专利名称：番茄黄化曲叶病毒病的嫁接接种鉴定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及番茄黄化曲叶病毒病的接种法。
背景技术：
番茄黄化曲叶病毒病是一由烟粉虱(5^^^ ^&d)传播的双生病毒，随 着近年来烟粉虱的大发生，番茄黄化曲叶病毒病成逐年加重趋势。因此， 建立番茄黄化曲叶病毒病接种鉴定方法并对现有的品种或品系进行抗病性 鉴定已经迫在眉睫。
目前，文献H. Delatte, H. Holota, B. Reynaud and J. Dintinger. Characterisation of a quantitative resistance to vector transmission of 7bmato ye〃ovv /ea/ ci/W vz'rus in Z^ycopers/cow _p/mp/we//i/b/z'wAn[J]. European Journal of Plant Pathology (2006) 114:245—253报道了一种采用烟粉虱(5e附Wa to&c/)
接种鉴定法，但是，该方法存在一些明显的缺陷1、受烟粉虱的繁殖生长 季节限制，由于烟粉虱多在夏秋季发生，冬春季烟粉虱很少，所以很难在
冬春季进行烟粉虱接种鉴定。2、受烟粉虱发生地域的限制，由于烟粉虱多
在我国的南方地区发生，因此在北方地区无法籴用烟粉虱接种鉴定发。
发明内容
本发明的目的是提供一种番茄黄化曲叶病毒病的嫁接接种鉴定法，以 克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的方法包括如下步骤 (1)选取感染了黄化曲叶病毒病的番茄作砧木，对待鉴定的材料进行育苗，待两片真叶时，采用斜切接法将其嫁接到感病砧木上，嫁接后的前5
天，保持90 95%的湿度，温度为20 25。C，遮光育苗，嫁接5天以后， 在40 70%的湿度，温度为25 3(TC的条件下正常培养育苗；
对待鉴定的材料进行育苗期间，采用阿克泰防止烟粉虱的侵染； 术语"斜切接法"在文献纪伟锋.番茄嫁接技术[J].西南科技大学学 报.2005.01:68-69.中有详细的描述；
(2)嫁接后的15 40天内，提取接穗的DNA，用PCR法检测接穗中 是否已经含有番茄黄化曲叶病毒病。
所述的PCR法为一种常规的方法，在文献Zhang Yongping,Zhu weimin CuiHuimei.Molecular identification and the complete nucleotide sequence of TYLCV isolate from Shanghai ofChina[J] .Virus Genes,DOI
10.1007/s 11262-008-0226-0.中有详细的报道。
所说的番茄的品种选自2300或2583，可采用市售的产品；
本接种鉴定方法有以下优点-
能保证接种鉴定的准确性，接种鉴定方法简单，可以一年四季或在没 有烟粉虱发生的地区采用嫁接法进行接种鉴定。
图1为实施例1的嫁接15天后提取接穗DNA检测番茄黄化曲叶病毒 病图片。
图2为实施例1的嫁接30天后提取接穗DNA检测番茄黄化曲叶病毒 病图片。
图3为实施例2的嫁接15天后提取接穗DNA检测番茄黄化曲叶病毒 病图片。图4为实施例2的嫁接30天后提取接穗DNA检测番茄黄化曲叶病毒 病图片。
具体实施例方式
实施例1
番茄的品种选自2300。
(1) 选取感染了黄化曲叶病毒病的番茄作砧木，对待鉴定的材料进行 育苗，待两片真叶时，采用斜切接法将其嫁接到感病砧木上，嫁接后的前3 天，保持90%的湿度，温度为2(TC，遮光育苗，嫁接5天以后，在50%的 湿度，温度为25t:的条件下正常培养育苗；
对待鉴定的材料进行育苗期间，采用阿克泰防止烟粉虱的侵染；
(2) 嫁接后的15天，30天，分别提取接穗的DNA，用PCR法检测
接穗中是否已经含有番茄黄化曲叶病毒病；
具体的步骤如下 接穗的DNA提取方法
1. 1.5ml离心管加入离心管盖大小的新鲜叶片2片；
2. 加入液氮，用尖头玻棒轻轻研磨，然后加入250^ilCTAB混合均匀；
3. 65。C水浴lh;
4. 置于4'C冰箱或室温冷却至15'C以下；
5. 加入250^il24:l氯仿/异戊醇，上下混匀5min，保证样品和氯仿充分 混合；
6. 12000rpm离A、10min;
7. 取上清液200pl，加入预先加好200pl异丙醇的1.5ml离心管中，轻轻 上下颠倒混匀；8. 4'C冰箱静置30min以上；
9. 12000rpm离心10min，弃上清液；
10. 吹干DNA，让异丙醇挥发干净；
11. 加入1 OOjil ddH20 (含1 |il 1 Omg/ml的RNase )溶解DNA;
12. 37"C水浴或室温1小时去除RNA。
PCR法检测方法 引物序列
CoPR， 5'〉GA(AGCT)G(GC)AT G(ACT)GT(AG)CA (AGT)GCCATATA〈3'
AV494, 5，〉GCC (CT) AT (AG) TA (CT) AG (AG) AAGCC (AC) AG<3，。
PCR反应条件
10mmol/L dNTP 0.5 [xl， 25mmol/LMgcl2 1.5(il，10*PCR Buffer 2.5(il, COPR和AV494各2.5)al， Taq酶0.2U，力口ddH20使体系为25^il。PCR程序为94" 预变性4min; 94。C变性lmin， 50。C退火45s, 72。C延伸45s， 35个循环；72°C 延伸10min。取PCR产物15[！1，于1.5°/。琼脂糖电泳，观察结果。
图1为嫁接15天后提取接穗DNA检测番茄黄化曲叶病毒病图片； 图2为嫁接30天后提取接穗DNA检测番茄黄化曲叶病毒病图片。 图2为嫁接30天后提取接穗DNA检测番茄黄化曲叶病毒病图片。 结果表明
嫁接15天时仅在部分接穗体内检测到TYLCV病毒，而嫁接30天时， 在接穗中都检测到TYLCV病毒。说明嫁接可以有效的传播番茄黄化曲叶病毒。嫁接后接穗传毒，但接穗表现症状所需的时间相对烟粉虱接种法要长，
嫁接后40天才在所有接穗中观察到病症。
由此可见，采用待鉴定品种作接穗嫁接到感病植株上，嫁接40天后进 行病害调查可以作为番茄黄化曲叶病毒病的接种鉴定方法。
实施例2
番茄的品种选自2583。
1)选取感染了黄化曲叶病毒病的番茄作砧木，对待鉴定的材料进行育 苗，待两片真叶时，采用斜切接法将其嫁接到感病砧木上，嫁接后的前5 天，保持95%的湿度，温度为25'C，遮光育苗，嫁接5天后，在70%的湿 度，温度为3(TC的条件下正常培养育苗；
对待鉴定的材料进行育苗期间，采用阿克泰防止烟粉虱的侵染；
(2)嫁接后的15天，30天，分别提取接穗的DNA，用PCR法检测
接穗中是否已经含有番茄黄化曲叶病毒病；
具体的步骤如下-接穗的DNA提取方法
1、 1.5ml离心管加入离心管盖大小的新鲜叶片l 2片。2、加入液氮，用尖
头玻棒轻轻研磨，然后加入'250plCTAB混合均匀。3、 65。C水浴lh。 4、置
于4t:冰箱或室温冷却至15。C以下。5、加入250^il24:l氯仿/异戊醇，上下混
匀5min，保证样品和氯仿充分混合。6、 12000rpm离心10min。 7、取上清液
20(Hd，加入预先加好200pl异丙醇的1.5ml离心管中，轻轻上下颠倒混匀。8、
4。C冰箱静置30min以上。9、 12000rpm离心10min，弃上清液。10、吹干DNA，
让异丙醇挥发干净。11、加入100nlddH20 (含l)il 10mg/ml的RNase)溶解
DNA。 12、 37"C水浴或室温1小时去除RNA。PCR法检测方法 引物序列
AV494, 5，>GCC (CT) AT (AG) TA (CT) AG (AG) AAGCC (AC) AG<3,。
PCR反应条件10mmol/LdNTP0.5 pJ， 25mmol/LMgcl2 1.5nU0*PCR Buffer 2.5^d,COPR和AV494各2.5^d， Taq酶0.2U，力口ddH20使体系为25pl。 PCR程序为94。C预变性4min; 94。C变性lmin， 5(TC退火45s， 72""C延伸45s， 35个循环；72。C延伸10min。取PCR产物15jxl，于1.5%琼脂糖电泳，观察结果。
图3为嫁接15天后提取接穗DNA检测番茄黄化曲叶病毒病图片。图 4为嫁接30天后提取接穗DNA检测番茄黄化曲叶病毒病图片 结果表明
嫁接15天时仅在部分接穗体内检测到TYLCV病毒，而嫁接30天时， 在接穗中都检测到TYLCV病毒。说明嫁接可以有效的传播番茄黄化曲叶病 毒。嫁接后接穗传毒，但接穗表现症状所需的时间相对烟粉虱接种法要长， 嫁接后40天才在所有接穗中观察到病症。
由此可见，采用待鉴定品种作接穗嫁接到感病植株上，嫁接40天后进 行病害调査可以作为番茄黄化曲叶病毒病的接种鉴定方法。 .
权利要求
1.番茄黄化曲叶病毒病的嫁接接种鉴定法，其特征在于，包括如下步骤(1)选取感染了黄化曲叶病毒病的番茄作砧木，对待鉴定的材料进行育苗，待两片真叶时，采用斜切接法将其嫁接到感病砧木上，嫁接后的前3～5天，保持90～95％的湿度，温度为20～25℃，遮光育苗，嫁接5天以后，在40～70％的湿度，温度为25～30℃的条件下正常培养育苗；(2)嫁接后的15～40天内，提取接穗的DNA，用PCR法检测接穗中是否已经含有番茄黄化曲叶病毒病。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对待鉴定的材料进行育苗期间，采用阿克泰防止烟粉虱的侵染。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所说的番茄的品种选自2300或2583。
全文摘要
本发明提供了一种番茄黄化曲叶病毒病的嫁接接种鉴定法，括如下步骤(1)选取感染了黄化曲叶病毒病的番茄作砧木，对待鉴定的材料进行育苗，待两片真叶时，采用斜切接法将其嫁接到感病番茄砧木上，嫁接后的前3～5天，保持90～95％的湿度，温度为20～25℃，遮光育苗，嫁接5天以后，在40～70％的湿度，温度为25～30℃的条件下正常培养育苗；(2)嫁接后的15～40天内，提取接穗的DNA，用PCR法检测接穗中是否已经含有番茄黄化曲叶病毒病。本发明能保证接种鉴定的准确性，接种鉴定方法简单，可以不受烟粉虱发生时间和地域的限制，可以一年四季或在没有烟粉虱发生的地区采用嫁接法进行接种鉴定。
文档编号A01G1/06GK101560571SQ20081003612
公开日2009年10月21日 申请日期2008年4月16日 优先权日2008年4月16日
发明者万延慧, 力 于, 朱为民, 朱龙英 申请人:上海市农业科学院