专利名称：：粗提多杀菌素的方法
技术领域：
：本发明属于生物农药生产
技术领域：
，具体涉及一种粗提多杀菌素的方法。
背景技术：
：多杀菌素(Spinosad)是1982年美国礼莱公司科研人员从维尔京群岛土壤中分离的剌糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)发酵液中提取得到的一种新颖的大环内酯类超高效生物源杀虫剂。由美国陶氏农业科学公司生产，于1999年在我国注册商品名为催杀(Tracer48%悬浮液)和菜喜(Success2.5%悬浮液)，分别应用于小菜蛾和棉铃虫等的防治。其有效成份为SpinosynA和D，其中A和D比例分别为85%和15%。多杀菌素主要应用于对棉铃虫、烟青虫、小菜蛾、果蝇、甜菜夜蛾、蓟马等的防治，适用于棉花、茶、蔬菜和苹果、梨、桃等落叶果树。到1999年多杀菌素已经在24个国家、100多种作物上进行了注册登记。由于多杀菌素的毒性低，阳光下易分解，使用悬浮液不同pH对其活力不受影响，经美国环保局(EnviromentalProtectionAgency)测定该药剂不滞留于环境中，为低毒、高效的生物杀虫剂。多杀菌素因其具有降解完全，对害虫高效，对哺乳动物、鸟类、鱼类甚至大多数益虫具有宽广的安全界限等优点而获得美国"总统绿色化学品挑战奖"。多杀菌素的一个重要特点是其选择毒性比远高于其他常用农药，比阿维菌素大300-400倍。国内对多杀菌素的研究尚处于试验阶段。目前对于多杀菌素的提取工艺国内研究不是很多，因此确定一种有效提取多杀菌素的工艺方法也是突破多杀菌素产业化的瓶颈之一。关于多杀菌素的提取，国内外多数利用溶媒萃取法，此法虽然也能取得一定的效果，但有机溶媒使用量大，环境污染严重，利用树脂吸附法则能克服这一缺点。但树脂吸附法的工艺条件的研究尚不成熟，不能满足工业化的需求。发表于2005年5月的华中农业大学的硕士学位论文"多杀菌素分离纯化工艺的研究"披露了一种树脂吸附法提取多杀菌素的工艺，文献中采用XAD-4大孔吸附树脂对多杀菌素进行粗提。然而，此树脂在pH5-ll对多杀菌素进行吸附时均有泄露，不能达到完全吸附的效果，并且对吸附速率也有较高的要求。用此树脂在进行解吸的研究中，解吸条件(酸碱度)的考察只选用了静态实验，在动态实验的洗脱过程中并没有变换pH，所得的洗脱液中也含有较明显的色素，洗脱后产物的纯度没有明确说明。
发明内容目前现有技术中还没有一种纯度高、色素含量少、收率高的粗提多杀菌素的方法。为解决该技术问题，本发明通过静态实验，对有利于多杀菌素吸附的树脂进行了筛选，选取了一种高效的YPR-II大孔吸附树脂，并对洗脱条件进行了探索，使得多杀菌素洗脱液纯度高，色素含量少，收率提高。整个工艺简单，操作方便。因此，本发明提供一种粗提多杀菌素的方法，该方法包括将预处理后的多杀菌素发酵液上大孔吸附树脂柱YPR-II吸附的步骤。发酵液预处理方法取发酵液3L，4000r/min，30min离心得菌丝体，用3L的丙酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理发酵液。其产物浓度为897mg/l。本发明所述粗提多杀菌素的方法还包括用溶剂系统进行洗脱的步骤。本发明所述粗提多杀菌素的方法的特征在于，在洗脱步骤中依次用不同pH值、不同浓度的溶剂系统洗脱。所述溶剂系统为丙酮或甲醇，优选为丙酮。以不同浓度的丙酮为溶剂系统进行洗脱，显示当丙酮浓度为80%时，洗脱液经HPLC测定，效价达到最高峰。然而，由于多杀菌素是新型的大环内酯类化合物，脂溶性较强，因此如果直接用浓度较高的丙酮进行洗脱时，泄露率会较高，这样以至于降低收率，因此本发明采用40%、60%、80%浓度的丙酮溶液进行梯度洗脱，即先用较大量的40%和60%浓度的丙酮溶液洗脱水溶性较强的杂质，此时由于多杀菌素的极性较弱，只有极少量被洗脱下来，泄露率比较低。然后4再用极少量浓度较高的80%浓度的丙酮溶液除去脂溶性较强的杂质，此时洗脱液中产物含量有所增加，因此这个浓度只能用极少量，这样可以保证当最后用100%的丙酮溶液洗脱后的溶液杂质含量少，产物纯度高，收率降低少。同时，本发明人发现在洗脱过程中，通过改变溶剂系统的pH值的方法进行洗脱，可以使得洗脱液纯度高，色素含量少，收率提高。因此，本发明优选在洗脱步骤中改变溶剂系统的pH值，g卩，在洗脱步骤中依次用不同pH值的溶剂系统洗脱。具体的做法是，当丙酮浓度为40%时，将其pH调整至6.5至7.5，优选7.0;当丙酮浓度为60%时，将其pH调整至8.5至9.5，优选9.0;当丙酮浓度为80%时，将其pH调整至6.5至7.5，优选7.0。最后用100%的丙酮进行洗脱，每10ml进行收集，所得收集单元的纯度和效价如下表1收集单元123467纯度00.30.690.870.630.540效价022740935313490860由表1制得洗脱曲线如附图1所示，图1显示洗脱高峰集中。而洗脱后所得洗脱液澄清，无色。根据本发明一个优选的实施方案，使用ypr-n树脂，丙酮作为洗脱剂，并在洗脱过程中通过改变溶剂系统的pH值的方法进行洗脱。本发明通过实验得到一种吸附力强，吸附速度快的ypr-ii大孔吸附树脂，并通过洗脱条件的摸索，使得其用于多杀菌素的粗提时优点突出。此方法比文献报道的方法有以下优点1.色素去除较为彻底，与文献中报道的方法相比，可省去脱色步骤。2.所得产物纯度可达97%。可节省约1/2的有机溶剂，且在泄露率相同的条件下，洗脱体积较小，从而提高了回收率。图1为根据本发明优选的实施方案所得的多杀菌素的洗脱曲线。具体实施例方式实施例l:静态实验对吸附树脂进行比较取处理过的YPR-II和XAD-4大孔吸附树脂各20ml，分别装入750ml三角瓶中，然后加入200ml预处理过的发酵液，置于28。C、150r/min的摇床上振荡吸附，分别于3、6、9小时取样进行HPLC效价测定。总共分4次加样，每次加入发酵液体积为200ml。其中，未吸附产物比例=(吸附后取样效价/预处理后发酵液效价)xlOO%表2加样次数第一次第二次第三.次第四次取样时间(小吋)369369369(未吸附YPR—1101.4002.21.605.23.61.2产物比例XAD-4%)0.742.414.41.342.614.71.744.821.62.1表2显示，YPR-II树脂与XAD-4树脂相比，其吸附速率快，在较短时间内能达到完全吸附。实施例2:釆用YPR-II树脂对多杀菌素预处理后的发酵液进行吸附，考察pH对吸附的影响1)发酵液和树脂柱pH的调节将按现有文献得到的发酵液预处理后，各取200ml，分别调节pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0;取处理过树脂每20ml装成一个树脂柱，然后用已调节过相应pH的丙酮冲洗YPR-n树脂柱，使树脂的pH达到预上柱发酵液的pH，即得pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、ll.O的树脂柱。2)上柱分别用调节过pH的发酵液上相应pH的树脂柱进行吸附，每50ml为单位进行收集，HPLC检测泄露率。其中泄漏率(％)=每个收集单元的效价/预处理后发酵液的效价3)结果分析检测结果(如下表)显示，利用YPR-II树脂进行吸附时，在pH4-11范围内均吸附完全，无产物泄露。表3pH4.05.06.07.08.09.010.011.0上样效价(mg/1)879879879879879879879879吸附后泄露溶液的效价(mg/1)00000000泄露率(%)00000000与引用文献中所用的XAD-4树脂相比，本发明所用的YPR-II树脂吸附能力强，相同条件下，在不破坏产物的pH范围内(4-11)均吸附完全，无产物泄露。实施例3:洗脱剂的比较取经过吸附过的YPR-II树脂各20ml装柱固定后，分别用0%、20%、40%、60%、80%、100%的丙酮和甲醇进行洗脱，每个浓度的溶液用200ml体积，并且作为一个单元收集洗脱液，进行HPLC效价测定。结果如下表4所示表47溶剂浓度(％)020406080100洗脱液效甲醇014746391221873108价乙醇0192538135729822853(mg/1)丙酮023483624794698921由上表4可知，丙酮的洗脱能力比甲醇和要强，80%浓度时即可达到最高峰。实施例4:利用动态洗脱法选择树脂取吸附过的YPR-II、XAD-4树脂各20ml装柱固定后，用40%、60%、80%、100%的丙酮对两种树脂进行同歩洗脱，前两个浓度的溶液用200ml体积，第三个浓度洗脱溶剂用20ml，最后用80ml纯丙酮进行洗脱，每10ml作为一个单元收集洗脱液，进行HPLC效价测定，根据测定结果计算两种树脂用不同溶剂浓度洗脱的相对泄露率(表5)，以及用100%纯丙酮洗脱两种树脂所得洗脱液的相对纯度与相对收率(表6)，结果如下表所示表5溶剂浓度(％)406080相对泄露率YPR-II03.520.1XAD-41.218.742.3表6树脂类型相对纯度相对收率8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例5:利用丙酮为洗脱剂进行洗脱pH的比较取经过吸附后的YPR-II树脂各20ml装3个吸附柱，用pH分别为5.0、7.0、9.0的蒸馏水进行冲洗，使柱中树脂的pH分别保持为5.0、7.0、9.0。然后分别用相对应pH的40%、60%、80%的丙酮洗脱，收集洗脱液，进行HPLC效价测定。实验结果如下表7所示表7<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上表7显示，当丙酮浓度为40%时，调整pH6.5-7.5和pH8.5-9.5相比，当洗出主要杂质量相同时，pH6.5-7.5要比pH8.5-9.5泄露率低一倍。因此选择pH6.5-7.5为佳；当丙酮浓度为60%时，三个pH泄露率相差不大，但pH8.5-9.5洗脱下来的杂质量是pH4.5-5.5(接近自然pH)的2倍。因此选用pH8.5-9.5为佳；当丙酮浓度为80%时，pH6.5-7.5和pH8.5-9.5相比，洗脱出的杂质量相差不大,但pH6.5-7.5的泄露率要小一倍.并且此步所用洗脱剂量极少,对收率影响不大,因此选用pH6.5-7.5。实施例6:1.发酵液预处理取按现有文献得到的多杀菌素发酵液3L，4000r/min，30min离心得菌丝体，用3L的丙酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理发酵液。2.上柱吸附采用低于50%丙酮含量的预处理后的发酵液上大孔吸附树脂柱YPR-II吸附。3.水洗利用五倍柱体积的去离子水洗去水溶性杂质。4.洗脱溶液的配置及pH值的调节①分别取丙酮及蒸馏水混合配置成的丙酮溶液；②用2N的NaOH分别调节上述所配置的丙酮溶液，得到溶液I(pH为7.0浓度为40%的丙酮溶液)、溶液II(pH为9.0浓度为60%的丙酮溶液)、溶液m(pH为7.0浓度为80%的丙酮溶液)；③取三份200ml的蒸馏水，分别用2N的NaOH或HC1调节pH为7.0、9.0、7.0。5.洗脱①用pH7.0的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为7.0，然后用20倍柱体积的溶液I上吸附柱；②用pH9.0的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为9.0，然后用IO倍柱体积的溶液II上吸附柱；(D用pH7.0的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为7.0，然后用0.5倍柱体积的溶液III上吸附柱；用100%丙酮(不调pH)进行洗脱，每10ml为一个收集单元进行收集，合并洗脱效价较高的收集单元，用于进一步的精制实验。收率70.1%纯度97%实施例7:步骤如下1.发酵液预处理取按现有文献得到的多杀菌素发酵液3L，4000r/min,30min离心得菌丝体，用3L的丙酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理发酵液。2.上柱吸附采用低于50%丙酮含量的预处理后的发酵液上大孔吸附树脂柱YPR-II吸附。3.水洗利用五倍柱体积的去离子水洗去水溶性杂质。4.洗脱溶液的配置及pH值的调节①分别取丙酮及蒸馏水混合配置成的丙酮溶液；②用2N的NaOH分别调节上述所配置的丙酮溶液，得到溶液I(pH为6.5浓度为40%的丙酮溶液)、溶液II(pH为9.0浓度为60%的丙酮溶液)、溶液III(pH为6.5浓度为80y。的丙酮溶液)；(D取三份200ml的蒸馏水，分别用2N的NaOH或HC1调节pH为6.5、9.0、6.5。5.洗脱①用pH6.5的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为6.5，然后用20倍柱体积的溶液I上吸附柱；②用pH9.0的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为9.0，然后用IO倍柱体积的溶液II上吸附柱；③用pH6.5的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为6.5，然后用1倍柱体积的溶液III上吸附柱；④用100%丙酮(不调pH)进行洗脱，每10ml为一个收集单元进行收集，合并洗脱效价较高的收集单元，用于进一步的精制实验。收率68.2%纯度95.3%实施例8:步骤如下1.发酵液预处理取按现有文献得到的多杀菌素发酵液3L，4000r/min，30min离心得菌丝体，用3L的丙酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理发酵液。2.上柱吸附采用低于50%丙酮含量的预处理后的发酵液上大孔吸附树脂柱YPR-II吸附。3.水洗利用五倍柱体积的去离子水洗去水溶性杂质。4.洗脱溶液的配置及pH值的调节①分别取丙酮及蒸馏水混合配置成的丙酮溶液；②用2N的NaOH分别调节上述所配置的丙酮溶液，得到溶液I(pH为7.0浓度为40%的丙酮溶液)、溶液II(pH为9.5浓度为60%的丙酮溶液)、溶液m(pH为7.5浓度为80%的丙酮溶液)；③取三份200ml的蒸馏水，分别用2N的NaOH或HC1调节pH为7.0、9.5、7.5。5.洗脱①用pH7.0的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为7.0，然后用20倍柱体积的溶液I上吸附柱；②用pH9.5的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为9.5，然后用IO倍柱体积的溶液II上吸附柱；③用pH7.5的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为7.5，然后用1倍柱体积的溶液III上吸附柱；用100%丙酮(不调pH)进行洗脱，每10ml为一个收集单元进行收集，合并洗脱效价较高的收集单元，用于进一步的精制实验。收率69.1%纯度96.4%实施例9:步骤如下1.发酵液预处理取按现有文献得到的多杀菌素发酵液3L，4000r/min，30min离心得菌丝体，用3L的丙酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理发酵液。2.上柱吸附采用低于50%丙酮含量的预处理后的发酵液上大孔吸附树脂柱YPR-II吸附。3.水洗利用五倍柱体积的去离子水洗去水溶性杂质。4.洗脱溶液的配置及pH值的调节①分别取丙酮及蒸馏水混合配置成的丙酮溶液；②用2N的NaOH分别调节上述所配置的丙酮溶液，得到溶液I(pH为7.5浓度为40%的丙酮溶液)、溶液II(pH为8.5浓度为60%的丙酮溶液)、溶液III(pH为7.0浓度为80%的丙酮溶液)；(D取三份200ml的蒸馏水，分别用2N的NaOH或HC1调节pH为7.5、8,5、7.0.5.洗脱①用pH7.5的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为7.5，然后用20倍柱体积的溶液I上吸附柱；②用pH8.5的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为8.5，然后用IO倍柱体积的溶液II上吸附柱；③用pH7.0的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为7.0，然后用1倍柱体积的溶液III上吸附柱；④用100%丙酮(不调pH)进行洗脱，每10ml为一个收集单元进行收集，合并洗脱效价较高的收集单元，用于进一步的精制实验。收率69.7%纯度96.8%实施例10步骤如下1.发酵液预处理取多杀菌素发酵液3L，4000r/min，30min离心得菌丝体，用3L的丙酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理发酵液。2.上柱吸附采用低于50%丙酮含量的预处理后的发酵液上大孔吸附树脂柱YPR-II吸附。3.水洗利用五倍柱体积的去离子水洗去水溶性杂质。4.洗脱溶液的配置分别取甲醇及蒸馏水混合配置成的甲醇50%、60%、70%、100%的甲醇溶液。取丙酮及蒸馏水混合配置成的丙酮80%的甲醇溶液。5.洗脱分别依次用50%、60%、70%的甲醇溶液进行上柱洗脱，每个梯度浓度溶液用量分别为柱体积的20倍、15倍、10倍，然后用浓度为80%的丙酮溶液上柱洗脱，用量为柱体积的l倍。最后用纯的甲醇溶液进行洗脱，用量为5倍柱体积，每10ml为一个收集单元进行收集，合并洗脱效价较高的收集单元，用于进一步的精制实验。收率66.9%纯度96.4%实施例11步骤如下1.发酵液预处理取多杀菌素发酵液3L，4000r/min，30min离心得菌丝体，用3L的丙酮浸泡过夜，再次4000r/min，离心30min取上清，即得预处理发酵液。2.上柱吸附采用低于50%丙酮含量的预处理后的发酵液上大孔吸附树脂柱YPR-II吸附。3.水洗利用五倍柱体积的去离子水洗去水溶性杂质。4.洗脱溶液的配置及pH值的调节①分别取丙酮、及蒸馏水混合配置成80%的丙酮溶液。②用2N的NaOH调节上述所配置的丙酮溶液，pH为7.0浓度为80%的丙酮溶液)。③取200ml的蒸馏水，分别用2N的NaOH调节pH为7.0.5.洗脱用pH7.0的蒸馏水200ml冲洗吸附树脂，使待洗脱的吸附树脂pH为7.0，然后用3倍柱体积的pH为7.0浓度为80。/。的丙酮溶液上吸附柱。每10ml为一个收集单元进行收集，合并洗脱效价较高的收集单元，用于进一步的精制实验。收率65.9%纯度96.4%附表仪器和材料<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>执行标准Q/GSX012-2004生产厂家蚌埠市辽源新材料有限公司。权利要求1.粗提多杀菌素的方法，该方法包括将预处理后的多杀菌素发酵液上大孔吸附树脂柱YPR-II吸附的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理后的多杀菌素发酵液按照下列步骤得到取多杀菌素发酵液，离心得菌丝体，用丙酮浸泡过夜，再次离心，所得上清液即为预处理后的发酵液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括用溶剂系统进行洗脱的步骤。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在洗脱步骤中改变溶剂系统的pH值。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在洗脱步骤中改变溶剂系统的浓度。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在洗脱步骤中依次用不同pH值、不同浓度的溶剂系统洗脱。7.根据权利要求3至6任一所述的方法，其特征在于，所述溶剂系统为丙酮或甲醇。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述溶剂系统为丙酮。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当丙酮浓度为40%时，将其pH调整至6.5至7.5。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，当丙酮浓度为40%时，将其pH调整至7.0。11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当丙酮浓度为60%时，将其pH调整至8.5至9.5。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，当丙酮浓度为60%时，将其pH调整至9.0。13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当丙酮浓度为80%时，将其pH调整至6.5至7.5。14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，当丙酮浓度为80%时，将其pH调整至7.0。全文摘要本发明公开一种粗提多杀菌素的方法，该方法包括将预处理后的多杀菌素发酵液上大孔吸附树脂柱YPR-II吸附的步骤。由该方法得到的多杀菌素洗脱液纯度高，色素含量少，收率提高。整个工艺简单，操作方便。文档编号A01P7/00GK101560231SQ20081003612公开日2009年10月21日申请日期2008年4月16日优先权日2008年4月16日发明者李继安,韩丽敏申请人:上海医药工业研究院