in Response to Nitrogen (应答氮的拟南芥初级和次级^ 谢、蛋白质合成、细胞生长过程和调节基础的基因组范围重新编程)", 尸/朋f P/^/o/. 136: 2483-2499(2004)]。然而，有必要鉴别在重要经济 作物如玉米中参与硝酸盐吸收和代谢的基因。本发明涉及克服本领域的这些问题和其他方面的缺 。发明概述本发明涉及来自玉米的受氮调节(例如被氮上调)的核酸分 子。本发明还涉及由所述核酸分子编码的分离蛋白质或多肽。本发 明还进一步涉及本发明所述核酸分子的启动子。本发明进一步涉及核酸构建体，其具有本发明的核酸分 子[即玉米受氮调节(如上调)的核酸分子]。该构建体还包括5， DNA 启动子序列和3'终止子序列。所述核酸分子、DNA启动子序列和终 止子序列纟喿作性地(operatively)连4妄以允许该核酸分子转录。本发明还涉及具有核酸构建体的表达体系、宿主细胞、 植物细胞、植物和植物种子，该核酸构建体包含玉米受氮调节的核 酸分子。本发明的另 一方面是在植物中表达受氮调节的核酸分子 的方法。这种方法涉及提供用核酸构建体转化的转基因植物或转 基因植物种子，所述核酸构建体具有玉米受氮调节的核酸分子、5， DNA启动子序列和3，终止子序列。该方法涉及在所述转基因植物 或由所述转基因植物种子生长的植物中能有效表达所述核酸分子的 条件下，培育该转基因植物或由该转基因植物种子生长的转基因植物。本发明的另一方面涉及来自玉米的分离DNA启动子，所 述启动子适用于诱导由与该DNA启动子操作性(operably)连接的分离 DNA分子所编码蛋白质的受氮调节表达。本发明进一步涉及包含所 述分离DNA启动子的核酸构建体以及含有该核酸构建体的表达载 体、宿主细胞、植物和植物种子。本发明还涉及指导分离核酸在植 物中受氮调节表达的方法。这种方法包括用本段落所述的核酸构建 体转化植物细胞，并从所述转化植物细胞再生植抹。通过这种方 法，所述核酸分子在所述DNA启动子控制下的表达在所述植物中发 生，并受氮的上调。硝酸盐利用效率(nitrate use efficiency)对集约玉米生产的
9种植者获利能力和生态可持续性两者都有影响。本发明有效地提供
通过增强作物(如玉米)的氮吸收而改善NUE的手段。特别是，本发 明的核酸构建体可用于利用分子标记辅助选择和/或转基因方法来开 发玉米种质。因此，本发明在提高作物的硝酸盐吸收和利用效率方 面是有用的，从而可减少使用硝酸盐补充剂。本发明的核酸构建体 包括与玉米作物基因对应的核酸分子，因而对玉米的硝酸盐代谢有 着最直接的影响。因此，与来自非作物植物(如拟南芥)的基因相比， 这些基因可能对玉米改良有着更直接的相关性。
发明详述本发明涉及来自玉米(例如来自B73幼苗)的核酸分子(如 基因)，其受氮(如以硝酸盐、硝酸钙等形式)的调节(例如上调)。这些 基因及其启动子是用于玉米改良的天然耙标。利用分子标记辅助选 择和/或转基因的方法，这些基因可被用来改良玉米种质。本发明提 供这些基因的全长cDNA克隆的核苷酸序列。本发明还提供这些基 因编码的分离蛋白质或多肽的氨基酸序列，以及它们的推定启动子 (基因转录起始位点的上游)。本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:l核苦酸序列的全长cDNA克隆中
GACGACGCCCCCGTCGCCGATA:i'GGGCGACCTCTCTGTCGGCCACAGC
CGCCGCTGGTGCGGCCGTTTCGCGGCCGTCCTTTGCCTGTGCGCGGC
CTTCTGCAAGCCAGATGAACTCCCGATGGATCCACTGCCGAACTTGC
CGCCGACGAGGTCGCTGCAGTGCTTCGAGGACGAACAGGTGTACAGC
TGCTGCGAGGGCGCGTACAGGCTAAACCCATCGGGAATCATCGCCGT
TCCCGTCGGCGCGGTGGACTACTACTGCGGCGGCGCGTGCGTGGTGG
AGACGGAGGACGTGCTCAACTGCGTGGCCAGCGCCCTGGACGGCTTC
GCCTTCTACAACGGGGCCTCCGTGGAGGACGTGCGCTACGCACTCAG
GCGGGGCTGCAGCCACACCGCCAGAAGAGGCGACTTCAACGATTTGG
AGCCGCATCTGGGCGACTACCCTGACATCTATGGCGACGATGATGAG
CACAGCTTTGGCAGCAAGGTTGTTGCAGCTCCTCTGAGGTTGCTCGC
GTTTCTTGGCGGTGCGGGGCTGTTCTTCCTGGGCCCTTGA
10(下划线二GeneRacer寡核苷酸序列；粗体/下划线=起始密码子；粗体 为编码序列)(5' RACE产物CW13E07-Fu11—Length的序列，其克隆入 pCR4-T0P0中)(源自MEST13-E07, GB—ACC# BG840928)由SEQ ID NO:l全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:2氨基酸序列
MGDLSVGHSRRWCGRFAAVLCLCAAFCKPDELPMDPLPNLPPTRSLQCFEDE
AFYNGASVEDVRYALRRGCSHTARRGDFNDLEPHLGDYPDIYGDDDEHSFGS KWAAPLRLLAFLGGAGLFFLGP SEQ ID NO:l全长cDNA克隆的基因的推定启动子(基因 转录起始位点的上游)具有如下所示的SEQIDNO:3核苷S臾序列ctttgccgagtgtttcagacactcggcaaagaacctgattccgatagtgaaggtcttacaccccgatcc
ctcactccgttc
aacatgcatgcatttgaa a_ca_gct
csggccsggccssctccggcgad
atgcctccgatcccaaccttcgtgtttcccaccaaacacacgcgtacagaggccaagcacacgcacaaa agcaagcctcgatcgtagcccgtgcctaaccctgccgatgccgtaataaacttgtgtgctccacgcaac
gaactctctcctataataatcctagctagcacacttgcccagattatattgcctgctccgacgaccttg
tgctcgtcaggtacgctcgtaaaaagaaaagaaaaaaaaagaagagatcgagatcgatctgttgacgac gcccccgtcgccgatatgggcgacctctctgtcggccacagccgccgctggtgcggccgtttcgcggcc gtcctttgcctgtgcgcggccttctgcaagccaggtgcgtgctcaccgtcaacacacgcaccattattc
jatatatagttacgtct
jcagtgcttcgaggacgaacag gtaagctaacaagcaagsgcgtgtttggtttcatgctaggacagagttgcataccacgtagctatcata
■gsgaggcgagctctttttgacsagcctcgdcgdsccssstadgccssgtcctactgtacgdgggcgatc gaggcgccgaggcctgtgtgatgtgatgccgtgtgtcgtggtcacccaccagctgctgtgtacattggt
cgtacaggctaaacccatcgggaatcatcgccgttcccgtcggcgcggtggactactactgcggcggcg cgtgcgtggtggagscggaggacgtgctcaactgcgtggccagcgccctggacggcttcgccttctacacagctaaaaccgtttttatttttagtttttttataacagaaaaaatatctctggaaacgaaaacggcaa cacagtagttcaaaaatatcgaagacaataatttaacatgaaaaatatatatgtaatgatcggaatcta
catacattaaagggttgtgctt
二3C
ictgaagtgacaatt jsgatcca_tta_cttcttttcta_a_ca_
tatttatatggttggacaatatatagatatacctaccttatgatctttttctgatttgagctcctgcta tcttagtaaaaccttatgataacgcttctaatgcaaccaaaactaagttgttcctctatggcttttagc actacctttgtaagtcctatttttgtagctcagaaactttcatttggcccaaatttgctccagagattt
tscttt3tggggtgctca±ca_a_ca_tta_ga_ttcsct
(>MAGI4—8075 MAGI4,contigs—w—singleton.fas 4037 bp)本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:4核苷酸序列的全长cDNA克隆中
tccatccatcqil^gcatgcgtcagcaccttccagagctgccccattg
ccagaagagcHIgatcaacaccaggtccaggggcagcagcagtagc
gtggcgaaggggtcaccaccaccagccttccagttccagtgcagggc
gtcgactttcgcggcggacaccagcctccggctcgagctggacgaga
accccgaggcgatcatctcgggggcgtggcccgggaactgctccctc
ctcagctacgacgacctccgcgcctacctcgagtcgcaggagacggc
ggcccaggcagacgatcagcgcggcgtggcgctcctgagcgagacc
atgtccacacccgtgctggtggccacagcagaccagaccctggagga
cgtcgagtgccacttcgaggccgtgtcggggcttccggtcgtcgaca
gcggcctcagatgcgtcggggtgatcgtcaagaacgaccgggcaagaGCCTCTCATGGGTCCAAGACGAAGATATCGGAAGTGATGACATCTCC AGCTATCACACTATCGTCTGACAAAACCGTGATGGATGCTGCTGTTCT CATGCTCAAGAAGAAGATCCACAGATTACCAGTTGTAAACCAGGACG AAAAAGTAATAGGTATAGTTACCCGCGCTGATGTTCTTCGCGTGTTGG
ACGCCAGGAGACTCCATCCCAGG
(下划线-GeneRacer寡核苷酸序列；粗体/下划线=起始密码子；粗体 为编码序列)(5' RACE产物CW13A08-Ful1—Length的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST13-A08, GB—ACC# BG840889)由SEQ ID NO:4全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:5氨基酸序列
MACVSTFQSCPIARRAKINTRSRGSSSSVAKGSPPPAFQFQCRASTFAADTSLR LELDENPEAIISGAWPGNCSLLSYDDLRAYLESQETAAQADDQRGVALLSET
KTKISEVMTSPAI丁LSSDKTVMDAAVLMLKKKIHRLPVVNQDEKVIGIVTRAD VLRVLEGMLKI SEQ ID NO:4全长cDNA克隆的基因的推定启动子(基因 转录起始位点的上游)具有如下所示的SEQ ID NO:6核苷酸序列
caacgtggagtaggcaagcgttggtcttggccgasccacgggatsasccsctgtgtcaactctgtgstt gatctcttgtggtattgtgttttgttgagactcttttctagccacttggcatttagtgtgctaacactt
gcatgcaattaacggtggtgtttttggcctgtcttgcagcagcgggtgcagcattggcttggcataagc acgcaeLCcssscssLagactaccttttggtcaatgcatgcgssgaatctgtacgsgcgggcgtsgacaac
actaattttttaagtatcctaacttattgtgaagaaacgtaaatatttagatcccgatccattaccacc
gacttctgcttgtttgttcagtctctcsggcagggttacsggaggceLstacaagstgttctccaacgat
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ttattaatagaaagtaaccttcttgggtgcggcccatacggtcctgagcgcactaaatgaggcctcatt
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aaaaaaaaggtgaaca_aagacgccaccttatcca_ctgccacgtgacagggggccaggggaa_tctcggcg
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cctccagctcttgctaacccggcctggacgggtctcctcctctgtggatatatacagcgcggcgtggcg ctcctgagcgagaccatgtccacacccgtgctggtggccacagcagaccagaccctggaggacgtcgag tgccsct
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二cttcgcgtgttggaaggcatgt tgaagatttaggagcgcagatacccstgctcggaagccacagcctcttgtaaatatgtagatgtgcccg ggcatggtgtttctgagtagcagcaaagagatctaccatgtataggagttctcc
(>MAGI4—31359 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 3987 bp)本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有如下所示SEQ ID NO:7核苷S臾序列的全长cDNA克隆中:
CAGAGGCGTGCCGGTGAAGCGCGAGAGCGGTGAGGC4XgGCGATGCAG
ACGGGGGTCGCGACCTCCAAGGTCCTCATCCTCGf55^TGCAGGGAT
GACGGGCTCGATCCTGCTGCGGAATGGCCGCTTATCTGATGTGTTGG
GAGAACTCCAGGAGATTATGAAGGGTGTAAATCAAGGAACTTCTTCG
GGTCCCTATGACATTGCACTTATTCAAGCTCAGATTCGGAATTTAGCG
CAAGAAGTCAGAGATTTGACATTGTCAAAGCCCATTACCATACTGAAT
GGCAAATCTGACTCGGGAGGCAGTTTATCATCCTACATACTGCCAGC
AGCAGCAGTTGGAGCAATGGGTTATTGCTACATGTGGTGGAAGGGGT
TGTCTCTCTCAGATGTCATGTTTGTCACAAAACACAACATGGCAAATG
CTGTTCAGAGCATGTCAAAGCAGTTGGAGCAAGTTTCATCAGCACTA
GCTGCAACAAAAAGACATCTAACTCAACGGCTTGAGAATTTGGATGG
CAAAATGGATGAACAAGTAGAGGTCTCCAAAGCTATTAGAAATGAGG
TCAATGATGTTAAAGATGACCTGTCTCAAATTGGATTTGATGTCGAAT
CAATTCAGAAAATGGTTGCTGGATTGGAGGGAAAGATCGAGTTACTT
GAGAACAAACAGGACGTGGCTAATACTGGTATCTGGTATCTCTGCCA
AGTAGCAGGCGGTTTAAAAGATGGAATAAACACCAGGTTTTTCCAGG
AAACCAGTGAGAAGCTGAAGCTCTCACATTCAGCTCAACCTGAAAAC
AAGCCAGTGAAGGGGCTTGAATTTTTTTCGGAAAGCACCATGGAACA
GAAAGTAGCTGACTCCAAACCAATTGCGGTGACAGTCGACGCTGAGA
AGCCTGAGAAAACCGCTGCTGTAATGGGCACCACAGTGCACAGGTCT
ATCAGGTTCTCATATCGGAAGGCAGGCCTTGCTTTGTGATCAAATCCT
CTCCGCTTGAGATGCACGTGGCCTTCCTGGTTG
(下划线^GeneRacer寡核苷酸序列；粗体/下划线=起始密码子；粗体 为编码序列)(5， RACE产物CW15E10-Fu11—Length的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST15-E10， GB—ACC# BG841093)由SEQ ID NO:7全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ IDNO:8氨基S吏序列
MAMQTGVATSKVLILVGAGMTGSILLRNGRLSDVLGELQEIMKGVNQGTSS
GPYDIALIQAQIRNLAQEVRDLTLSKPITILNGKSDSGGSLSSYILPAAAVGAM
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AGLAL SEQ ID NO:7全长cDNA克隆的基因的推定启动子(基因 转录起始位点的上游)具有如下所示的SEQIDNO:9核苷酸序列gcacgaacatccatagaagaactatctgaaLCtgaagctaaagatttgcatgaaatggtaatttgtacac
agcttgaataagtgcaatgtcatagggacccgaagaagttccttgatttacacccttcataatctccta gaaacacaaaaggtacatcattgccttaaataaacatttactaggaagtttcaLgagcataccatcaa^a
acaggaaggggaaagctcccgagcaaccgagcgagaagggtgcctggacccgggaccgggacctgagaa
cgctgtggggga_cgcgggtgttgtcgtggccgcctcgttggccagcgcgaacctcaccatgga_gtggaa
ctattaagtatagactga cactctatttttctcg
agaacagcactacatctatctagctaacaggtagacctgggataggggcagtaagcaaggacagcttct
aaacgcagcccagcagcatatgatttaaggtttcctgatcctgatcacataatggacatctctccggat gatccatacctcttctttgcaacctatcagctgtccacaccttcttgtgagcgsccaaccscatgaasa
iaatgcttgtctt
(>MAGI4—20155 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 3385 bp)本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ IDNO:IO核苷酸序列的全长cDNA克隆中GQi:[^GACCGGAACCTGAGCGGGTTTCTGATCGGGTGCCTGGGCGCC GCCGTGACGCTGCTGGCGTACCAGCAGACGGTGGTGACCAGCACGCA GAGCGTCGCGGCGGGCTTCGTCGTCATCCTCTTCGCCCTCTTCGTCA AGGAAGGATTCATTTCCCTCTGAATCTCTGGTGCGCGTCAGCCAGCCAT
GTCCCGCAGCTGCCGCTGTGCTCGTCAGGTTC
(下划线-GeneRacer寡核苷酸序列；粗体/下划线=起始密码子；粗体 为编码序列)(5' RACE产物CW28B08-Full—Length的序列，其克隆入 pCR4-T0P0)(源自MEST28-B08， GB—ACC# BG842208)由SEQIDNO:10全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ IDNO:ll氨基酸序列 SEQ ID NO:IO全长cDNA克隆的基因的推定启动子(基因 转录起始位点的上游)具有如下所示的SEQ ID NO:12核苷酸序列
ccaaatccttcgtttcgtcgtctccacacgcaatagcatccgagcaaagaagccaaagagcaactggga
gggcgccgccgtgacgctgctggcgtacca_gcagacggtggtgaccagcacgcaga_gcgtcgcggcggg
二ctg3atctctggtgcgcg
gaacagcaga_ctgcagatcagcaga_gttcttgccttcttacgctaattaataattattggtacacgaat cctgattgtgttgagccttct gtatgtttgctttgtatat aactaataaaattggcatgaattcaccccaaaaagattgatgctgtttctcactagttttcagcctcag a_cgactatagatgtccaaa_caq
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(>MAGI4—8905 MAGI4,contigs—w—singleton.fas 1736 bp)本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有
18如下所示SEQ ID NO:13核苷酸序列的全长cDNA克隆中
CTCCCTCTCTGTGGTGGAGTTTTACTTCCTGCACAGATTCCCCCTGCC
TTTTGCTGGCTACCTCATCTTCATTTCCATATTGGCTGGATTCTGGGG
CCAGTGTTTGGTTAGGAAGATCGTGCATGTGCTCAAGAGAGCATCGC
TTATTGTCTTCATCCTCTCCTCTGTTATCTTCGTCAGTGCTCTTACGAT
GGGTGTCGTTGGAACCCAGAAGAGCATTTCGATGATCAACAATCACG
AATATATGGGGTTCCTCAACTTCTGCGAGTAACTCAAACACCATCAGAC
(下划线-GeneRacer寡核芬酸序列；粗体/下划线=起始密码子；粗体 为编码序列)(5' RACE产物CW31A10-Fu11—Length的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST31-A10, GB—ACC# BG842452)由SEQ ID NO:13全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQIDNO:14氨基酸序列
FILSSVIFVSALTMGVVGTQKSISM麵HEYMGFLN CE SEQ ID NO:13全长cDNA克隆的基因的推定启动子(基因 转录起始位点的上游)具有如下所示的SEQIDNO:15核苷酸序列
acatctgatacacacagagcattacggtgacccatgttccatatcttaaggtaacgaaggtttgtccta
二atttagtcaatgtttatgaatattt gagggagtgagtaggtatcaattgcacccaggtaatgatcattttcaacggtcaaattactaaaa^tag
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cagcatcttcactcaaagagacagattaaagctgtttggactgctttagctataataaaaatactgtag adaaaacagaagtcggtggaagccgcagcgaacatgttctgattttcacggaaatacggcttgaaacgc
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ACT
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gattgatttagacgaaacaagtaaaagagctaatataatgctacatccgttctcgaatatttgtcgtcc
(>MAGI4—154269 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 2189 bp)本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:16核香酸序列的全长cDNA克隆中
AGCGAGGCTGGCGTTTGTGCTTGCACTGGCCATAGCCGCCTCGTCAA
TTGAGGTTGCGGAGAGCAGAGATTTTAATATCTTTGCTCAGGGCAGC
TTGCCTGATGCAACCAAGGGATCGTCTGGTCTAGCTGCAACCAGTGG
AAAGTTGTGTCAGTTATGCGAGCAGTACTCATCCGAGGCGCTCCTCTA
TCTCACACAAAACGAGACCCAGACTGAGATTCTTAGCATTCTACACCA
TGAATGTGCCAGCCTTGCCCCTCTCAAACAGCAGTGCATCACGCTGG
TTGACTACTACGTACCCCTTTTCTTCTTGGAGGTCTCCATGGTTACCC
CTGAGAAGTTCTGCGAGTCGATGCATCTCTGCAAGAAGGGGATGAAG
ATTAGCCTACCCACCCGGGAGGGTACTTGTGGTTTGTGCCACCATGTT
GTTGTTGAAATTCTTATCATGCTTAAAGACCCCAACATGCAGCTGGAA
GTAATCGACCTACTCACCAAAACATGCAGCAAGGCGCAGAACTATGA
GTTGTGAAGGTGATGCGA
(下划线二GeneRacer寡核苷酸序列；粗体/下划线=起始密码子；粗体 为编码序列)(5' RACE产物CW42B 12-Full—Length的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST42-B12, GB—ACC# BG873755)由SEQIDNO:16全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQIDNO:17氨基酸序列levsmvtpekfcesmhlckkgmkislptregtcglchhvweilimlkdpnm qlevidlltktcskaqnyeq SEQ ID NO:16全长cDNA克隆的基因的推定启动子(基因 转录起始位点的上游)具有如下所示的SEQ ID NO:18核香酸序列
ttacctgcatgttggggtctttaagcatgataagaatttcaacaacaacatggtggcacaasccacaag
ccctgagctgaattgaag
iaaatctctgct
catcgtacctgcttaccactaccagttggtcagttgacagga_a>ca_aaactactgcttgaagaaaactat
cagtagaagtttcagattcattcagcccgacgtaactgaagaattcagttcgcttcaagatgtagccat
tgcaLgcagattagcaaagcattttacgctcgcttttgcgctttattttgcccctcgtttcctttccagg aagaaccgaggggagacggtagtacagagagcccaggagaagctaacatatgaatggggaattaaagac tgcatcttggactcttccgggagcactttgttttcttaaagcttcgtgttacattaagaagatgcatga dtgtgtta_gsdsggcstsstcttttcttd
(>MAGI4— 114997 MAGI4,函tigs—w—singleton,fas 1961 bp)本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:19核香s臾序列的全长cDNA克隆中
tccatccatccctgcagca綠ggcgtctgcagtgaccagcagcgacaa
ggagcaggccgtcccta56I^cgacgctgacgaagcgcacgcgctgc
tgagctccggccatggctacgtggatgtcaggatgcggggggacttc
cacaaggcgcatgcgcccggtgctcggaacgttccctactacctgtc
cgtcacgccgcaagggaaggagaagaacccacactttgtagaggaagTGGCTGCCTTCTGTGGGAAGGATGATGTCTTCATTGTGGGTTGCAAC
ACGGGGAACAGATCCAGGTTCGCGACGGCAGACCTTCTGAACGCGGG
GTTCAAGAACGTGAGGAACCTGCAAGGTGGTTACCGCTCCTTTCAGC
GCTGCAGTTGAACG
(下划线K5eneRacer寡核苷酸序列；粗体/下划线=起始密码子；粗体 为编码序列)(5' RACE产物CW43D12-Fu11—Length的序列，其克隆入 pCR4隱TOPO)(源自MEST43-D12， GB—ACC# BG873856)由SEQIDNO:19全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:20氨基酸序列
MASAVTSSDKEQAVPTIDADEAHALLSSGHGYVDV脂RGDFHKAHAPGARN
GFKNVRNLQGGYRSFQQRAQQQ SEQ ID NO:19全长cDNA克隆的基因的推定启动子(基因 转录起始位点的上游)具有如下所示的SEQ IDNO:21核苷酸序列
二atggtgctagcttg
cgtaagca_aa_tcaagaagatggaggtatctcagcattcca_agtacttttgcga_gttctgtggga_aggta
二atgtccatcaatgtgtttctaagata C3tttgaagscagacagcatttgttccgastccaacctttgctgtgctgtgtttccagtttgctgtgaa gaggaaagcagttggaatttgggggtgcaaggactgtgggaaggtgaaggctggtggtgcttacaccat
ttgcagcact
atdtagctctttatattattggggtttcctgtagttgctcttgtcaggcatgttgtgggggccttatct
taggatctcaiaa_gttgt<gtt3agatttgcccttggttsccgttctgaatctg￡Lcaa_gtgat3tttcatc
ctgttcttgaaattctacagatactgctgcgtctctgctggttgagtctggtttagatagcaaccagtc cttattattggtctttcaagttcaagtcaactaaaatgcgacaaataaaaaaaagaatggagggagtat
tctgagtgcatctgatgttgcttacagtaacattacatgcatagagcagaagatcggatgcatctggat
cctgtccgtcacgccgcaaggtcagtttcttgctcgctggcgttggcgctggcactggcattggggtta ttgatttgagctgcctctgtccccgtgtagggaaggagaagaacccacactttgtagaggaagtggctg ccttctgtgggaaggatgatgtcttcattgtggtagctattcactcatataaataaataaataaatgta
acagatccaggttcgcgacggcagaccttctgaacgcggtaaacacagcccatccgagctttagcatca dtccsgttsgctgtst(〉MAGI4一143540 MAGI4.contigs一w一singleton,fas 2277 bp)本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:22核苷酸序列的全长cDNA克隆中
AACCACCTGAAGCCATGTGCATTGCTGCATGGATTTGGCAGGCTCACCC
TGTGCACCAACTCCTCCTGCTTCTCAACAGAGATGAGTTCCACAGCAG
GCCTACAAAAGCAGTAGGATGGTGGGGTGAAGGCTCAAAGAAGATCCT
TGGTGGCAGGGATGTGCTTGGTGGAGGAACATGGATGGGGTGCACCA
AGGATGGAAGGCTTGCCTTCCTGACCAATGTGCTTGAACCAGATGCCA
TGCCCGGTGCACGGACTAGGGGAGATCTGCCTCTCAAATTCCTGCAGA
GCAACAAGAGCCCACTCGAAGTTGCAACTGAAGTGGCAGAAGAAGCTG
ATGAATACAATGGCTTCAACCTCATACTAGCTGATCTAACAACAAATAT
CATGGTTTATGTGTCAAACCGGCCTAAGGGTCAGCCTGCAACAATTCA
ACTCGTGTCACCAGGACTCCATGTGCTGTCCAATGCAAGGCTAGATAG
CCCTTGGCAGAAGGCAATTCTCCTCGGTAAAAACTTCAGGGAGCTTCT
TAGGGAGCATGGTGCTGATGAGGTTGAAGTGAAGGATATAGTTGAGAG
GCTAATGACTGACACCACAAAGGCTGACAAAGATAGACTGCCAAACAC
TGGTTGTGATCCCAACTGGGAGCATGGTCTGAGCTCCATCTTCATTGA
GGTGCAAACTGACCAAGGGCCCTATGGGACACGGAGCACAGCCGTTTT
ATCAGTGAACTATGATGGCGAAGCTAGCTTGTACGAGAAGTATCTTGA
GAGTGGTATATGGAAGGATCACACAGTGAGTTACCAGATAGAGX4^TA
GGCATTGCACAGGAAAAGTTGGCGACCTCA
(下划线=起始密码子和终止密码子；粗体为编码序列)(5' RACE产物 AM45C08-1T3 Full—Length的序列，其克隆入pCR4-T0P0)由SEQ ID NO:22全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:23氨基酸序列
SPWqKAILLGKNFRELLREHGADEVEVKDIVERLMTDTTKADKDRLPNTGCD
VSYqiE
(在调整(trimming) GeneRacer寡核苷S吏序列后呈现上述序列。被克隆 入pCR4-TOPO载体的"TOPO克隆位点"。)本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:24核苷酸序列的全长cDNA克隆中GGCCAAGCGAGGAGCGAGGCGCGGGCGCGAGCGCGTCGTTGAGAIGGAT
TCGGAGGCGGTGCAGCACGGCCTTCTCCCTCTGTCTGCCTGf55^CC
TACCGCCAACAGCTGCGCGCATTACAGCCGTGGGTGCAGCGTCGTGG
CGCCCTGCTGCGGCCAGGCCTTCGGCTGCCGCCATTGCCACAACGAC
GCCAAGAACTCGCTGGAGGTCGACCCGCGCGACCGGCACGAGATCCC
CCGCCACGAAATAAAGAAGGTGATCTGTTCTCTCTGCTCCAAGGAAC
AGGACGTGCAACAGAACTGCTCCAGCTGTGGGGCCTGCATGGGCAAG
TACTTCTGTAAAGTATGCAAGTTCTTCGATGATGATGCCTCAAAGGGC
CAGTACCACTGTGACGGATGTGGAATATGTAGAACCGGCGGCGTGGA
GAACTTTTTCCACTGTGATAAATGTGGGTGTTGCTACAGCAATGTCTT
GAAGGATTCCCACCACTGCGTCGAAAGAGCAATGCATCACAACTGCC
CCGTCTGCTTTGAGTATCTGTTCGACTCCACGAAGGACATCAGCGTGC
TGCAATGTGGGCATACCATCCATTTGGAGTGCATGAACGAGATGAGA
GCACACCATCACTTCTCATGCCCAGTGTGCTCGAGGTCCGCCTGCGA
CATGTCGGCCACATGGCGGAAGCTCGACGAGGAGGTCGCGGCCACG
CCGATGCCTGACATCTACCAGAAGCACATGGTGTGGATCCTGTGCAA
CGACTGCAGCGCGACCTCGAGCGTGCGGTTCCACGTGCTGGGGCACA
AGTGCCCCGCGTGCAGCTCGTACAACACCCGGGAGACGAGGGCTGCG
(下划线-GeneRacer寡核苷酸序列；粗体/下划线=起始密码子；粗体 为编码序列)(5， RACE产物CW55C10-FullJLength的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST55誦C10， GB—ACC# BM072886)由SEQIDNO:24全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:25氨基酸序列
NSLEVDPRDRHEIPRHEIKKVICSLCSKEQDVQQNCSSCGACMGKYFCKVCKF
FDDDASKGQYHCDGCGICRTGGVENFFHCDKCGCCYSNVLKDSHHCVERAM
HHNCPVCFEYLFDSTKDISVLQCGHTIHLECMNEMRAHHHFSCPVCSRSACD
MSATWRKLDEEVAATPMPDIYQKHMVWILCNDCSATSSVRFHVLGHKCPAC
SSYNTRETRAACPRI SEQ ID NO:24全长cDNA克隆的基因的推定启动子(基因 转录起始位点的上游)具有如下所示的SEQIDNO:26核苷酸序列cgccgcgcttagcttcgcatctt
ggagctaq
cctcctaccgccaacagctgcgcgcattacagccgtgggtgcagcgtcgtggcgccctgctgcggccag gccttcggctgccgccattgccacaacgacgccaaggttcggtggtttccctccttccgttttcgcttc ggctccggttcagcagatgttctgaaacaaccctgtcccgtgccccggcagaactcgctggaggtcgac ccgcgcgaccggcacga_gatcccccgcca_cga_aataaagaa_ggtcagcgttccctccctctgctcaa_a_g agcastctcctgcctgtttcaaccattgcctatctcgtgttcgtctttgttattaccgtgagcaaagaa
二33tgg3gc3tttgttccgcc :acggttccgttccaat
gctcagtgctctgggagccgttctgcacttcacttgcgtgtcactaaaaacttgactgctttccgcgat gtgctccgcaccaagtggccggcactgcgtggtccacaggatttttcaagagaaagccggggtcacggg
jaaagggataccgtcagaggca
cagtaactgttcccttctgtcactgaactcatatgaatcgagacttaactggagctgttgcgcaggtga
aggagcacgcatcttttggctgtactactactgctaactgcatggaaactgctcattcccatcggcaggctaccagaagcacatggtaagaagccgaccgcccactcgttcgtcgtcccgttacatcttttccacagc
acgtgctggggcacaagtgccccgcgtgcagctcgtacaacacccgggagacgagggctgcgtgcccca ggatctgaggcgaaccagaggccatgtcacaaaatgccagggagatgccgtccaacgatcatctgtctg caggacgttgctgcgcttaaggttaaaggctagcgcgagaccaggcctggtagtccagtcttgagtttg gtgctggagcatttgtsatgttcc
ggcgcgsstgca_a_cga_a_a_t castaatsscstgcsgttctsttgggccgagcctsatcaggcaccacgaatgtgaataattgcacatgg
tgatcactacaataccatctaaaatgatgtgctcccttcaaaaccattggtttatattttctatccttt cattgccattgccgttacataatggcgcatgtggcatatatgggcggcgtatgtaggttcaggatggtc acacgacatatgacgagactacagagacatggtcaagagaagttcagtggattgtgacattctgatcta
aagcctgttttgaaataaccccaggattaagcatgtttggcccaaeLgaaatttttgtgatggtggtcga
tgagaataq
ctttaaacacatacctttttgccttggtgatggataaggacataccggacatasaggggataacccttg
agttgtggcaagaa_actttataatcaaaaggttttagacttagtagaactaaaatagaatatattggat gcgatttcsgcactacatatgaggaatgagatcttagtttagaaggtctaggaaggacacctttagata
ttaggacaacgattagaccttctatattatatggaacataattttagcctacdaaaagatgatatgttt agaatgatgatatacatgatagactaggggtagcaccagtcgatcgatatggtttgaatatatccaacg
11 a_ a_ a_ a_ 3 c c a_ a_ g a_ 3 g c t a_
26actaaaaggtta'
actgtctttggttcatcttggtaagatacgtcaaaaggaccgaatgccgaagctgtgacagacatgcag ggaatatagcagagcttcgataagagttaaagcttcggcttaagatgattatgaaggtcatacaagaaa
(〉MAGI4—73717 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 7106 bp)本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:27核苷酉饼列的全长cDNA克隆中
GCCGGCACTGCACCGGCTGCCAGGAGGAGGCGCCTCAAATTGACGAG
GCCGTCGGCCTCGCTCTTGATGGCGAGGAAGCTAAGGAAGAAGGCTG
CCGGCAGCAAACGCCCAAGGGCGGCAGCGTCGAGGAAGCGCGCGAT
GGCGATCAGGAGGAAGATGGAAGCGCTGAGGCTGCTCGTGCCACTCT
GCGGCCGAGACAACGGCTCGGTGACCGGTGGGGCGGTCGAACGACT
GGACGAGCTCCTCATGCACGCCGCCGGGTACATCCTGCGCCTCCAGA
TGCAGGTCAGAGTGATGCAGCTTATGGTCCATGCACTAAATGACCGG
TGTCTGGGTGCAAATCA
(下划线-GeneRacer寡核苦酸序列；粗体/下划线=起始密码子；粗体 为编码序列)(5' RACE产物CW61A10-Full—Length的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST61-A10, GB—ACC# BM073122)由SEQ ID NO:27全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ IDNO:28氨基酸序列MTAHQTCCDDAVAAGTAPAARRRRLKLTRPSASLLMARKLRKKAAGSKRPR AAASRKRAMAIRRKMEALRLLWLCGRDNGSVTGGAVERLDELLMHAAGYI LRLQMQVRVMQLMVHALNDRPED SEQ ID NO:27全长cDNA克隆的基因的推定启动子(基因
转录起始位点的上游)具有如下所示的SEQ ID NO:29核香酸序列
icagtattgctcgaccgaggaaga
caattaagtaggtgatcgat ctagctggctagtatatatagtggatgtggatcggatcatgtgacggccgggcggtggctgcattgcat
ccagtggcgtccgacagcgcgttttgacgaggaaaagagggtgcgggcacgcgcgcacgcatatgctcg
gtggctgcatgtggccactagtttggagaacatgcggcatatgccccggaccttcctgggcgctcaagc aaacaccgctctcgtgctcgctctcttgggaaatcgcagatgcatgctacccaacgtgacctggatctc ttttacgtacgcacaccctagcgtgctgctctcctgtgtccccgcctcctgctagctgttcacaatatc
ttatttagagtaccgtacctgtgccgtcagtgcccccaaccccaacgtaactacgcacgcacatggcat
cgatgatgccgttgccgccggcactgc atggcgaggaagct
icaacggctcggtgaccggtgg
cagagtgatgcagcttatggtccatgcactaaatgaLCcggcccga_ggattaa_tcttcttcccaagacca
tcggtgtctgggtgcaaatcattggctgagtgtgttattggtgatattatttgttcgtatatacagaat
acagccaacagttgtatgcatgtgaggggggttccttgtctgtatgtacgcaattgtctattgtgtgac ggttgaaattgaaatttcgtcaatcatcatttcttcgtctagataacgtgtgtacaaacggcgagtgtt taaatgaactagagctaataattagtggctaaaattagctggagacatccaaacaccctaactaataat
cggtatttgacaatttag
(〉MAGI4一145622 MAGI4.contigs一w一singleton.fas 2433 bp)本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:30核香酸序列的全长cDNA克隆中1￡GATGAATTTCCCGGCTGGAAGCGGGAGGCGGCAGCAGCATCCGG
GGCCGGAGCACCTGTCGCCGATGACGCCGCTCCCGCTGGCGCGGTAG
GGGTCGGTCTACTCGCTCACGTTCGACGAGTTCCAGAGCTCGCTCGG
TGGGGCCACCAAGGACTTCGGATCCATGAACATGGACGAGCTCCTCC
GCAACATCTGGTCGGCGGAGGAGACACACAGCGTCACAGCTGCGGAC
CATGCCGCGCGGGCGCCGTACGTCCAGTGCCAGGGCTCGCTCACCCT
CCCCTGCACGCTCAGCCAGAAGACCGTCGACGAGGTCTAGCGTGACC
CGTCCGCGCCGGCGTGGTGAGGGAGGACATGATGGCGGCGGCGCCC
GTACCACCAGCGCCGGGTTGCCCACCACCTCATCTGCAACCGCCAAT
GCTGTTTCCACATGGCAATGTGTTTGCTCCCTTAGTGCCTCCGCTCCA
ATTCGGGAATGGGTTTGTGTCGGGGGCTCTCAGTCAGCAGCAGGGAG
GTGTTCTTGAGGCCCCGGCGGTATCGCCGCGGCCGGTGACGGCAAGC
GGGTTCGGGAAGATGGAAGGAGACGACTTGTCGCATCTGTCGCCATC
ACCGGTGTCGTACGTTTTTTTGTGCTGGTTTGAGGGGAAGGAAGCCA
CCAGCTGTGGACAAGGTGGTTGAGAGGAGGCAACGCC
(下划线二GeneRacer寡核苷酸序列；粗体/下划线=起始密码子；粗体
为编码序列)(5' RACE产物CW76H12-Full—Length的序列，其克隆入
pCR4-TOPO)(源自MEST76-H12, GB—ACC# BM073865)由SEQIDNO:30全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQIDNO:31氨基酸序列
DRRRG1A由SEQIDNO:30全长cDNA克隆编码的另一预测蛋白质
或多肽具有如下所示的SEQ ID NO:32氨基S吏序列
MLEEFLVRAGVVREDMMAAAPVPPAPGCPPPHLQPPMLFPHGNWAPLVPPL QFGNGFVSGALSQQQGGVLEAPAVSPRPVTASGFGKMEGDDLSHLSPSPVSY VFLC，EGKEATSCGQGG SEQ ID NO:30全长cDNA克隆的基因的推定启动子(基因
转录起始位点的上游)具有如下所示的SEQ IDNO:33核苷酸序列gtcaggccgtggcggcttggcgaggggaatggatggatatgtgtcgccaccaaggagtcgtgtggggga
(>MAGI4—7232 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 1376 bp)本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:34核普酸序列的全长cDNA克隆中
GCAGTACTCAGACCCTTACTACGCAGGCGTTGTTGCTCCCTATGGAAG TCAAGATGTGTGTCCGAGGAGCCTGTCTATGTGAACGCCAAGCAGTAC CGCGGCATTCTAAGACGGCGGCAGTCACGTGCCAAGGCCGAGCTJSA
TCCACAGCATATGCGCAGCCCATCCATCTCGTGCACACTTG
(下划线=起始密码子和终止密码子；粗体为编码序列)(5' RACE产物 AM77A01-5T3 Full—Length的序列，其克隆入pCR4-TOPO)由SEQ ID NO:34全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:35氨基酸序列
MQHSSTQTLTTQALLLPMEVKMCVRGACLCERQAVPRHSKTAAVTCQGRA (在调整GeneRacer寡核苷S吏序列后呈现上述序列。被克隆入pCR4-TOPO载体的"TOPO克隆位点"。)
本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:36核苷酸序列的全长cDNA克隆中
扁;tcggcggcgctcgcggtgacggacgaggtggccctgccgatcc
gg6cggtgggggatctagcggccgccgccgaggtctcgcgggagga
ggtcgccgtcatcacccagtgcgcggcgctcggtgggaagttgcctt
ttgaagatgcatcagttggtgcggttcttgcagtcattaaaaacgtgg
aaagcttgagggagcaattggttgctgaaatcaggcgggtgctgaaa
gctggtggaagagtattggtgcagagccctgcaccctcatccagtca
gaagccgaacactgatattgagcgcaagttactgatgggtggatttg
ctgaagtgcaatcttctgctgcaagctcgcaggatagcgtgcaatct
gttacagttaaggcaaagaaggctagctggagcatgggctcttcttt
tccccttaagaaaacaacaaaagcccttcccaagattcaaattgacga
cgactctgatctgattgatgaagacagtctcttgactgaggaggacc
tgaagaaaccacaacttccagttgttggggactgtgaggtgggggca
gcaaagaaagcatgcaagaactgtacttgtggcagggctgaggccga
ggagaaggttgggaagctggagctcactgcggagcagatcaataacc
ctcagtcagcttgtggcagttgtgggttgggtgatgccttccgctgt
ggaacctgtccctacagaggtcttccaccattcaagcctggcgagaa
ggtttccttgtctggcaacttccttgctgctgacatatgatggcatcg
CCAACATCGGCAAAACAAGGA
(下划线二GeneRacer寡核苷酸序列；粗体/下划线=起始密码子；粗体 为编码序列)(5' RACE产物CW88H03-Full_Length的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST88-H03， GB—ACC# BM079064)由SEQIDNO:36全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:37氨基酸序列
GAVLAVIKNVESLREQLVAEIRRVLKAGGRVLVQSPAPSSSQKPNTD正RKLL
MGGFAEVQSSAASSQDSVQSVTVKAKKASWSMGSSFPLKKTTKALPKIQIDD
DSDLIDEDSLLTEEDLKKPQLPWGDCEVGAAKKACKNCTCGRAEAEEKVG
KLELTAEQ麵PQSACGSCGLGDAFRCGTCPYRGLPPFKPGEKVSLSGNFLAA
DI] SEQ ID NO:36全长cDNA克隆的基因的推定启动子(基因 转录起始位点的上游)具有如下所示的SEQIDNO:38核苷酸序列
31ccgagtgaacgtatgaaa
cttgcatgctttctttgctgcccccacctcacagtccccaactggtgaaaacatcagtgaaaacatcac
jaactaagttgacgggttttgt
atcagagtcgtcgtcaatttgaatct aagacagattctgataagttaataccttctgactggatgagggtgcagggctctgcaccaatactcttc
gcsactccaagagcttcctaagaaattgttccccaaaacatcatatagggggctgctgaaaaaaatcca ctaagagcaactccaaatgagtgcta^gaaaatttccccaaaaaatgattattggggatatgttaaaaaa ttttaggggtgaattatcat
gaagacctttgctcgccaatatttgagggagagtggagctcggatgcgggacgctgataatttgggggaggcctcctctcctctcgsagcttcacascacgccgsgttstttgatattgtsacaatctcgtcgcgcgg cttcsccsgttattactccgtagttatacttcgctsgtttsgtdtt
(>MAGI4—101388 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 5083 bp)受氮调节(例如上调)的适用核酸分子是来自玉米的非共 生血红蛋白基因(MEST129-C09.T3Seq)，具有如下所示的SEQ ID NO:39核苷酸序列
二cccgtgtggtcttgcg
ctttagcaatttctctctggagggagcgtgtattgttatcttgtgatcgagagcctgtgtgctgccttt由SEQ ID NO:39全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:40氨基S殳序列
VAAIKREMKPDA本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:42核苷酸序列的全长cDNA克隆中CAGCAGCC4I^GCGCAGCAGCAGGAGAAGAAGCAGCAGCAGAGGGG
GAAGCTGCAGAGGGTGCTAAGGGAGCAGAAGGCTCGGCTCTACATCA
TCCGCCGATGCGTCGTCATGCTCCTCTGCTGGAGTGACTGATCCATCT
TCTTTTTCCCATCCTTTTCACCTTGCCACTTTGGTGGGCGA (下划线-GeneRacer寡核苷酸序列；粗体/下划线=起始密码子和终止 密码子；粗体为编码序列)(5' RACE产物MEST213-C11-Full—Length 的序列，其克隆入pCR4-TOPO)由SEQ ID NO:42全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ IDNO:43氨基酸序列 MAQQQEKKQQQRGKLQRVLREQKARLYIIRRCVVMLLCWSD (在调整后呈现上述序列。被克隆入pCR4-TOPO载体的"TOPO克隆 位点"。)本发明的适用核酸分子是受氮上调的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:44核苷酸序列的全长cDNA克隆中
CGGCTCTGCATA1X;GAGGCGAAGAAGAAGCCGTCGGCCCCCGCCGCC
GTCGGAGCCGCGCCGCCGCCGCCGGGTAACGGGTACTTCAGCACCGT
CTTCTCCGCGCCGACTGCGGGAAGCGCAAGTGACGCAAAGCATGCGG
ACTTGTACACGATGCTGAACAAGCAGAGCTCCAGAGGGCAGAATGGC
AGAGATGGCAAATCCCACAGCCGCCCTACTTACAAGGATGGCAAACA
TGCTCATCCAAATGAGCCATCAGAATCTCCTTACTTTGGCTCATCCGT
GCATTACGGTGGTCGGGAGTTCTACAGCAGCGTTTTACGGAAGCAAC
CAGCCAATGAACCCCATACGGATTACAAGGGGGACAACCCGGATGGC
TCTGCTACCAGAGGTGATTGGTGGCAAGGTTCACTTTATTACTGAATA
ATGTGGGTGTCC
(下划线-GeneRacer寡核苷酸序列；粗体/下划线=起始密码子；粗体 为编码序列)(5' RACE产物CW264H08-Full—Length的序列，其克隆 入pCR4-TOPO)(源自MEST264-腦，GB—ACC# BM350368)由SEQ ID NO:44全长cDNA克隆编码的预测蛋白质或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:45氨基酸序列
A G
G M
T c
G K
G G
G c
G c
A G
A A
A G
^ c
T G
G G
G T
c
T
G CJ
T S
T J
c G
c A
c T
T G
c T
丁 T
c G
c T
A
G ^
G R
G g
G ^
c A
T G
A T
嵐
A G
^ G
^ T
A c
G c
G c
S c
G T
T T
c
A
G G
T A
T p
G A
T G
T G
A T
J T
c c
T c
G A
S cQSSRGQNGRDGKSHSRPTYKDGKHAHPNEPSESPYFGSSVHYGGREFYSSVL RKQPANEPHTDYKGDNPDGSATRGDWWQGSLYY
SEQ ID NO:44全长cDNA克隆的基因的推定启动子(基因转录起始位点的上游)具有如下所示的SEQ ID NO:46核苦酸序列aa^gcttacacttcataagagattcatagttttatcttacagccatcgttgtcaacctcaactaccatgaatgacaagaccta^tacctaagctggacagatgatcaaggacagttttacccctggagacagaaaaacttataagacttagctttgttat￡Lcaa>aattcgaacgactgctga_agtctcgaagtata_tagtctaggctgattaaaatgtaagt atgggttaaagtgctgct〕3tccgggttgtcccccttgtactggatttaaaattcaaaataaacatta_gacttaagcgctccaaatgatcatttggatg￡Lgcatgtttgcca_tccttgta_a_<gta_gggcggctgtgggatttgccatctgagcacgaatgtatcgttgtgcttatgaacgcgacctaaatcgaagagaaacgtcaaattgacaagagtacccagaact acctctgccattctgccctctggagctctgcttgttcagcatcgtgtacaagtccgcatgctttgcgtc acttgcgcttcccttgaatgcaaaa_caaagtcaaaatgtcaacgtcata_tcca_aatagattttgcataacacaaatcgcaacatagtaacggactctttcatcaaatcgcaccagctcactaatcatgcaaaaaaatt actaagaccccaggaatctgagagcaaaatatcagaacgatggcgtgaagagacggcccgtaccgcagt cggcgcggagaagacggtgctgaagtacccgttacccggcggcggcggcgcggctccgacggcggcgggcta_gactctcga_gagga_tgga_ccgtga_a_caLCttgacttgaggcggaaaaggatgggggcacgtgaagtgggccaacatctgtgccggcatttaaaggcctcgacggagcgactcggtttcgctatttcggagatctta aggggctgasgttagtatacgaatta_ttta>' caagtgcttccaaacatat attagtttttaacttggta'agattaaaaatattaattcaatctactstttttt(〉MAGI4— 139395 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 2631 bp)
本发明涉及具有玉米受氮调节之核酸分子的核酸构建 体。该构建体还包括5， DNA启动子序列和3，终止子序列。所述核酸 分子、DNA启动子序列和终止子序列操作性连接以允许该核酸分子 转录。35
本发明的核酸分子可使用本领域众所周知的试剂插入到 许多可用表达载体和细胞体系的任一表达载体和细胞体系中。适合 的载体包括但不仅限于以下病毒载体，如人载体系统gtll 、 gt WES.tB、 Charon 4;和质粒载体，如pG-Cha、 p35S-Cha、 pBR322、 pBR325 、 pACYC177 、 pACYC簡4 、 pUC8 、 pUC9 、 pUC18 、 pUC19、 pLG339、 pR290、 pKC37、 pKC101、 SV 40、 pBluescript II SK +/-或KS +/-[参见"Stratagene Cloning Systems" Catalog ("Stratagene克隆系统"目录)(1993),得自Stratagene, La Jolla, CA，其 全部内容在此引作参考]、pQE、 pIH821、 pGEX、 pET系列[参见 Studier等,"Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes (利用T7 RNA聚合酶指导克隆基因的表达")，Gewe五xpm^ow Tec/wo/ogy vol. 185 (1990)，其全部内容在此引作参考]，以及上述的 任一衍生物。重组分子可以通过转化，特别是转导、接合、带动转 移或电穿孔，被引入细胞中。用本领域的标准克隆程序将DNA序列 克隆入载体，描述参见 Sambrook 等，M /ecw/w C7麵'"g: ^ 丄a6oratory Afo"wa/， Second Edition, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1989)，和 Ausubel等，C鮮e"f尸ratoco/s Mo/ecw/arNew York, N.Y: John Wiley & Sons (1989)，其全部 内容在此引作参考。在制备表达用核酸载体时， 一般可将各种核酸分子序列 插入或替换入细菌质粒中。可使用任何便利的质粒，其特征是具有 细菌复制系统、有允许在细菌中进行筛选的标记和 一 般有 一 个或多 个独特、便于定位的限制性酶切位点。有许多质粒(被称为转化载体) 可用于植物转化。载体的选择将取决于优选的转化技术和转化的目 标物种。有各种载体可用于利用才艮癌农杆菌G4graZ)Gcten'wm ^me/ac/e附)(形成冠瘿的土传细菌)进4亍稳定转化。冠瘿的特征是在被 感染植抹的主干基部和主根上形成的肿瘤或瘿。这些肿瘤因细菌质 粒DNA的一部分转移并掺入植物染色体DNA中所致。这种转移DNA (T-DNA )与植物细胞的正常基因一起被表达。用作"肿瘤诱导质 粒"的质粒DNA-pTi或Ti-DNA包含了使T-DNA移入植物中所必 需的w>基因。该T-DNA携带编码参与植物调节因子生物合成的蛋 白质和细菌营养素(冠瘿碱)的基因。该T-DNA由两个25bp不完整同 向重复序列(被称为"边界序列")定界。通过除去癌基因和冠瘿碱基 因，并用感兴趣基因替代它们，就可能将外源DNA转移进入植物而 没有肺瘤形成或根癌农杆菌的复制[Fraley等，"Expression of Bacterial Genes in Plant Cells (细菌基因在植物细胞中的表达)，，，A^7爿c"ci. 80: 4803-4807 (1983),其全部内容在此引作参考]。
这项技术的进一 步改进导致发展出二元载体系统[Bevan， "Binary爿gro6a"eW調Vectors for Plant Transformation (用于植物转化 的二元农杆菌载体)"，M/c/ez'c Jc/A脑.12:8711-8721 (1984),其全部 内容在此引作参考]。在该系统中，从pTi中移除所有的T-DNA序列 (包括边界)，并将含T-DNA的第二载体引入根癌农杆菌中。该第二 载体具有在大肠杆菌和根癌农杆菌中均可复制的优势，并包含有利 于克隆转基因的多克隆位点。常用载体的例子是pBinl9 [Frisch等， "Complete Sequence of the Binary Vector Binl9 (二元载体Binl9的全 序列)"，尸te Mo/ec.肠/. 27:405-409 (1995),其全部内容在此引作参 考]。现在或以后所知的用于遗传转化的任何合适载体都适合于在本 发明中使用。 Cohen和Boye的第4,237,224号美国专利(其全部内容在 此引作参考)描述了利用限制性内切酶切割和用DNA连接酶连接来
产生重组质粒形式的表达系统。然后，这些重组质粒借助转化被引
入包括原核生物和在组织培养中生长的真核细胞的单细胞培养物，
并在其中复制。在载体构建体中还引入了某些"控制元件"或"调节序列"。 这些包括载体的非翻译区、启动子以及与宿主细胞蛋白质相互作用 以进行转录和翻译的5'和3'非编码区。这些元件的强度和特异性可能会有所不同。根据采用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合 适转录元件和翻译元件，包括组成型启动子和诱导型启动子。也可 以使用组织特异性启动子和器官特异性启动子。组成型启动子是指导基因在有机体整个发育和生活期表
达的启动子。广泛用于诱导转基因表达的一些组成型启动子的例子
包括来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶("NOS")基因启动子(Rogers 等的第5，034，322号美国专利，其全部内容在此引作参考)、花椰菜花 叶病毒("CaMV") 35S和19S启动子(Fmley等的第5，352，605号美国 专利，其全部内容在此引作参考)、来自几种肌动蛋白基因(已知其在 大多数类型细胞中都有表达)(Privalle等的第6，0020，68号美国专利， 其全部内容在此引作参考)中任一种的启动子以及泛素(已知在多种类 型细胞中有积累的基因产物)的启动子。诱导型启动子是在应答诱导物时能直接或间接地激活一 个或多个DNA序列或基因转录的启动子。在缺乏诱导物时，所述 DNA序列或基因不发生转录。诱导物可以是养分(如氮，包括硝酸盐 形式的氮)、化学因子(如代谢产物、生长调节剂、除草剂或酚类化合 物)或直接施加于植物的生理胁迫[如冷、热、盐、毒素或借助病原体 或致病因子(如病毒或真菌)的作用]。通过对细胞或植物外部施用诱 导物，如通过喷洒、灌溉、加热或暴露于可操作性病原体，可以使 含有诱导型启动子的植物细胞接触到诱导物。适用诱导型启动子的 例子是糖皮质激素诱导性启动子[Schena等，"A Steroid-Inducible Gene Expression System for Plant Cells (用于植物细胞的固醇诱导性基 因表达)"，iVoc.淑/. JcW. 88:10421-5 (1991)，其全部内容在此引 作参考]。当转基因植物接触纳摩尔浓度的糖皮质激素，或接触地塞 米松(糖皮质激素类似物)时，在转化植物中可诱导转基因所编码蛋白 质的表达[参见Schena等，"A Steroid-Inducible Gene Expression System for Plant Cells (用于植物细胞的固醇诱导性基因表达)"，iVoc. v4cad88:10421-5 (1991); Aoyama等，"A Glucocorticoid-Mediated Transcriptional Induction System in Transgenic Plants (在转基 因植物中糖皮质激素介导的转录诱导系统)"，尸/朋f /. 11:605-612 (1997);和McNellis等，"Glucocorticoid-Inducible Expression of a Bacterial Avirulence Gene in Transgenic Arabidopsis Induces Hypersensitive Cell Death (转基因拟南芥中细菌无毒基因的糖皮质激 素诱导性表达诱导过敏性细胞死亡)，，，尸/aw/丄14(2):247-57 (1998),其 全部内容在此引作参考]。此外，诱导型启动子包括在植物的选定组 织内以组织特异性方式调节感兴趣基因的启动子。这类组织特异性 或发育调控型启动子的范例包括种子、花、果实或根特异性的启动 子，它们是本领域众所周知的(Shewmaker等的第5,750,385号美国专 利，其全部内容在此引作参考)。已经开发了许多组织和器官特异性启动子用于植物基因 工程[Potenza 等，"Targeting Transgene Expression in Research, Agricultural, and Environmental Applications: Promoters used in Plant Transformation (研究、农业和环境应用中的靶向转基因表达用于植 物转化的启动子)"/" Ce//. Dev. P/""/ 40:1-22 (2004)，其全 部内容在此引作参考]。这些启动子的范例包括花特异性启动子 [Annadana等,"Cloning of the Chrysanthemum UEP1 Promoter and Comparative Expression in Florets and Leaves of Dewcira"f/ze附a graw^/7ora (菊花UEP1启动子的克隆和在紫花玉兰的花和叶中的比 较表达)，"rra附ge"ic 11:437-445(2002),其全部内容在此引作参 考]、种子特异性启动子[Kluth等，"5， Deletion of a Promoter Region Leads to Changes in Tissue and Developmental Specificities (gZw〃启动子区的5'缺失导致组织和发育特异性的变化)，"P/aW Mo/, 历o/. 49:669-682 (2002)，其全部内容在此引作参考]、根特异性启动子 [Yamamoto等，"Characterization of c/s-acting Sequences Regulating Root-Specific Gene Expression in Tobacco (烟草中调节根特异性基因表 达的顺式作用序列的表征),"P/""/ Ce〃 3:371-382 (1991)，其全部内容 在此引作参考]、果实特异性启动子[Fraser等，"Evaluation of
39Transgenic Tomato Plants Expressing an Additional Phytoene Synthase in a Fruit-Specific Manner (以果实特异方式表达额外八氩番痴红素合酶 的转基因番茄植株的评价),"Prac. A^//. JcW. 99: 1092-
1097(2002)，其全部内容在此引作参考]、和块茎/储藏器官特异性启 动子[Visser等，"Expression of a Chimaeric Granule-Bound Starch Synthase-GUS gene in transgenic Potato Plants (转基因马铃薯植抹中嵌 合颗粒结合型淀粉合成酶-GUS基因的表达)，"户/a^Mo/. S/o/. 17:691-699 (1991),其全部内容在此引作参考]。如果在整个植抹中表达所引 入基因(转基因)可能造成有害影响，那么转基因的定向表达是有必要 的。另一方面，在整个植林中使基因沉默也可能产生负面影响。然 而，通过组织特异性启动子将沉默定位在某一区域内，可以避免这 样的问题。适用的启动子也可以是基因特异性启动子，因为其调节 本发明核酸分子的转录。适用的基因特异性启动子(来自MAGI93503) 具有如下所示的SEQIDNO:41核香酸序列顺序
ATCAGCAGACAGCAGGCATG
该基因特异性启动子是玉米基因组DNA的片段，其可能包括允 许SEQ ID NO:39的基因展现受氮调节表达的启动子元件。其它适用 启动子包括具有下述核苷酸序列的启动子SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO:15、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:26、 SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:33、 SEQIDNO:38、 SEQ ID NO:41和/或SEQIDNO:46。
本发明的核酸构建体还包括可操作性的3'调控区，其选 自能够为在所选宿主细胞进行表达提供mRNA的正确转录终止和聚 腺苷酸化的调控区，操作性地与本发明改良型性状核酸分子连接。 若干3'调控区已知在植物中是可操作性的。示例性的3'调控区包括但 不仅限于胭脂碱合成酶(NOS) 3'调控区[Fraley等，"Expression of Bacterial Genes in Plant Cells (细菌基因在植物细胞中的表达)，" 胸7為d 园80:4803-4807 (1983),其全部内容在此引作参考] 和花椰菜花叶病毒(CaMV) 3'调控区[Odell等，"Identification of DNA Sequences Required for Activity of the Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter (花椰菜花叶病毒35S启动子活性所需DNA序列的鉴定)，" 胸,313 (6005):810-812 (1985),其全部内容在此引作参考]。几乎 所有的已知在植物中可搡作的3'调控区都将适合与本发明结合应用。使用如下描述的众所周知的分子克隆技术，可以将上文 所述的不同组分连接在一起以产生含有本发明核酸构建体的表达系 统Sambrook等，Mo/ecw/<ar C7。m'"g: ￡"6oratoAy Ma"wa/， Second Edition, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1989)，和 Ausubel等,Cwre打f TVofoco/s A/b/ecw/or New York, N.Y:
John Wiley & Sons (1989)，其全部内容在此引作参考。 —旦制备了本发明的核酸构建体，就可将其掺入宿主细 胞。因此，本发明的另一个方面涉及含有一个或多个本发明核酸构 建体的重组宿主细胞。从基本上来说，该方法通过在能使核酸分子 在宿主细胞中有效地实现转录的条件下，用本发明核酸构建体转化 宿主细胞来实施。这可以通过本领域众所周知的标准克隆程序来实 现，所述程序例如描述于Sambrook等，Mo/ecw/ar C7om'"g.'爿 丄a6orarto^y ^Mi3wwa/, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1989)，其全部内容在此引作参考。适用的宿主 包括但不仅限于细菌细胞、病毒、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆 虫细胞、植物细胞等等。优选宿主是细菌细胞或植物细胞。转化方法可能导致核酸在启动子控制下的瞬时表达或稳定表达。虽然瞬时 表达可以达到重要目的，尤其是当被研究植物生长緩慢时，但优选 作为转化的结果，本发明核酸构建体被稳定地插入到重组植物细胞 的基因组中。适用于转化的植物组织包括叶组织、才艮组织、分生组 织、合子胚和体细胞胚、愈伤组织、原生质体、穗(tassel)、花粉、 胚、花药等。所选转化手段是最适合待转化组织的方法。可以借助粒子轰击实现在植物组织中的瞬时表达[Klein 等，"High-Velocity Microprojectiles for Delivering Nucleic Acids Into Living Cells (用于向活细胞转移核酸的高速微弹)，，，Atow" 327:70-73 (1987)，其全部内容在此引作参考],粒子轰击也被称为宿主细胞的基 因枪转化，如以下文献所述Sanford等的第4,945,050、 5,036,006和 5,100,792号美国专利,以及Emerschad等，"Somatic Embryogenesis and Plant Development from Immature Zygotic Embryos of Seedless Grapes (Kto v/m/era)(源自无核葡萄(W他v/m/era)未成熟合子胚的体 细胞胚胎发生和植物发育)"，Ce〃 14:6-12 (1995),其全
部内容在此引作参考。在粒子轰击中，钨或金微粒(直径为1-2pm)用感兴趣 DNA包被，然后利用高压气体轰击组织。通过这种方式，可以将外 源DNA递送细胞核并在组织的正常条件下获得这种基因的暂时性表 达。还可以将生物活性粒子(例如含有载体和外源DNA的干细菌细 胞)推入到植物细胞中。也可以使用现在已知或以后开发的其他多种 粒子轰击的变体。此外，可用粒子轰击转化法将核酸构建体稳定地 引入植物细胞。将核酸构建体稳定地引入植物细胞的另一适用方法是 用已寻皮核酸构建体转化的才艮癌农杆菌(^graZ ac^7'w附mwe々c/era)或毛 才艮农杆菌(」gra6"c/en'ww r/2/zoge"es)去感染才直物细月包。如上所述，农 杆菌的Ti (或RI)质粒能够非常成功地将外源核酸分子转移进入植物
42细胞。改变的农杆菌转化方法利用真空渗入，其中使用了整抹植物。另一种引入方法是原生质体与其他实体融合，其中其它 实体可以是小细胞、细胞、溶酶体或其他可融合性脂质表面体[Fraley 等，尸roc.胸/.固79:1859-63 (1982),其全部内容在此引 作参考]。也可借助电穿孔将核酸分子引入植物细胞[Fromm等，/Voc. 扁.Jcad USA 82:5824 (1985)，其全部内容在此引作参考]。在
孔。高场强电脉沖可逆性地-使生物膜通透，从而允许质粒的进入。 经过电穿孔的植物原生质重新形成细胞壁、分裂和再生。其他转化 方法包括聚乙烯介导植物转化、显微注射、物理摩擦(physical abrasives)和;敫光束[Senior, "Uses of Plant Gene Silencing (才直物基因沉 F夫的矛J用)",J /otec/z"o/ow Gewe"c五"g7'"eer/wg 15:79-119 (1998),其全部内容在此引作参考]。转化的确切方法对本发明的实施 不是关键的。能导致所选宿主细胞有效转化的任何方法都适用于本 发明的实施。转化也可以使用"whisker"方法实现，这是本领域众所 周知的。在转化后，必须使转化植物细胞再生。从培养的原生质 体再生植林的描述见Evans等，//""必oc^ 。/尸/"W CW/ CW&my， Vol,l, New York, New York:MacMillan Publishing Co. (1983); Vasil编辑，CW/ Cw/f廳a"t/ 5b麵"c Ce〃 o/尸/a他，Vol. I (1984)和Vol. Ill
(1986)， Orlando: Acad. Press,其全部内容在此引作参考。再生手段依据植物物种的不同而变化，但一般来说，首 先是提供转化原生质体的悬浮液或含外植体的培养皿。形成愈伤组 织，可从愈伤组织诱导芽，随后生根。或者，可在愈伤组织中诱导 胚形成。这些胚如天然胚一样萌发形成植株。培养基通常会含有各种氨基酸和激素，如生长素和细胞分裂素。有效的再生将取决于培 养基、基因型以及培养物史。如果控制了这三个变量，则再生通常 具重现性和可重复性。优选地，首先利用与本发明核酸构建体同时被引入宿主 细胞的选择标记来鉴定出转化细胞。适用的选择标记包括但不仅限 于编码抗生素抗性的标记，如赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转 移酶II ("nptII")基因(Fraley等，尸腦扁.」cd 5W.园80:4803-4807 (1983)，其全部内容在此引作参考)；和赋予下列抗性的基因 庆大霉素抗性、G418抗性、潮霉素抗性、链霉素抗性、壮观霉素抗 性、四环素抗性、氯霉素抗性等。让细胞或组织在含适当抗生素的 选择培养基中生长，藉此通常只有表达抗生素抗性标记的那些转化
子能继续生长。其他类型标记也适合包括在本发明的表达盒中。例 如，编码除草剂耐性如耐磺酰脲类的基因、或赋予曱氨蝶呤抗性的 dhfr基因(Bourouis等，￡M50丄2: 1099-1104 (1983),其全部内容在此 引作参考)是有用的。同样，编码产生可识别化合物的酶的"报告基 因"也是适用的。基因融合实验使用最广泛的报告基因是"WA，这是 源自大肠杆菌的编码P-葡萄糖醛酸酶蛋白的基因，又称为GUS [Jefferson等，"GUS Fusions: (3 Glucuronidase as a Sensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plants (GUS融合体作为高等植物灵敏 而通用的基因融合标记的p-葡萄糖醛酸酶)"丄6:3901-3907 (1987),其全部内容在此引作参考]。同样，产生可因发光而鉴别的化 合物的酶(如荧光素酶)也是有用的。所用的选择标记将取决于目标物 种；对于特定目标物种，优选不同的抗生素、除草剂或生物合成选 择标记。随后，检测利用抑制剂或其他选择标记筛选出的植物细 胞和组织是否获得所述转基因[Sambrook等，Mo/ecw/ar C7om'wg:爿 Z^orato/j Mcww<2/， Second Edition, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1989)，其全部内容在此引作参考]。
在含有本发明核酸构建体的融合基因被稳定地掺入转基
因植物后，该转基因可以通过有性杂交被转移到其它植物。可使用 若干标准育种技术的任一种，这取决于待杂交的物种。 一旦产生了 这种类型的转基因植物，则该植物本身可按照常规程序栽培，使所 述核酸构建体存在于所产生的植物中。或者，从转基因植物收获转 基因种子。这些种子可以随后被种植在土壤中，并使用传统程序培 育以生产转基因植物。本发明包括这些植物的组成部分和果实。本发明可广泛应用于各种各样的植物或其种子。适用植 物包括双子叶植物和单子叶植物。更具体地说，适用植物包括 稻、玉米、大豆、油菜(canola)、马铃薯、小麦、绿豆、苜蓿、大 麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴 苣、苣荬菜、巻心菜、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风草、芜菁、花椰
菜、青花菜、萝卜、菠菜、洋葱、蒜、茄子、辣椒、芹菜、胡萝 卜、南瓜、西葫,、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草
莓、葡萄、覆盆子、菠萝、烟草、番茄、高粱、甘蔗、香蕉、拟南 芥、非洲紫罗兰属(Sa/"0做to)、矮牵牛、天竺葵、 一品红、菊花、 香石竹、藏红花、万寿菊、水仙花、松、蒺藜苜蓿(M^^"伊 fnmc"rtJa)、 /SWwt/ersw.a "wra油'ac"和百曰菊。本发明的另 一个方面是在植物中表达受氮调节之核酸分 子的方法。这种方法涉及提供用核酸构建体转化的转基因植物或转 基因植物种子，该核酸构建体具有玉米受氮调节的核酸分子、5' DNA启动子序列和3'终止子序列。所述核酸分子、5'DNA启动子序
列和3'终止子序列#:作性地连"1矣以允许该核酸分子的转录。该方法还
涉及在转基因植物或由转基因植物种子生长的植物中能有效表达所 述核酸分子的条件下，培育所述转基因植物或由所述转基因植物种 子生长的转基因植物。在一个实施方案中，转基因植物或转基因植 物种子通过以下步骤来提供用本发明核酸构建体转化非转基因植 物或非转基因植物种子，以产生所述转基因植物或转基因植物种子。 一方面，培育步骤有效地减少该转基因植物或由该转基因植物 种子生长的植物的氮吸收。另一个方面，培育步骤有效地增加了该 转基因植物或由该转基因植物种子生长的植物的氮吸收。再 一 方 面，培育步骤有效地提高了该转基因植物或由该转基因植物种子生 长的植物的氮利用效率。转基因植物或转基因植物种子的转化可利
用下述方法实现农杆菌介导转化、whisker法、真空渗入、基因枪 转化、电穿孔、显微注射、聚乙烯介导转化或激光束转化。本发明还涉及来自玉米的分离的DNA启动子，其适用于 诱导由与所述DNA启动子操作性连接的分离DNA分子所编码蛋白 质的受氮调节的表达。在本方法使用的适用DNA启动子可以是此处 所述的任一启动子，包括例如具下述核苷酸序列的启动子SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:26、 SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:33、 SEQ ID NO:38、 SEQ ID NO:41和/或SEQ ID NO:46。所述分离DNA启动子可用于制备如上所述的核酸构建 体。在特定的核酸构建体中，所述分离DNA启动子可与分离核酸操 作性连接，所述分离核酸或者具有下述核苷酸序列(或其编码部分) SEQ ID NO: 1、 SEQIDNO:4、 EQIDNO:7、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO:13、 SEQ ID NO:16、 SEQ ID NO:19、 SEQ ID NO:22、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:34、 SEQ ID NO:36、 SEQ ID NO:39、 SEQ ID NO:42和/或SEQ ID NO:44，或者 编码具下述氨基酸序列的多肽SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:5、 SEQ IDNO:8、 SEQIDNO:ll、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:23、 SEQ ID NO:25、 SEQ ID NO:28、 SEQ ID NO:31、 SEQ ID NO:32、 SEQ ID NO:35、 SEQ ID NO:37、 SEQ ID NO:40、 SEQ ID NO:43和/或SEQ ID NO:45。可由本发明DNA启动 子调节的其他适用玉米基因包括例如硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、
尿卟啉-ni甲基转移酶。通过将所述核酸构建体插入适当的载体(详见上文所述)而可制备表达载体，通过用含所述DNA启动子的所述核
酸构建体进行转化，可产生转基因宿主细胞和植物(包括其组成部 分，如果实和种子)。本发明还涉及指导分离核酸在植物中受氮调节的表达的 方法。这种方法涉及用核酸构建体转化植物细胞，该核酸构建体包 括适合诱导与所述DNA启动子操作性连接的分离DNA分子所编码 蛋白的氮调节表达的分离DNA启动子。这种方法还涉及从转化植物 细胞再生植株。用这种方法，所述核酸分子在所述DNA启动子控制 下的表达可在植物中发生并受氮的上调。本方法使用的适用DNA启 动子可以是此处所述的任一启动子，包括例如具下述核苷酸序列的 启动子SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:26、 SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:33、 SEQ ID NO:38、 SEQ ID NO:41和/或SEQ IDNO:46。虽然此处描述并详细4又述了优选实施方案，^a对相关领
域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明精神的情况下，可 以进行各种修改、补充、替代等，因此，所有这些改变都被认为是 落入本发明范围内，本发明的范围如下述权利要求书所限定。
权利要求
1.核酸构建体，其包含玉米受氮调节的核酸分子；5’DNA启动子序列；和3’终止子序列，其中，所述核酸分子、DNA启动子序列和终止子序列操作性地连接，以允许所述核酸分子转录。
2. 权利要求l的核酸构建体，其中，所述核酸分子(a) 或者编码多肽，所述多肽具有选自以下的氨基酸序列SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO:ll、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO:20 NO:25、 SEQ ID NO:28、 SEQ ID NO:31 NO:35、 SEQ ID NO:37、 SEQ ID NO:40、 NO:45;(b) 或者包含选自以下的核苷酸序列 NO:4、 SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO: 10、 NO:16、 SEQ ID NO:19、 SEQ ID NO:22 NO:27、 SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:34 NO:39、 SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44;(c) 或者包含选自以下的核苷酸序列中的编码部分' NO:l、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:IO、 NO: 13、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO:22、 NO:24、 SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:34、 NO:36、 SEQIDNO:39、 SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44。
3. 权利要求1的核酸构建体，其中，所迷DNA启动子序列是组 成型植物启动子。
4. 权利要求1的核酸构建体，其中，所迷DNA启动子序列是诱 导型植物启动子。SEQ ID NO:l、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:36、SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ IDSEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
5. 权利要求4的核酸构建体，其中，所述诱导型植物启动子是氮诱导型植物启动子。
6. 权利要求5的核酸构建体，其中，所述氮诱导型植物启动子 包含选自以下的核香酸序列SEQIDNO:3、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO:18、 SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:26、 SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:33、 SEQ ID NO:38、 SEQIDNO:41和 SEQIDNO:46。
7. 权利要求1的核酸构建体，其中，所述DNA启动子序列是组 织特异性启动子。
8. 权利要求1的核酸构建体，其中，所述DNA启动子序列是器 官特异性启动子。
9. 表达载体，其包含权利要求1的核酸构建体。
10. 用权利要求1的核酸构建体转化的宿主细胞。
11. 权利要求10的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是细菌细胞 或植物细胞。
12. 权利要求11的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是植物细胞。
13. 用权利要求1的核酸构建体转化的植物。
14. 权利要求13的植物，其中，植物选自稻、玉米、大豆、 油菜、马铃薯、小麦、绿豆、苜蓿、大麦、黑麦、棉花、向曰葵、 花生、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苣荬菜、巻心菜、抱子甘 蓝、甜菜、欧洲防风草、芜菁、花椰菜、青花菜、萝卜、菠菜、洋 葱、蒜、茄子、辣椒、芽菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、 黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、覆盆子、菠萝、烟 草、番茄、高粱、甘蔗、香蕉、拟南芥、非洲紫罗兰属、矮牵牛、 天竺葵、 一品红、菊花、香石竹、藏红花、万寿菊、水仙花、松、 蒺藜苜蓿、iSawciersow/a awra""'aca和百日菊。
15. 权利要求13的;f直物的组成部分。
16. 利要求13的植物的果实。
17. 由权利要求13的植物产生的植物种子。
18. 用权利要求1的核酸构建体转化的植物种子。
19. 在植物中表达受氮调节的核酸分子的方法，所述方法包括提供用权利要求1的核酸构建体转化的转基因植物或转基因植 物种子，并且在所述转基因植物或由转基因植物种子生长的所述植抹中能有 效表达所述核酸分子的条件下，培育该转基因植物或由该转基因植 物种子生长的植物。
20. 权利要求19的方法，其中，所述培育有效地减少所述转基 因植物或由转基因植物种子生长的植物的氮吸收。
21. 权利要求19的方法，其中，所述培育有效地增加所述转基 因植物或由转基因植物种子生长的植物的氮吸收。
22. 权利要求19的方法，其中，所述培育有效地提高所述转基 因植物或由转基因植物种子生长的植物的氮利用效率。
23. 权利要求19的方法，其中，提供转基因植物。
24. 权利要求19的方法，其中，提供转基因植物种子。
25. 权利要求19的方法，其中，所述植物选自稻、玉米、大 豆、油菜、马铃薯、小麦、绿豆、苜蓿、大麦、黑麦、棉花、向曰 葵、花生、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苣荬菜、巻心菜、抱 子甘蓝、甜菜、欧洲防风草、芜菁、花椰菜、青花菜、萝卜、菠 菜、洋葱、蒜、茄子、辣椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西 葫芦、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、覆盆子、菠萝、烟草、番茄、高粱、甘蔗、香蕉、拟南芥、非洲紫罗兰属、矮 牵牛、天竺葵、 一品红、菊花、香石竹、藏红花、万寿菊、水仙 花、松、蒺藜苜蓿、5""w6feraow'a (3wra"",aca和百日菊。
26. 权利要求19的方法，其中，所述提供包括用所述核酸构建体转化非转基因植物或非转基因植物种子，以产生所述转基因植 物或转基因植物种子。
27. 权利要求26的方法，其中，所述转化包括农杆菌介导转 化、whisker方法转化、真空渗入、基因枪转化、电穿孔、显微注 射、聚乙烯介导转化或激光束转化。
28. 来自玉米的分离DNA启动子，其适用于诱导由与所述DNA 启动子才喿作性连接的分离DNA分子所编码蛋白质的氮调节表达，其 中，所述DNA启动子包含选自以下的核苷酸序列SEQ ID NO:3、 SEQIDNO:6、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:12、 SEQIDNO:15、 SEQ IDNO:18、 SEQIDNO:21、 SEQIDNO:26、 SEQIDNO:29、 SEQ ID NO:33、 SEQIDNO:38、 SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:46。
29. 核酸构建体，其包含 编码蛋白质的分离核酸分子；权利要求28的分离DNA启动子，其中，该DNA启动子操作性 连接到所述分离核酸分子的5'端以诱导该核酸分子的转录；和 与所述分离核酸分子操作性连接的.3，终止子序列。
30. 表达载体，其包含权利要求29的核酸构建体。
31. 用权利要求29的核酸构建体转化的宿主细胞。
32. 用权利要求29的核酸构建体转化的植物。
33. 由权利要求32的植物产生的植物种子。
34. 用权利要求29的核酸构建体转化的植物种子。
35. 指导分离的核酸分子在植物中受氮调节表达的方法，所述方 法包括用权利要求29的核酸构建体转化植物细胞，并 由该转化植物细胞再生植株，其中，所述核酸分子在所迷DNA 启动子控制下的表达在所述植抹中发生，并受氮的上调。
36. 玉米中受氮调节的分离核酸分子，其中，所述核酸分子包含选自以下的核苷酸序列SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:IO、 SEQ ID NO:13、 SEQ ID NO:16、 SEQ ID NO:19、 SEQ ID NO:22、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:3Q、 SEQ ID NO:34、 SEQ ID NO:36、 SEQ ID NO:39、 SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44;或选自以下的核苷酸序列中的编码部分SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:IO、 SEQ ID NO:13、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO:22、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:34、 SEQ ID NO:36、 SEQ ID NO:39、 SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44。
37.分离的蛋白质或多肽，其中，所述分离蛋白质或多肽包含选 自以下的氨基酸序列SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:5 、 SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO:ll、 SEQ ID NO:14、 SEQ ID NO:17、 SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:23、 SEQ ID NO:25、 SEQ ID NO:28、 SEQ ID NO:31、 SEQ ID NO:32、 SEQ ID NO:35、 SEQ ID NO:37、 SEQ ID NO:40、 SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:45。
全文摘要
本发明涉及玉米受氮调节(例如上调)的核酸分子、由这些核酸分子编码的蛋白质或多肽以及这些核酸分子的启动子。本发明涉及具有玉米受氮调节核酸分子的核酸构建体，以及具有所述核酸构建体的表达系统、宿主细胞、植物和植物种子。本发明还涉及通过培育转基因植物或由所述构建体转化的转基因种子生长的植物，在植物中表达所述受氮调节核酸分子的方法。本发明进一步涉及到分离的DNA启动子，其可用于指导分离核酸在植物中受氮调节的表达。
文档编号A01H1/00GK101631454SQ200780051119
公开日2010年1月20日 申请日期2007年10月22日 优先权日2006年12月8日
发明者P·S·施纳布尔, S·达什 申请人:衣阿华州立大学研究基金公司