专利名称：：红树植物根际促生固氮菌(dzy-x1)及其应用的制作方法
技术领域：
：本申请专利属于生物
技术领域：
，特别是涉及一种对红树林植物具有良好促生效果红树林根际固氮菌及其制备生物固氮菌肥的应用。
背景技术：
：红树林为自然分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落，覆盖大约60-75%热带和亚热带海岸，对维护海湾河口的生态平衡起重要作用，是海洋生产力的重要组成部分(Holguineta1.,2001)，被认为是具有较高生产力的生态系统。该生态系统具有较高的有机质水平(全球每年凋落物为100TgC)，为毗连的沿岸水域和相关的生物群落生境提供有机物(Holguinetal.,2001;LugomelaandBergman,2002)。然而红树林生态系统的无机营养较贫乏，尤其是无机氮水平较低(Holguinetal.,1992;Vazquezetal.，2000)，固氮生物的生物固氮被证明是红树林生态系统无机氮的主要来源(HicksandSylvester,1985;Kyamzietal2003)。生物固氮作为红树林生态系统和生源元素生物地球化学循环的重要环节，对红树林生态系统及生态环境产生极大的影响。由于人类的过度开发、围海造地和都市化等行为，使全球的红树林正以惊人的速度减少，据联合国粮农组织保守的数据估算，红树林正以每年平均减少1-2%的速度消失，其速度甚至超过了珊瑚礁和热带森林的消失速度。在发展中国家中，消失的速度更快，而红树林的90%以上位于发展中国家。美国红树林行动项目组负责人Aheredo(1999)认为，热带亚热带国家曾在3/4的海岸线上分布有红树林，现在仅剩下不到一半，而且大部分红树林为严重退化的生态系统。科学家预言，如果任其发展，在未来的近100年内，人类将彻底失去红树林(Duke，2007)。近年来，红树林生态系统的维护和红树林植株的保育等研究成为热门研究领域，也有多个国际组织和团体发起的旨在保护红树林的国际会议。《中国21世纪议程》(1994)优先项目计划中把红树林恢复与重建技术纳入了议事日程。ITTO组织，2002-2006年的计划目标亦把红树林生态系统恢复列为首要资助目标之一(廖宝文，2005)。可见红树林湿地生态系统的恢复工作亟需我们大力开展，但无论理论的研究还是实际恢复工作的开展都面临较大困难。红树林的恢复建设工作一直比较缓慢，这主要是由于红树林造林成活率极低(廖宝文，1999)。墨西哥和印度等国家的科学家利用植物生长促生菌(PGPB，plantgrowth-promotingbacteria)对红树林进行促生，取得了一定阶段性进展，但发现的适合红树林促生的菌种仍为少数，此类菌种依旧缺少且多数被保密收藏。目前中国林业科学研究院热带林业研究所正与墨西哥西北生物研究中心合作，引进相关菌种对我国主要红树植物进行接种测试和相关菌剂研究，以期解决我国滩涂地段红树林造林成活率极低的棘手问题。然而，引进菌种在我们国家红树林中的成活率小，并且也存在外种入侵所会产生的各种隐患。
发明内容本发明的目的是提出一株从中国热带红树林生态系统中筛选出的，具有较高的生物固氮活性的红树植物根际促生固氮菌新种。本发明的另一目的是提出所述的红树植物根际促生固氮菌在制备生物固氮菌肥的应用。本发明所提出的红树植物根际促生固氮菌，是从海南省三亚市的热带红树林生态系统中筛选出来的固氮菌新种。其分类命名为弧菌属附n'osp.2006-DZY-Xl。该菌于2007年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址中国武汉市武汉大学)，保藏编号CCTCCNO:M207118。本发明所述菌种的菌学特性描述如下菌种描述革兰氏阴性，直短杆状，不产生孢子，0.5X1.2-1.8Hm,单个生。氧化酶阳性，接触酶阳性，好氧或者兼性厌氧，0F发酵。是呼吸型，又是发酵代谢型。不产气。以单极生鞭毛欲动，鞭毛有一中心，并带有外鞘。在不良条件下形成原生质球体。在Ashby、TCBS以及BUG培养基上生长良好。在Ashby培养基上经过5d左右培养可以长为直径3-4cm左右，黄褐色、圆形、边缘整齐表面光滑的扁平菌落(如图1)。生长良好且迅速。2%-3%盐度为宜。V.P.阴性。对抗生素多数敏感，抗药性较小。目前已有报道弧菌属细菌固氮，如Kc/azo的p//czw和K"ara/ege"s。乙炔还原法(ARA)表明该菌可以利用N2作为氮源，且具有较高的生物固氮活性，纯培养条件下，其固氮活性30-78umolC2H2h—'mgi鲜重。运用特定的引物，对其纯培养物提取的DNA进行PCR扩增，通过固氮基因"/ZF的PCR扩增，扩增到较理想的目的条带，证明该菌株具有生物固氮基因(图2)。从菌株附Wosp.2006-DZY-X1的纯培养物提取基因组DNA，运用固氮基因特定的引物PolF/PolR和细菌16SrDNA全序列通用引物16SF/16SR进行PCR扩增，均扩增到理想的目的条带，通过基因克隆和测序分析得到固氮基因序列和16SrDNA序歹U,通过GenBank中的BLAST软件将m:/7/序列和16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对，在数据库中没有找到完全相似的序列，表明这2条基因序列为首次发现的新基因序列。向基因库成功递交新基因序列得到登录号为EF422075和EF199929。在GenBank数据库中选取了部分与测定序列相似性较高的代表性基因序列，通过ClustalW软件和Mega软件以Neibor-joining方法构建系统进化树(见图3，4),进行系统发育分析。从系统发育树(图3)可以看出菌株W6n'osp.2006-DZY-X1的16SrDNA序列具有较近亲缘关系的序列均来自弧菌属()^ho)，并且与已知菌种KAazo的/^/cws禾BKto/"折cm的16SrDNA序列具有98%的相似性，与该属中为定种的W6Wosp.QY102和P76n'osp.K22-41具有98%的同源性。另外与该属中己定种的K/z/s/7aw'cus，Kwetec/zw汰ov/z'禾口K_/7uv/<3//s具有95-97°/。的同源性。菌株附n'osp.2006-DZY-X1的固氮基因("i/H)序列与已知菌种M6n'oAaz0的;7Wc附的固氮酶基因亲缘关系最近(图4)，序列同源性为97%。生理生化结果表明，该菌和与它亲缘关系最相近的两株已知菌株明显不同(表l),证明为一株新种。表1刚n'o.tfezofro;^c附和DZY-X1两种细菌指标比较(+:表示阳性反应；-表示阴性反应)TestPf必azoirqp/h'cws附rz.osp._2006-DZY-X1在培养基上有侧毛+—游动+直杆状+氧化酶++还原硝酸盐+荧光色素++葡萄糖产气V.P.生长需要Na十+淀粉酶++明胶口引哚++蔗糖++甘露醇++阿拉伯糖++精氨酸++鼠李糖D-丙氨酸L-丙氨酸十D-阿拉伯糖十L-天冬酰胺(+)—纤维二糖++D-半乳糖++D-半乳糖醛酸+a-酮戊二酸+a-D-乳糖++L-亮氨酸D-甘露糖醇++L-脯氨酸+丙酸dL-丝氨酸dL-山梨醇D隱蔗糖++D-海藻糖++注K^"zofro;WcM数据参考东秀珠《常见细菌鉴定手册》。用含有ra>n'0sp.2006-DZY-Xl的菌液处理两种红树植物，木榄dt/gw'eragymoA/za)和红海榄(朋—tora砂/osa)，结果如表2所示。_表2P6rZosp.2006-DZY-X1对木榄和红海榄胚处理45天后的影响_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注表中值均为IO组平行样平均值。生物量中重量指湿重；剩下重量均指干重。从表2中我们可以看出该菌对于木榄和红海榄有着良好的促生作用。和对照组相比，叶面积明显高于对照组。叶面积平均值分别高于木榄和红海榄280.9%和74.9%。根生物量也有一定提高，其中红海榄提高比较明显，为56%，木榄效果不很显著，提高了11.1%。处理后光合素色含量也都有比较明显的提高，红海榄叶绿素b含量提高了148.3%，类胡萝卜素含量提高了235.2%。木榄提高不明显，叶绿素b含量处理后提高20。/。，类胡萝卜素含量提高35%。这些结果表明，用含有该菌的菌剂接种海榄、红海榄和木榄等红树植物可以明显促进植株生长，因此，该菌可以作为制备促进红树林植物生长的生物固氮菌肥的应用。本发明将在以下方面产生有益效果该菌对于红树林植物的促生效果较好，可用于自然红树林生态系统菌肥的生产工程菌，提高红树林生态系统的生产力，有望用于红树林恢复、造林的艰巨任务中。图1是f^Wosp.2006-DZY-X1菌落在TCBS上生长情况照片；图2是附A7'osp.2006-DZY-X1菌落在BUG上生长情况照片；图3是ra>r!'0sp.2006-DZY-X1菌株的透射电镜照片；图4是菌株附Wosp.2006-DZY-Xl的电泳图(1:DNA，2:16SrDNA，3:固氮基因",)H，Ml:入DNA/EcoRI十HindIII，M2:DL2000);图5是W6/v'osp.2006-DZY-X1在16SrDNA无根系统发育树中位置图6是ra)〃》sp.2006-DZY-X1在以固氮基因"i//建立的无根发育树中的位置图。具体实施例方式一、材料与方法1、材料l.l土样采集样品采自海南省三亚市红沙河沿岸红树林区木榄(5n/gw'eragyw"orWza)根际沉积物，样品采集后装入灭菌的封口聚乙烯袋中，带回实验室低温保存。1.2培养基Ashby液体培养基甘露醇lO.Og,KH2P04'11200.2g，MgS04'7H200,2g，NaCl0,2g，CaS04O.lg'CaCO35.0g，去离子水lOOOmL,pH7.0。Ashby固体培养基Ashby液体培养基+2.2%琼脂。改良DObereiner无氮液体培养基蔗糖10g，苹果酸5.0g，K2HP04H20O.lg，KH2P04H200.4g,MgS04'7H2O0.2g，NaC10.1g，Na2M0O40.002g，FeCl30.01g，去离子水lOOOml，pH7.0。LB培养基酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCUOg，琼脂1-2%，去离子水lOOOml，pH7.0。2、方法2.1菌种分离2.1菌种分离将样品混匀后取约lg于200mlAshby、DObereiner或者Ashby+DObereiner无氮液体培养基(Ashby培养基与DObereiner培养基以1:1比例混合)中，3(TC恒温48h进行加富培养。然后将菌液分别稀释至l(T4、l(T5、10-6三个稀释度,各稀释度的菌悬液以涂布法接种于Ashby固体培养基上，30°C48h培养后选择典型的单一菌落进一步纯化。2.2菌种纯化将分离出的菌落，用接种针挑取典型的单一菌落，经涂片染色，在光学显微镜下观察菌体形态，如所分离的菌落不纯，应做系列稀释后再次用平板涂布法分离，直至获得纯种。将纯化后的菌株接种于无氮Ashby固体培养基和LB全培养基甘油保存。2.3液体培养中固氮酶活力测定采用乙炔还原法测定固氮活性(参考Capone1993)，将斜面保存的纯菌株接种于10ml液体改良DObereiner培养基内，于3(TC摇床振荡培养72h，分别取1ml于灭菌的5ml小瓶中，盖上橡皮塞。用注射器从容器中抽走5%空气，然后加入相同体积的乙炔气体。每个样品设3个重复，1个空白对照，对照容器中不加入乙炔气体。所有样品于30'C孵育12h，用SQ-204气相色谱检测乙烯的生成量。乙炔还原法(ARA)表明该菌可以利用N2作为氮源，且具有较高的生物固氮活性，纯培养条件下平均固氮活性为30-78umolC2H2tf1mg'鲜重。2.4DNA的提取与纯化方法参考东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》P409。2.5"iy^基因的扩增采用固氮细菌的"i/W基因通用引物PolF/PolR(参考Polyetal.，2001)进行PCR扩增PolF:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>经过多次实验后建立了适宜的反应体系和反应条件。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>取2^1PCR反应产物用1.5。/。的琼脂糖凝胶电泳检领lj，剩余的PCR产物直接交与Trwitrogen生物技术有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系统测序。得到332bp的my7f序列。将序列直接递交Genbank数据库，序列号为EU707338。2.616SrDNA全序列的扩增DNA提取与纯化见方法见东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》P4。9。采用细菌16SrDNA全序列通用引物16SF/16SR(Weisenburgetal.，1998)，16SF:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16SR:5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3',进行PCR扩增。经过多次实验后建立了适宜的反应体系和反应条件如下PCR反应体系包括PCR反应程序是<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>取2^1PCR反应产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的PCR产物直接交与Invitrogen生物技术有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系统测序。得到的16SrDNA序列，将序列直接递交Genbank数据库，序列号为EU707337。利用DNAMAN软件对测序结果进行同源性比较，利用BLAST软件将测定得到的基因序列与GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行序列比对分析，获取相近典型菌株的16SrDNA基因序列，然后利用BIOEDIT中的ClustalW对序列进行排列，利用Mega中的邻接法(Neighbor-Joining)建立16SrDNA基因的系统发育树，进行系统发育分析，其中的遗传距离用Tamura-Nei公式计算，枝长代表了分歧程度，各枝上的数字是1000次bootstrap重抽样分析的支持百分比。2.7菌株制剂在土壤中的有效性试验将该菌附〃'osp.2006-DZY-Xl接种到无氮Ashby液体培养基中，直至浓度为108cell/ml，待用。采用2种红树植物一木榄和红海榄进行盆栽实验。每种红树10个平行样。外加对照。塑料盆放在露天条件下，用已准备好的菌液浸泡红树根部3-4h后栽种入塑料盆。45天后测量各个指标。对比实验指标为植物根、叶面积、植株重量、光合色素等。结果如表2所示。权利要求1、一种红树植物根际促生固氮菌，该菌是从热带红树林生态系统中筛选出来的弧菌属Vibriosp.2006-DZY-X1，含有16SrDNA序列和固氮基因nifH，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM207118。2、权利要求1所述的红树植物根际促生固氮菌在制备促进红树林植物生长的生物固氮菌肥的应用。全文摘要本发明提供一种红树植物根际促生固氮菌(DZY-X1)及其应用，该菌是从热带红树林生态系统中筛选出来的弧菌属Vibriosp.2006-DZY-X1，含有16SrDNA序列和固氮基因nifH，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNOM207118。该菌种具有较高的生物固氮活性，用含有该菌的菌剂接种红海榄和木榄等红树植物可以明显促进植株生长，因此可以作为制备促进红树林植物生长的生物固氮菌肥的应用。文档编号C05F11/08GK101298601SQ20081002897公开日2008年11月5日申请日期2008年6月23日优先权日2008年6月23日发明者孙翠慈,偲张,张燕英,斌杨,杨志浩,王友绍,董俊德申请人:中国科学院南海海洋研究所